Алексеева, Бруснигина (2014)_МПС

2008 году и финансируется из средств Еврокомиссии. Консорциум HMP основан в 2007 году как инициатива National Institute of Health (NIH, США) [38, 45, 64, 70]. В России такое объединение появилось в 2009 году под названием «Русский метагеномный проект». В настоящее время в нем участвуют 14 организаций [71]. Исследования микробиома человека во всем мире координируются главным международным объединением – International Human Microbiome Consortium (www.human-microbiome. org).

2.1.1. Секвенирование фрагментов ДНК, кодирующих эволюционно консервативные гены

При изучении видового состава сообществ микроорганизмов используются универсальные праймеры, специфичные в отношении эволюционно консервативных участков геномной ДНК. Консервативные участки геномной ДНК, имеющиеся у всех микроорганизмов, называются маркерами. Определение нуклеотидной последовательности такого участка позволяет установить, геному какого микроорганизма он принадлежит. В метагеномных исследованиях сообществ микроорганизмов, присутствующих в образце (субстрате), наиболее широкое применение получил подход, основанный на сравнении нуклеотидных последовательностей гена, ответственного за синтез малой субъединицы 16S рибосомальной РНК (16S рРНК). Последовательность гена 16S pРНК состоит из 9 гипервариабельных регионов, перемежающихся консервативными последовательностями (рис 8).

Первоначально для таксономической классификации бактерий определялась последовательность отдельных гипервариабельных регионов (а не всего гена) [72]. Однако в последние 2–3 года для определения состава сообщества исследователи стали использовать полную последовательность гена 16S рРНК. Это связано, в первую очередь, со способностью платформ NGS осуществлять

более длинные чтения [45, 70]. До появления платформ NGS амплифицированные с помощью универсальных праймеров фрагменты гена 16S pРНК клонировали в E. coli, определение нуклеотидных последовательностей проводили на платформах, использующих метод Сэнгера. При применении технологии NGS этап клонирования исключается, секвенируются непосредственно амплифицированные фрагменты, причем одновременно из десятков образцов биологического материала. Процесс секвенирования занимает от нескольких часов до нескольких дней в зависимости от типа платформы и объема исследований. На платформах, использующих метод Сэнгера, метагеномные исследования выполнялись бы в течение нескольких недель или даже месяцев [45]. Последовательность гена 16S pРНК и его гипервариабельных регионов уже определена у значительного числа бактерий и доступна в базах данных Greengenes, Ribosomal Database Project (RDP), SILVA [64, 70]. Данный подход широко используют в многочисленных исследованиях [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79], посвященных характеристике микробиомов различных биотопов тела человека: пишеварительного тракта, урогенитального тракта, верхних и нижних дыхательных путей, ротовой полости, кожи (таблица 3), а также в изучении микробиоты при различных заболеваниях (таблица 4).

Накопленная информация о нуклеотидных последовательностях гена 16S рРНК бактерий, характерных для определенного биотопа тела человека, позволила сформировать отдельные базы данных. Например, база данных нуклеотидных последовательностей для представителей вагинального микробиома – Vaginal 16S rDNA Reference Database (http://vmc.vcu.edu/downloads.html) [36]; представителей микробиома полости рта можно найти в базе данных Human Oral Microbiome Database (http://www.homd.org/) [80].

который используется для идентификации и дифференциации микроорганизмов, в частности, стафилококков [85], бифидобактерий [86], лактобацилл [87]. Другие консервативные гены, такие как recA или radA, и гены, кодирующие белок теплового шока 70, факторы элонгации Tu или G, также могут быть использованы в качестве маркеров для филогенетического анализа микроорганизмов [63].

