Заключение

В ходе проведенного эксперимента по моделированию БА у крыс путем интрацеребрального введения пептида Аβ_1-40 было изучено участие белков кальпаин / кальпастатиновой протеолитической системы в развитии нейропатологии. Об их селективной регуляции в данных условиях судили по уровню протеолитической активности основных форм кальпаинов – μ- и m-кальпаинов. Указанные кальпаины синтезируются во всех тканях и количественно превосходят другие формы фермента (в ЦНС – кальпаины 3, 5, 10) на порядки (Wu et al., 2007). μ-Кальпаин in vitro активируется ионами Ca²⁺ при микромолярных, а m-кальпаин – при миллимолярных концентрациях (Mellgen, 1980).

В мозговой ткани крыс более высокая активность кальпаинов была зарегистрирована в цитозольной фракции (свыше 90% от общей; рис. 1).

Рисунок 1. Удельная активность кальпаинов в коре больших полушарий крыс.

Здесь и на рис. 2 обозначены группы животных: 1 – контроль (ложно-оперированные); 2 – введение пептида Аβ_1-40; 3 – сочетанное введение Аβ_1-40и 17β-эстрадиола.

Вместе с тем, учитывая особую роль мембранных фосфолипидов для активации этих протеиназ (Goll et al., 2003), наиболее важным показателем представляется их активность, ассоциированная с мембранными фракциями (грубой митохондриальной, микросомной, миелиновой), которая составила 9% от общей (рис. 1). Такое распределение пула кальпаинов между растворимой и мембраносвязанной фракциями клетки в разной степени сходно для большинства тканей млекопитающих (Goll et al., 2003; Kolchinskaya, Malysheva, 2004). Мы обнаружили, что в присутствии амилоидогенного пептида кальпаиновая система в коре больших полушарий активируется почти в 2 раза (рис. 1). При этом наблюдается увеличение активности мембраносвязанной фракции кальпаинов до 16% от общего пула. В наших исследованиях (Рендаков и др., 2014) было показано, что уровень общей активности кальпаинов коррелирует с интенсивностью гибели клеток нервной ткани у крыс экспериментальных групп.

Поскольку активность кальпаинов в ткани зависит от интенсивности аутокаталитической реакции (Goll et al.,2003) , с помощью метода казеиновой зимографии было качественно оценено соотношение полноразмерных и аутолизированных μ- и m-кальпаинов. Выраженная активация кальпаинов, особенно m-кальпаина (на зимограмме – белковая полоса с молекулярной массой 120 кДа), и их аутокаталитических фрагментов с молекулярной массой 118 кДа (рис. 2) у животных с экспериментальной БА является наиболее достоверным свидетельством активации кальпаиновой системы in vivo. Характерно, что в целом невысокая активность μ-кальпаина (123 кДа) в нервной ткани, составляющая в норме менее 10% от уровня активности m-кальпаина, почти полностью утрачивается у крыс с экспериментальной нейродегенерацией (рис. 2), что указывает на селективную регуляцию разных форм кальпаина при развитии патологии.

Рисунок 2. Зимограмма с казеином, демонстрирующая активные фракции кальпаинов нервной ткани крыс.

Полоса с молекулярной массой 123 кДа соответствует μ-кальпаину, 120 кДа – m-кальпаину, 118 кДа – зрелым μ- и m-кальпаинам, образовавшимся путем аутолиза. Обозначения номеров дорожек см. в подписи к рис. 1.

Большинство нейропатологий, включая нейродегенерацию, ишемию, травмы мозга, а также нормальное старение, сопряжено с нарушением динамического равновесия внутриклеточного Са²⁺ (Bezprozvanny, 2009). Обычно общее содержание свободного Са²⁺ в цитоплазме поддерживается в диапазоне от 100 нМ до 1 мкМ (в покое и при стимуляции, соответственно). При БА концентрация внутриклеточного Са²⁺ достигает величины сотен мкМ, а локально, например в области Са²⁺-каналов, еще на порядок выше, что достаточно для персистентной активации не только μ-, но и m-кальпаина, которую мы наблюдаем на зимограмме. Обнаруженная нами избирательная активация m-кальпаина, которому требуется нефизиологично высокая концентрация Са²⁺ для активации и аутолиза, по всей видимости, объясняется избытком кальция в цитоплазме и отражает “патологическую” активацию кальпаиновой системы, аналогичную той, что наблюдается при дегенеративных процессах и в других тканях (кардиомиопатии, макулодистрофии, кахексии, миодистрофиях, ототоксичности) (Goll et al.,2003; Немова и др.,2010).

Помимо чувствительности к Са²⁺, изучаемые ферменты различаются субклеточной локализацией: m-кальпаин дисперсно растворен в цитозоле и ассоциирован с мембранами эндоплазматического ретикулума, а μ-кальпаин преимущественно локализован на поверхности везикул аппарата Гольджи и в небольших количествах обнаруживается в митохондриях(Goll et al., 2003; Немова и др., 2010; Hood et al., 2010). Вероятно, это и определяет отмеченные нами различия в отклике ферментов на приток Са²⁺, который, как теперь известно, оказывает специфичные эффекты в зависимости от источника поступления. Концепция избирательности источников дополнительного Са²⁺ для индукции клеточной гибели была выдвинута Майклом Тымянски (Tymianski et al.,1993); позже было показано, что она справедлива и для активации кальпаинов: обратный ток Са²⁺ через Na⁺/Ca²⁺-обменник приводит к активации кальпаинов, а приток Са²⁺ по другим путям, например через потенциал-зависимые Са²⁺-каналы, – нет (Araujo et al., 2007). Преимущественная активация m-кальпаина при изучаемом воздействии, вероятно, объясняется солокализацией ионообменника и m-кальпаина, которая увеличивает вероятность активации последнего.

Полученные результаты согласуются с рядом наблюдений. У пациентов с БА была описана аномальная активация μ-кальпаина, сконцентрированного в синаптических терминалях (Saiti et al., 1993). Избыток активной формы m-кальпаина был обнаружен в посмертных образцах префронтальной коры мозга больных деменцией альцгеймеровского типа, причем во всех специфично поражаемых болезнью зонах мозга пациентов с БА наблюдалось снижение уровня их эндогенного ингибитора, кальпастатина (Saito et al., 1993; Nixon et al., 1994). Активация кальпаинов на фоне дефицита кальпастатина также была выявлена в мозге трансгенных мышей Tg2576, несущих мутантный вариант гена АРР человека (Vaisid et al., 2007).

Следует отметить, что у крыс, которым вводили в мозг β-амилоидный пептид, отмечалось значительное ухудшение результатов поведенческого теста (водного лабиринта Морриса). В аналогичных условиях были отмечены изменения и в других протеолитических путях, например, лизосомальной аутофагии (Рендаков и др., 2014).