Заняття 13.

Тема: Серологічні реакції з мітками.

Актуальність. У всіх областях сучасної медицини використовується імунний аналіз, переважно, з діагностичною та аналітичної цілями. Використання діагностичних препаратів,мічених флюоресцентними барвниками, ферментами, радіоактивними мітками дозволяє значно підвищити чутливість реакцій і ідентифікувати біологічні компоненти (гормони, ферменти, нейропептиди, продукти імунної системи, антигени і т.д.) в низьких і дуже низьких концентраціях. Всі продукти, проти яких можливе отримання антитіл, виявляються цими методами. Знання основ імунологічної трансплантології дуже важливе для підбору трансплантантів та попередження процесів їх відторгнення.

Мета і завдання. Ознайомлення з принципами реакцій, технікою їх постановки та можливостями методів імуноферментного аналізу, імунолюмінесцентного аналізу, радіоімунного аналізу, полімеразної ланцюгової реакції, комплексу гістосумісності та основ трансплантології.

Практичні навики.

1.Вибрати препарати та скласти схему постановки прямої та непрямої реакції імунофлуоресценції

2. Дослідити препарат з використанням прямого методу люмінесцентної мікроскопії, виявити люмінесцентні комплекси антигенів з міченими антитілами

3. Вибрати компоненти реакції, скласти схему етапів постановки твердофазного ІФА

4. Поставити модельну реакцію та провести облік непрямої реакції ІФА.

Контрольні питання.

1. З якою метою і які мітки використовують в прикладній імунології?

2. Переваги реакцій з міченими сироватками над класичними. Можливість застосування їх для експрес-діагностики.

3. Принцип реакції імунофлуоресценції (РІФ).

4. Одержання антивидових мічених імуноглобулінів. Застосування їх для РІФ.

5. Імуноферментний аналіз. Інгредієнти для постановки прямого та непрямого ІФА.

6. Твердофазний ІФА та імуноблотінг.

7. Принцип постановки реакцій радіоімунного аналізу (конкурентний тип реакції, пряма та зворотня РІА).

8. Імунна електронна мікроскопія

9. Полімеразна ланцюгова реакція.

Тестові завдання.

1.Для одержання мічених антитіл використовують маркери:

A. Флуорохром

B. Альбумін

C. Ферритин

D. Латекс

E. Бактеріофаг

2. Для діагностики багатьох інфекційних захворювань існують діагностичні тест- системи для постановки ІФА. Виберіть компоненти, необхідні для ІФА з метою виявлення антитіл у сироватці хворого.

A. Антиген на твердій фазі, сироватка хворого, мічена ензимом антиглобулінова сироватка, субстрат

B. Сироватка хворого на твердій фазі, антиген, субстрат

C. Сироватка хворого, специфічний антиген, антиглобулінова сироватка, ензим, субстрат

D. Антиген, специфічна сироватка, ензим, субстрат

E. Сироватка хворого, специфічна сироватка з ензимом, субстрат

3. Виберіть компонент, необхідний для реакції імунофлуоресценції (виявлення бактерій у мазку прямим методом)

A.Сироватка хворого

B. Люмінесцентна сироватка проти імуноглобулінів людини

С.Стандартний антиген

D. Мічена антибактеріальна сироватка

E. Мічений анти видовий імуноглобулін

4. Який з названих препаратів необхідний для виявлення антигену, адсорбованого на твердій фазі методом ІФА?

A. Мічена сироватка проти глобулінів людини

B. Досліджувана сироватка, що містить антитіла

C. Комплемент

D. Cпецифічна мічена сироватка

Е.Стандартний антиген

5. Об’єктом розпізнавання для антигенрозпізнавального рецептора Т4-лімфоцита є:

А. Антиген чужерідний

B. МНС-II

C. Комплекс МНС-I з антигеном

D. Комплекс МНС-II з антигеном

E. МНС-I

Приклад тестів «Крок 1».