2.1.2. Секвенирование метагеномной ДНК/РНК путем ее случайного фрагментирования

Основное преимущество метагеномных исследований, основанных на секвенировании суммарной ДНК/РНК исследуемого образца, заключается в возможности выявления широкого спектра микроорганизмов: бактерий, вирусов, грибов и простейших [18, 39, 63, 88]. Внедрение данного метода связано с появлением платформ NGS. Отсутствие этапа предварительной амплификации снижает процент ошибок [67, 88]. Общая ДНК/РНК фрагментируется ферментативно, а затем определяется нуклеотидная последовательность всех полученных фрагментов одновременно. Данный подход позволяет не только дать характеристику структуры сообщества, находящегося в образце, но также провести анализ метаболических и филогенетических взаимосвязей (рис. 9).

Секвенирование метагеномной ДНК/РНК также успешно применяется для характеристики микробиома человека, в частности, его вирусного компонента – вирома [88]. Примеры изучения микробиома и вирома человека с использованием различных платформ NGS представлены в таблице 5.

Для идентификации вирусов, в отличие от бактерий, не существует консервативной нуклеотидной последовательности, которая была бы подходящей для амплификации различных вирусных геномов, и методов подготовки образцов, используемых для вирусных частиц. Для выделения и очистки вирусных нуклеиновых кислот использу-

ется несколько подходов [88]. Наиболее распространенным является центрифугирование в градиенте плотности хлорида цезия (CsCl), который позволяет отделить мелкие вирусоподобные частицы от бактериальных клеток и клеток человека [90]. Также может быть использован метод простой фильтрации с последующим удалением нуклеиновых кислот бактерий и человека нуклеазами, при этом вирусные нуклеиновые кислоты сохраняются внутри вириона [91].

Для изучения РНК-содержащих вирусов проводят обратную транскрипцию и синтезируют комплементарную ДНК, используемую для дальнейшего анализа.

2.1.3. Метагеномный подход в диагностике инфекционных заболеваний

Внастоящее время все большее значение придается использованию метагеномного подхода в этиологической диагностике инфекционных заболеваний [3, 25, 63, 67]. Метагеномный подход с использованием технологий NGS позволяет проводить прямую детекцию ранее неизвестных вирусов или бактерий, как патогенных, так и условнопатогенных, а также получать молекулярно-генетическую характеристику инфекционных агентов в исследуемых образцах [23, 26, 67].

Вработах зарубежных исследователей уже представлены данные об успешном использовании платформ NGS для выявления ранее неизвестных инфекционных агентов. Так, впервые технологии NGS были использованы при расследовании причин смерти трех лихорадящих больных, скончавшихся через несколько недель после трансплантации органов от одного донора в Австралии [24]. Проведенные традиционные микробиологические и молекулярно-генетические исследования на широкий круг инфекционных агентов оказались неинформативными. Дальнейшее расследование данного случая проводилось с использованием платформы NGS 454 GS FLX

(Life Science/Roche), позволившей выявить последовательности, принадлежавшие аренавирусам. Дополнительный анализ установил, что возбудителем инфекции являлся новый штамм аренавируса, близкий к вирусу лимфатического хориоменингита (LCMV). Дальнейшие серологические и иммуногистохимические анализы показали, что вирусом были контаминированы трансплантируемые органы [24]. Платформа 454 GS FLX использовалась в расследовании вспышки геморрагической лихорадки у пяти жителей Замбии (Южная Африка)

зец) и коронавирус человека HCoV-HKU1 (1 образец), в одном образце кала кроме норовируса – эндогенный ретровирус HCML-ARV. При использовании диагностического подхода, основанного на обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), случаи смешанного инфицирования другими вирусными агентами не были зарегистрированы [23]. Полиомавирус WU регулярно выявляется в образцах из респираторного тракта при остром воспалении нижних дыхательных путей, однако его патогенетическая роль остается неясной [93].

Инфекционный агент также не был установлен. В результате секвенирования была получена полная нуклеотидная последовательность нового вида аренавируса, названного вирусом Lujo [27].

С использованием платформы NGS 454 GS FLX удалось определить нового возбудителя энцефалита у пятнадцатилетнего мальчика с a-гаммаглобулинемией (США). Им оказался астровирус, предварительно названный Human astrovirus Puget Sound (HAstV-PS), отличный от известных астровирусов человека. Филогенетический анализ показал, что HAstV-PS является близкородственным по отношению к астровирусам, выделенным у летучих мышей, баранов и норок. Ранее астровирусы не рассматривались в качестве возбудителей энцефалитов [29].

Следующим положительным моментом применения платформ NGS в метагеномных исследованиях является возможность установления случаев ко-инфицирования патогенами, для выявления которых отсутствуют коммерческие ПЦР тест-системы. Например, J. Yang et al. (2011) использовали платформу GAII (Illumina/Solexa) для анализа образцов смывов со слизистой носоглотки у 16 детей с острыми воспалительными заболеваниями нижних дыхательных путей [92]. Результаты, полученные методом секвенирования ДНК/РНК и традиционных ПЦР и ОТ-ПЦР, оказались идентичными. Были обнаружены следующие вирусные агенты: human adenovirus (HAdV; 3/16), human respiratory syncytial virus (HRSV; 5/16), human rhinovirus (HRV; 5/16), influenza virus (IFV; 2/16), parainfluenza virus (PIV; 1/16), human bocavirus (HBoV; 1/16), и human enterovirus (HEV; 1/16). Однако в одном образце методом ПЦР не удалось обнаружить наличие ассоциации вируса HEV с вирусом HRV [92]. Аналогичные результаты были продемонстрированы в исследовании S. Nakamura et al. (2009), в котором использовалась платформа 454 GS FLX для анализа образцов, взятых со слизистой носоглотки (3 человека) и образцов кала (5 человек), собранных у детей во время сезонной вспышки гриппа и норовирусной инфекции [23]. В результате секвенирования в двух образцах аспиратов помимо вируса гриппа были обнаружены также полиомавирус WU (Washington University) (1 обра-

образце слизистых выделений носоглотки у больных внебольничной пневмонией [94].

Метагеномные исследования с использованием платформ NGS позволяют выявлять высоко дивергентные вирусы. В частности, A.L. Greninger et al. (2010) провели ретроспективное исследование с использованием платформы GA IIX (Illumina) 17 образцов смывов со слизистой носоглотки, собранных у пациентов во время вспышки гриппа в 2009 году в Северной Америке (Мексика, Канада, США) [28]. В результате во всех образцах были определены последовательности, относящиеся к новому варианту вируса – H1N1. Использование платформы GAIIX (Illumina) позволило провести сборку de novo почти полных последовательностей от 2 до 8 сегментов генома нового варианта вируса гриппа 2009 H1N1. Наблюдалась линейная зависимость между процентом полученных выровненных последовательностей, относящихся к вирусу гриппа H1N1, и титром вируса, определенным с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. При использовании ДНК-чипа (Virochip) в двух образцах из 17 детекцию вируса H1N1 провести не удалось, так как содержание вируса было ниже аналитической чувствительности тест-системы [28].

Метагеномное секвенирование на платформах NGS позволяет установить наличие не только возбудителя вирусной инфекции (например вирус гриппа), но и бактерий, которые, с одной стороны, являются представителями нормальной микрофлоры, в частности, респираторного тракта (Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis), а c другой стороны, ассоциированы с воспалительными заболеваниями и могут быть причиной развития осложнений (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae) [95].

В целом использование платформ NGS для диагностики инфекционных заболеваний на настоящий момент все еще остается достаточно дорогим удовольствием, что, безусловно, является серьезным ограничением для применения их в практическом здравоохранении. Однако платформы NGS представляют собой мощный инструмент для открытия новых вирусов и бактерий. Метагеномные исследования позволяют изучать динамические изменения

микробиоты при различных инфекциях, а также определить роль присутствующих совместно патогенов в развитии инфекционного заболевания. Платформы NGS могут быть использованы как для создания новых, так и для усовершенствования существующих ПЦР тест-систем, позволяющих выявить широкий спектр бактериальных и вирусных патогенов – возбудителей актуальных инфекционных заболеваний.