1.Під час спалаху гострої респіраторної інфекції з метою встановлення діагнозу грипу проводиться експрес-діагностика, яка ґрунтується на виявленні специфічного вірусного антигену в досліджуваному матеріалі (змив з носоглотки). Яку реакцію використовують для цього?

А. Преципітації

В.* Імунофлюоресценції

С. Опсонізації

D. Зв’язування комплементу

Е. Аглютинації

2.При багатьох інфекційних хворобах у крові хворого можна виявити антигени збудника. Яку реакцію слід застосувати, враховуючи, що рівень антигенемії низький?

A. *Твердофазний ІФА

B. Реакцію аглютинації

C. Реакцію непрямої гемаглютинації

D. Реакцію латекс-аглютинації

E. Імуноелектрофорез

3. Істотним недоліком мікроскопічного методу діагностики інфекцій є його недостатня інформативність у зв’язку з морфологічною подібністю багатьох видів мікроорганізмів. Яка імунологічна реакція дозволяє значно підвищити інформативність цього методу?

A. *Реакція імунофлюоресценції

B. Реакція Кумбса

C. Імуноферментний аналіз

D. Реакція опсонізації

E. Радіоімунний аналіз

4. При проведенні лабораторної діагностики гепатиту В в останні роки визначають наявність вірусної ДНК в крові хворого. За допомогою якої із перелічених реакцій встановлюють це?

A. * Ланцюгової полімеразної реакції.

B. Реакція непрямої гемаглютинації.

C. Реакція зв'язування комплементу

D. Імуноферментний аналіз

E. Реакція гальмування гемаглютинації

Ситуаційна задача.

У хворого за ходом міжреберних нервів з’явилася пухирцева висипка у вигляді обруча, з больовим синдромом. А. Яке дослідження найбільш ефективне для експрес-діагностики антигену у клітинах? В. Яке обладнання та які компоненти необхідні для постановки цієї реакції?C. За якими ознаками оцінюється результат реакції?

Зміст і хід заняття:

Робота 1. Облік реакції імунолюмінесценції.

Принцип реакції передбачає використання антитіл, молекули яких зв’язані з люмінесцентним барвником (мічені або позначені антитіла, мічені сироватки). Такі антитіла зв’язуються з антигенами, наприклад із антигенами на поверхні бактеріальної клітини і така клітина буде світитися при дослідженні в люмінесцентному мікроскопі (антитіла, які не зв’язалися з відповідними антигенами, відмиваються під час обробки мазка).

Хід роботи: Препарат-відбиток з лімфатичного вузла тваринки, що загинула від експериментальної інфекції обробили люмінесцентною сироваткою проти збудника хвороби. Після промивання і висушування препарат досліджують за допомогою люмінесцентного мікроскопу. Мікроскопічна картина: на блакитно-зеленому фоні препарату видно яскраво-зелені паличкоподібні бактерії, які світяться завдяки тому, що на їхній поверхні мічені люмінесцентні антитіла специфічно зв’язались з антигенами бактеріальної клітини. Замалювати препарат, скласти схему реакції.

Практичне значення. Реакцію прямої імунофлюоресценції використовують для вивчення клітинних антигенів, виявлення вірусу в заражених клітинах та бактерій і рикетсій в мазках. Так, для діагностики сказу, відбитки кусочків мозку тварин, підозрюваних на вірусоносійство, обробляють люмінесцентною антирабічною сироваткою. При позитивному результаті в цитоплазмі нервових клітин виявляються комплекси яскраво-зеленого кольору. На виявленні антигенів вірусів в клітинах відбитків зі слизової оболонки носа заснована експрес-діагностика грипу, парагрипу і аденовірусної інфекції.

Робота 2. Імуноферментний метод (ІФА).

Принцип методу. Антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв’язаний з ензимом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена з антитілом з мобілізованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші Для такої мітки широко використовується фермент – пероксидаза хрону, яка в залежності від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи. Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н₂О₂ і 5-аміносаліцилову кислоту). Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з антитілами, утворюючи комплекс антиген – антитіло, після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ензимом, зумовлює появу відповідного забарвлення.