2.3. Полногеномное секвенирование в системе эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями

Технологический уровень, чувствительность и специфичность, информативность и доступность методов идентификации и изучения возбудителей, оценка их вирулентности, средств и способов преобразования патогенов в условиях спорадических и эпидемических процессов определяют эффективность эпидемиологического надзора и его составляющих – мониторинга инфекций и их возбудителей, учета всего спектра заболеваний, иммунитета популяций и коллективов, определения поражаемых контингентов, специфической профилактики заболеваний [6, 7].

Прогресс в изучении полногеномных последовательностей большого числа патогенов, особенностей генов и организации генома, факторов патогенности, систем регуляции транскрипции генов и экспрессии белков открыл новые возможности для фундаментальной микробиологии, вирусологии и эпидемиологии для создания информативных и прецизионных технологий и методов в интересах детальной характеристики возбудителей инфекций [7].

Детекция и оценка генетического разнообразия штаммов возбудителей инфекционных заболеваний имеет большое значение для решения ряда эпидемиологических задач, которые заключаются в установлении степени генетической однородности/неоднородности штаммов, выделенных при локальной вспышке инфекционного заболевания, что характеризует популяцию возбудителя, а также в определении степени родства штаммов, выделенных в различных географических областях и в разное время, в установлении механизмов формирования популяций патогенов в различные периоды эпидемического процесса [9, 19, 20, 96].

Характеристика геномного полиморфизма возбудителей ряда инфекций (вирусные гепатиты, хеликобактериоз, микобактериозы) позволяет прогнозировать течение и исход заболевания, способствовать более адекватному подбору этиотропных средств и схемы лечения [5, 6, 97].

В настоящее время наблюдается рост заболеваемости вакциноуправляемыми инфекциями, в частности, коклюшем, что связано с изменением фенотипических и генетических свойств возбудителя. Мониторинг генетической

изменчивости возбудителей инфекционных заболеваний способствует созданию новых и усовершенствованию существующих вакцинных препаратов, в которых должны учитываться генетические особенности популяции циркулирующего возбудителя [4, 8].

Вбольшинстве стран Америки и Европы, в Австралии и

внекоторых странах Азии и Африки подобные исследования выполняются службами центров по контролю над заболеваниями и их предупреждению: США/Канада (CDC

– www.cdc.gov), Европейские центры (ECDC – www.ecdc. europa.eu), Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ – www.who.int). На передний план выходят апробированные наукой методы, подходы и технологии генотипирования, основанные на ПЦР, гибридизации, а также секвенировании нуклеиновых кислот. К числу наиболее информативных относятся следующие:

• различные варианты полимеразной цепной реакции на маркерные гены и их аллели;

• дифференцировка штаммов патогенов по ДНК мигрирующих генетических элементов (плазмид, транспозонов, IS-элементов, островов патогенности) и ассоциированных с ними генов;

• дифференцировка генетически модифицированных вариантов патогенов по ДНК умеренных фагов (профагов) и трансдуцируемых (или конвертируемых) ими генов;

• электрофорез рестрикционных фрагментов ДНК в пульсирующем электрическом поле (PFGE);

• мультилокусный анализ генов жизнеобеспечения («house-keeping»)штаммовпатогенов(Multilocussequence typing – MLST);

• мультилокусный анализ участков генома с вариабельным числом тандемных повторов (Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis – MLVA);

• полногеномное секвенирование (Whole-genome sequencing – WGS)

Приведенный перечень подходов не является исчерпывающим, но указанные в нем технологии стандартизованы в отношении большинства патогенов и применяются с целью определения региональных, годовых и сезонных колебаний в распределении циркулирующих генотипов патогенных микробов, а также для выявления генетически новых клонов и прогнозирования появления эпидемически актуальных штаммов бактерий [5, 6, 7, 9, 67, 98].

Особого внимания заслуживают методы, основанные на секвенировании: MLST, MLVA, WGS.

Воснове MLST лежит секвенирование нескольких консервативных генов (5–10) с целью обнаружения аллельных вариантов и построения аллельного профиля (MLST или ST-типа) изучаемых штаммов. Данный подход широко используется для выявления различий между штаммами

бактерий, относящихся к одному виду [7, 67]. Алгоритм мультилокусного секвенирования основан на анализе нуклеотидных последовательностей генов жизнеобеспечения («house-keeping»), кодирующих, в основном, синтез различных ферментов. Данные гены являются маркерными для конкретного вида возбудителя [7, 96, 99, 100].

Впервые данный метод был применен для типирования штаммов Neisseria meningitidis [96]. В настоящее время MLST используется также для типирования широкого круга других патогенов: Vibrio cholerae [1], Bordetella pertusis [4], Yersinia pestis [101] и др. По результатам MLST строятся дендрограммы, которые характеризуют эволюционные связи между штаммами [1, 4, 7, 101].

MLST-профили штаммов различных микроорганизмов включены в базы данных (http://pubmlst.org/databases. shtml), в которых также находится информация о времени и месте изоляции штамма, о его серотипе, хозяине или эконише, о клиническом профиле и лекарственной устойчивости (метаданные) [102]. Однако метод MLST не позволяет выявлять различия у одноклональных вариантов, штаммов с низким уровнем разнообразия «house-keeping» генов, у близкородственных штаммов бактерий. В таких случаях для субтипирования штаммов используют MLVA и WGS [67, 100].

MLVA основан на анализе локусов с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR– variable-number tandemrepeats). Последние представляют собой повторяющиеся последовательности длиной 2–20 нуклеотидов, организованных в тандемы. VNTR являются важным маркером полиморфизма генов, используемым для типирования близкородственных штаммов. MLVA позволяет оценить размер VNTR путем амплификации с помощью праймеров к фланкирующим консервативным последовательностям. Данный подход применен для типирования V. cholerae, Y. pestis [20], B. anthracis [103]. Показана высокая дискриминирующая способность VNTR-тестирования для установления источника происхождения штаммов и определения их ландшафтно-географической принадлежности, в частности, клонов V. cholerae и Y. pestis [20], E. coli [104]. В работе Н. van Cuyck et al. (2012) было проведено сравнение возможностей MLST и MLVA для генотипирования на примере S. pneumoniаe. Показано, что MLVA позволяет выявить субварианты среди штаммов, принадлежащих к одному MLST-типу [98].

При генотипировании вирусов для выявления точечных мутаций (SNP) используют несколько (в основном 1–2) специфичных для каждого вируса участков генома. Например, для типирования путем секвенирования вируса Эпштейн-Барр анализируется нуклеотидная последовательность гена LMP1, кодирующего латентный мембранный белок 1-го типа [105]; для цитомегаловируса – гены UL55 и UL73, кодирующие гликопротеины gB и gN соот-

ветственно [106]; для вируса гепатита В – нуклеотидная последовательность фрагмента гена полимеразы, содержащего YMDD-мотив [19]; для вируса гриппа – гены нейраминидазы и гемагглютинина [7]; для ВИЧ – гены gag, env, pol [107]; для вируса Varicella-Zoster– гены ORF21, ORF22 и ORF50 [108] и т. д.

Применение платформ NGS для генотипирования методом MLST позволяет получать достоверные результаты, при этом существенно сокращается время, затрачиваемое на получение и анализ результатов. S.A. Boers et al. 2012 использовали платформу 454 GS Junior (Roche) для типирования 575 штаммов различных бактерий: Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Streptococcus pneumoniae [99]. Объектом секвенирования являлись ампликоны определенных генов, используемых для типирования методом MLST. Платформа позволяла проводить одновременное исследование 96 изолятов, каждый из которых был промаркирован отдельным индексом. Результаты секвенирования с использованием 454 GS Junior (Roche) совпали с секвенированием по методу Сэнгера. Было выявлено 12 новых аллельных вариантов: шесть у S. aureus, пять у P. aeruginosa

иодин у S. pneumoniae [99].