Хід роботи: Виявити антигени збудника в досліджуваному матеріалі за допомогою реакції ІФА. На дні і стінках лунок полістиролового планшету адсорбовані специфічні антитіла. У лунки вносять декілька зразків досліджуваних матеріалів, у яких виявляють антиген. Після 30-ти хвилинної інкубації в термостаті лунки промити промивним розчином і внести кон’югат - антитіла, з’єднані з пероксидазою. Після 30-ти хвилинної інкубації знову промити лунки і внести суміш пероксиду водню і хромогену. Після 30-ти хвилинного витримування в термостаті реакцію зупиняють стоп-реагентом і відмічають номери зразків, у яких виявлено антиген (зміна кольору хромогена).

Робота 3. Виявлення антитіл у сироватках в реакції ІФА.

Хід роботи: У лунках планшету для ІФА адсорбований стандартний антиген. У лунки внесли зразки досліджуваних сироваток, а після інкубації та промивання - кон’югат (мічені пероксидазою антитіла проти імуноглобулінів людини). Після повторної інкубації та промивання внесено субстрат і хромоген. Відмітити, у яких зразках сироваток виявлено специфічні антитіла. Скласти схему реакції.

Практичне значення. Сучасні методи імунологічних досліджень при інфекційних хворобах дають можливість безпосереднього виявлення антигенів збудника, виявлення антитіл окремих класів - IgG, IgM, IgA. Експрес-методи характеризуються достатньо високою специфічністю, швидкістю виконання.

Робота 4. Полімеразна ланцюгова реакція.

Принцип реакції - синтез копій досліджуваного гена в спеціальних автоматичних приладах - ампліфікаторах. Основою тест-системи в ПЛР є праймери - синтетичні олігонуклеотиди, комплементарні до певної ділянки гена, що виявляється і фермент ДНК-полімераза. Система також містить нуклеотиди, з яких синтезуються копії гену. Цикл ПЛР складається з послідовних процесів синтезу і плавлення (розкручування ниток ДНК). Під час синтезу праймер приєднується до комплементарної ділянки ДНК-гена, який копіюється (ампліфікація), утворюючи двоспіральну структуру. З цієї двоспіральної ділянки ДНК-полімераза започатковує синтез копії гена. При нагріванні ця новосинтезована ДНК розкручується на 2 нитки, які в свою чергу, знову копіюються при охолодженні з утворенням чотирьох ниток. Після 30-40 циклів ген копіюється в достатніх кількостях і виявляється в реакції молекулярної гібридизації. Для цього одноланцюговий зонд (короткий фрагмент нитки ДНК) мітиться ферментом, ізотопом або іншою міткою. Отримані ДНК денатуруються (т.т. розділяються на поодинокі нитки). Після інкубації зонда з досліджуваним зразком вимірюють кількість поміченої ДНК, яка зв’язалась (вступила в гібридизацію) з нуклеїновими кислотами досліджуваної ДНК.

Хід роботи: Скласти схему полімеразної ланцюгової реакції, вказати її призначення і область застосування.

Практичне значення. За результатами цієї реакції можна підтвердити діагноз інфекційної хвороби ще до появи антитіл, це особливо важливо щодо збудників, яких неможливо виділити з організму або вони виділяються з труднощами (вірусні інфекції).

Складання протоколів. Описати хід постановки і результати реакції імунолюмінесценції (1), імуноферментного аналізу (2, 3), скласти схему полімеразної ланцюгової реакції (4).

Література.

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М., 2005. – C. 217-222, 314-320, 323-325.

2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология

и иммунология.-М., 2008.-С.289-294.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. Київ, Медицина, 2009. – С.185-186, 327-328.

4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П.Практична мікробіологія: Посібник .Тернопіль.-Укрмедкнита. 2004,-С.145-149.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – С.-П., 2002. – С. 187-191, 236-237.

6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.288-293.

7. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.21-25, 50, 61.