Все описанные выше методы позволяют проанализиро-

вать лишь небольшую часть генома возбудителя, и только полногеномное секвенирование (WGS) дает исчерпывающую информацию об особенностях генов и структуре всего генома. На основании последней можно судить об организации систем регуляции транскрипции генов и экспрессии белков, наличии факторов патогенности, генов устойчивости к антибиотикам и противовирусным препаратам [7, 9, 10, 21, 67].

В зарубежной литературе активно обсуждается вопрос применения метода WGS на платформах NGS для генотипирования штаммов микроорганизмов на основании информации о нуклеотидных последовательностях генов, используемых для создания MLST-профиля, и хранящейся в открытых базах данных. Преимуществом WGS являются отсутствие этапа амплификации специфичного фрагмента ДНК и возможность получения информации о полных геномах микроорганизмов, находящихся в образце. WGS, как и метагеномное секвенирование, включает в себя этап случайной фрагментации генома, отдельные фрагменты ДНК секвенируются, полученные нуклеотидные последовательности затем выравниваются и объединяются. Разработано несколько программ, использующих метод мультилокусного секвенирования для генотипирования на основании данных, полученных в результате WGS на платформах NGS: программа Bacterial Isolate Genome Sequence Database (http://pubmlst.org/software/ database/bigsdb/) [109], сервер www.cbs.dtu.dk/services/

MLST [110], программа Short read sequence typing (http:// srst.sourceforge.net) [102].

С появлением платформ NGS открываются новые перспективы в изучении полногеномных последовательностей большого числа патогенов, в создании информационных технологий и методов молекулярно-генетической характеристики возбудителей инфекционных заболеваний, позволяющих решать как фундаментальные, так и практические задачи эпидемиологии [7].

WGS используется при проведении эпидемиологических расследований вспышек различных инфекционных заболеваний. Так, платформа NGS была успешно применена при эпидемиологическом расследовании вспышек холеры на Гаити и диареи с гемолитико-уремическим синдромом, вызванной новым штаммом E. coli серотипа O104:H4, в Германии и Франции в 2011 году [23, 32].

Эпидемиологическое расследование вспышки холеры на Гаити вызвало дискуссию относительно источника инфекции. В связи с чем N.A. Hasan et al. (2012) провели WGS на платформе HiSeq 2000 (Illumina) 76 изолятов V. cholera, выделенных от больных и из объектов окружающей среды на Гаити и 8 референсных изолятов из других областей [23]. Было выявлено наличие двух штаммов V. cholerae O1 (47 изолятов) и V. cholerae non-O1/O139 (29 изолятов). Филогенетический анализ полных нуклеотидных последовательностей штаммов V. cholerae O1 показал, что популяции имеют клональное происхождение и являются схожими с изолятами из Южной Азии и Африки. Геномная структура популяций V. cholerae non-O1/O139 является очень схожей с таковой токсигенного V. cholerae O1, циркулирующего в западном полушарии. Таким образом, на основании результатов WGS на платформе NGS удалось получить достоверную эпидемиологическую картину вспышки холеры [23].

Традиционными методами молекулярной эпидемиологии (наличие генов вирулентности, серотипирование, MLST, импульсный гель-электрофорез, определение чувствительности к антибиотикам) была определена идентичность изолятов E. coli, выделенных во время вспышки в Германии и Франции. Однако в исследованиях, проведенных Y.H. Grad et al. (2012) с использованием метода WGS на платформах NGS HiSeq2000 (Illumina), 454 GS FLX Titanium (Roche), было показано, что у изолятов, собранных во время вспышки в Германии, имеется низкий уровень полиморфизма (2 SNP), в то время как у изолятов, собранных во Франции, – более высокий уровень полиморфизма (19 SNP) [32]. Достоверность результатов проверялась с использованием платформы третьего поколения PacBio-RS (Pacific Biosciences) и платформы ABI 3730 (Applied Biosystems), использующей метод Сэнгера. Филогенетический анализ позволил установить наличие

единого предка (origin-штамм) у французких и немецких изолятов E. coli [32].

Метод WGS на платформе NGS GAII (Illumina) был использован J.L. Gardy et al. (2011) для анализа 32 изолятов M. tuberculosis, выделенных во время вспышки туберкуле- зав2006–2008гг.,произошедшейвБританскойКолумбии (Канада), в сравнении с 4 историческими изолятами [21]. Анализ VNTR штаммов микобактерий показал, что вспышка была вызвана одним клоном M. tuberculosis, имеющим VNTR-генотип. В результате WGS было обнаружено 204 SNP, иерархичная кластеризация которых с помощью методов maximum likelihood и Bayesian Markov chain Monte Carlo позволила выявить наличие двух отдельных линий M. tuberculosis, имеющих общего предка, которые ко-циркулировали в популяции и одновременно вызвали две вспышки [21].

Таким образом, полногеномное секвенирование дает полную информацию о генетической структуре популяций возбудителей инфекционных заболеваний и позволяет выявить наличие генетической неоднородности популяции в случаях, когда традиционными методами молекулярной эпидемиологии её обнаружить не удается, и обладает наибольшим потенциалом для осуществления эффективного эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями.

С появлением новых компактных приборов NGS для секвенирования, в частности, MiSeq (Illumina), стало возможным использование их не только в научных исследованиях, но и в повседневной практике лечебных учреждений при диагностике инфекционных, наследственных заболеваний, а также при эпидемиологических расследованиях вспышек инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИОМП). В частности, появились пилотные проекты изучения генетической вариабельности госпитальных штаммов метициллинрезистентных золотистого стафилококка (meticillin resistant Staphylococcus aureus – MRSA) [10, 22, 31] и C. difficile [22] с использованием платформы MiSeq. На основе данных WGS были построены дендрограммы, которые позволили установить четкие различия между изолятами госпитального и негоспитального происхождения. Полученные данные имели эпидемиологическое значение в установлении источника, путей и факторов передачи инфекции, обусловленной различными штаммами S. aureus и C. difficile [10, 22, 31]. S.R. Harris et al. в 2013 при исследовании вспышки, обусловленной MRSA в неонатальном отделении, методом полногеномного секвенирования на платформе MiSeq (Illumina) был выявлен новый сиквенс-тип S. aureus – ST2371, который является близко родственным ST22, но содержит гены, ответственные за синтез токсина лейкоцидина (токсин Пантона-Валентайна) [10]. Таким

образом, использование WGS на платформах NGS позволяет проводить как генотипирование, так и выявлять новые генетические свойства возбудителя.

Полногеномное секвенирование может стать стандартным подходом для осуществления эпидемиологического надзора за внебольничными и госпитальными (ИОМП) инфекциями, мониторирования распространенности и эволюции большинства патогенов [9, 31].

Важным звеном в эпидмаркировании возбудителя инфекционного заболевания является определение его лекарственной устойчивости. Методы, основанные на секвенировании нуклеиновых кислот, находят применение в детекции спектра устойчивости к антибиотикам бактериальных патогенов (H. pilory, U. urealyticum, M. genitalium) [30, 111, 112] и к антиретровирусным препаратам вирусов (ВИЧ) [113]. В настоящее время рассматривается вопрос об использовании данных WGS для определения спектра чувствительности к антимикробным препаратам. Например, C.U. Kоser et al. (2012) исследовали профиль антибиотикорезистентности у штаммов MRSA, вызвавших вспышку в отделении неонатальной интенсивной терапии, с использованием платформы MiSeq (Illumina) [31]. При поиске SNP были найдены точечные мутации в генах, определяющих устойчивость к ципрофлоксацину и рифампицину [31].

Данные о структуре генов лекарственной устойчивости штаммов бактерий, полученные с использованием WGS, необходимо сопоставлять с профилем антибиотикорезистентности, определенным традиционными методами (метод дисков или метод диффузии в агар), так как наличие мутации в гене не всегда сопровождается изменением фенотипических свойств микроорганизма. В связи с этим использование WGS в качестве единственного диагностического теста определения устойчивости целесообразно в тех случаях, когда имеется полная или почти полная информация о соответствии фенотипических и генетических признаков микроорганизма [9, 31].

При осуществлении эпиднадзора за вирусными инфекциями также используются платформы NGS, позволяющие проводить генотипирование и поиск SNP различных вирусов. Поскольку пассирование вирусов в культуре клеток очень трудоемкий процесс и возможен только в специализированных учреждениях, то WGS вирусных геномов, в большинстве случаев, осуществляется с использованием метагеномного подхода, описанного в разделе 2.1.3.

В настоящее время в литературе имеется небольшое количество работ, посвященных полногеномному секвенированию вирусов на платформах NGS. С использованием WGS учеными изучается взаимосвязь генетических особенностей с фенотипическими свойствами. Например,

в работе M.L. Szpara et al. (2010) с использованием платформы GAIIx (Illumina) определен ген, кодирующий белок нейровирулентности ICP34.5 (RL1) у штамма H129 вируса простого герпеса первого типа, который явился причиной возникновения уникального фенотипа с антероградным типом распространения [114]. A.W. Kolb et al. (2011) на модели герпетического кератита у мышей изучали взаимосвязь между генотипом вируса простого герпеса первого типа (7 штаммов) и степенью его поражения глаз [115]. В качестве референсного использовался природный штамм вируса простого герпеса первого типа (ВПГ-1) 17. С использованием платформы GAIIx (Illumina) было обнаружено около 200 SNP у каждого исследуемого штамма ВПГ-1 по сравнению со штаммом 17. Однако из-за недостаточного количества исследуемых штаммов статистически значимой зависимости между выявленными SNP и проявлением патологии установить не удалось [115].

WGS также используется для оценки генетической вариабельности штаммов различных вирусов. Например, в исследовании R. Zell et al. (2012) определялось генетическое разнообразие 19 штаммов вируса Varicella-Zoster, выделенных от больных в Германии. Обнаружены 2 штамма, имеющие 2 новых генотипа [116]. Изучение N. Renzette et al. (2011) крупных ДНК-содержащих вирусов, таких как цитомегаловирусы, позволило сделать вывод, что популяции цитомегаловирусов настолько же вариабельны, как и квазивиды РНК-вирусов [106].

Таким образом, WGS на платформах NGS может стать одним из основных методов молекулярной эпидемиологии, поскольку обладает большей разрешающей способностью обнаружения любых изменений генома, которые могут приводить к специфичным проявлениям патогенности возбудителей инфекционных заболеваний. Высокая производительность платформ NGS и скорость секвенирования нуклеиновых кислот позволяют проводить мониторинг изменчивости и циркуляции патогенов, эпидемиологические расследования вспышек инфекционных заболеваний в реальном времени, расширяют возможности быстрого и точного определения географического происхождения штаммов возбудителей инфекции в условиях миграции населения и осуществления адресных противоэпидемических мероприятий

ЛИТЕРАТУРА

1.Осин А.В., Краснов Я.М., Гусева Н.П. и др. Разработка алгоритма MLSTтипирования пандемических и предпандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор. Проблемы особо опасных инфекций. 2011. Т. 107. № 1. С. 58-61.

Osin A.V., Krasnov YA.M., Guseva N.P. i dr. Razrabotka algoritma MLSTtipirovaniya pandemicheskih i predpandemicheskih shtammov Vibrio cholerae biovara e'l'tor. Problemy osobo opasnyh infekcij. 2011. Т. 107. № 1. S. 58-61.

2. Киселев О.И., Комиссаров А.Б., Стукова М.А. и др. Пандемический грипп 2009 г. в России. Диагностика и молекулярно-биологические характеристики вируса. Вопросы вирусологии. 2011. № 1. С. 17-20.