Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию

ГОУ ВПО Кировская государственная академия

Кафедра микробиологии с вирусологией и иммунологией

Методическая разработка для преподавателей

Практическое занятие № 16 по микробиологии

для студентов 3 курса лечебного и педиатрического факультетов.

Тема: «Вирусы – возбудители клещевого энцефалита, краснухи, бешенства. Онкогенные вирусы».

Цель: способствовать формированию умений по изучению вирусных инфекций, освоению принципов их лабораторной диагностики.

Задачи:

• рассмотреть биологические свойства вирусов – возбудителей клещевого энцефалита, краснухи, бешенства;

• изучить эпидемиологию, патогенез, клинические особенности, вызываемых ими заболеваний, принципы их профилактики и лечения;

• обучить методам лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Студент должен знать:

1) до изучения темы – морфологию, строение, способы репродукции вирусов, методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний;

2) после изучения темы – свойства возбудителей клещевого энцефалита, краснухи, бешенства, методы культивирования, эпидемиологию, патогенез и клинические проявления, специфическое лечение и профилактику вызываемых ими заболеваний.

Студент должен уметь:

• отбирать патологический материал от больных для вирусологического исследования;

• проводить исследования по изучению биологических свойств вирусов;

• осуществлять серологические методы диагностики вирусных инфекций;

• выполнять профилактические мероприятия.

Контрольные вопросы:

1. Что Вам известно об истории изучения возбудителей клещевого энцефалита, краснухи, бешенства?

2. Каковы основные биологические свойства характерны для этих вирусов?

3. Какую роль они играют в патологии человека?

4. Опишите эпидемиологию, патогенез, клинические проявления, иммунитет краснухи, бешенства.

5. Какие методы применяются для лабораторной диагностики этих вирусных заболеваний?

6. Охарактеризуйте основные принципы их профилактики и лечения.

Методические указания

1.	План практического занятия	(135 мин)
1.1.	Организационные вопросы	5 мин
1.2.	Теоретическая часть	40 мин
1.3.	Время на перерыв	5 мин
1.4.	Теоретическая часть	45 мин
1.5.	Время на перерыв	5 мин
1.6.	Практическая работа	15 мин
1.7.	Изучение демонстрационного материала	10 мин
1.8.	Проверка протоколов	5 мин
1.9.	Уборка рабочего места	5 мин

2. Содержание занятия:

2.1. Контроль исходного уровня знаний. Способ – программированный контроль.

2.2. Ориентировочные основы самостоятельной работы студентов:

- выполнение практической работы;

- оформление и защита протоколов.

3. Тезисы изучаемого материала

3.1. Вирусы клещевого энцефалита.

Клещевой энцефалит (син.: таежный энцефалит, дальневосточный менингоэнцефалит, клещевой энцефаломиелит, русский весенне-летний менингоэнцефалит, tick-borne encepalitis) – это острое вирусное заболевание, характеризующееся поражением серого вещества головного и спинного мозга, приводящих к развитию параличей и парезов.

История изучения заболевания.

Как нозологическая единица КЭ был выделен в 1937 г. в результате работы комплексной экспедиции, возглавляемой Л.А.Зильбером (в составе экспедиции работали видные вирусологи М.П.Чумаков, В.Д.Соловьев). Были установлены закономерности, природная очаговость, сезонность, связь с активностью клещей. Описаны особенности клиники и патоморфологии КЭ, разработаны методы профилактики и лечения.

Вторая экспедиция под руководством Е.Н.Павловского выявила роль и значение клещей, как переносчиков и естественного резервуара вируса в природе. Результаты послужили основой теории о природной очаговости КЭ.

Во время третьей экспедиции, возглавляемой И.О.Рогозиным, изучались подходы к разработке специфической профилактике КЭ.

Таксономия.

Семейство – Flaviviridae (в 1984г. выделено в качестве самостоятельного из семейства Togaviridae). Название семейство и род получили по названию желтой лихорадки (лат.–flava–желтый), являющейся типичным представителем этой группы.

Род – Flavivirus, включает 63 представителя, сгруппированных в 10 антигенных комплекса. Различают два типа вируса клещевого энцефалита – западный (переносчики — клещи Ixodes persulcatus) и восточный (переносчики — клещи Ixodes ricinus), которые отличаются по тяжести клинического течения и антигенному составу вирусов возбудителя. В последние годы выделен третий тип вируса, изолированный в Греции из клещей Rhipicephalus bursa.

Морфология.

Форма вирусов сферическая. Размер – 40-45 нм. Тип симметрии – кубический. Организация – сложная, на поверхности расположены шипики гликопротеиновой природы. Молекулярная масса – 46*10⁴ кД. Коэффициент седиментации – 175-218 С.

Геном представляет собой одноцепочечную, инфекционную, плюснитевая РНК с молекулярной массой 4,2х10³ кД, константой седиментации 45 С, содержит около 14 пар нуклеотидов.

Химический состав.

РНК – 5,5 - 6,3%, Белки – 57-60%, Липиды – 27-30%, Углеводы – 6,5%

Антигены.

Комплементсвязывающий, групповой; выявляется в РСК;

Гемагглютинин, типовой; выявляется в РН, РТГА.

Репродукция.

1. Адсорбция при помощи фосфолипидных и гликопротеидных рецепторов.

2. Проникновение путем рецепторного эндоцитоза (виропексис), при слиянии вирусной оболочки со стенкой вакуоли вирусная РНК выходит в цитоплазму.

3. РНК выполняет функцию иРНК. Репликация идёт медленно (40- 60 ч).

4. Сборка: образование нуклеокапсида на ЭПС клетки.

5. Выход путем почкования (присоединение суперкапсида при выходе из клетки).

Культивирование.

1. В мозговой ткани белых мышей (3-4 недельного возраста).

2. В культуре клеток – куриных фибробластов, почек обезьян, перевиваемых клеток. В КК наблюдается ЦПД.

3. На овокультурах – в желточном мешке и хорионалантоисной оболочке.

Резистентность.

Вирус разрушается при действии эфира, детергентов, формалина, при кипячении — через 2 минуты. При нагревании до 56-60^оС в течении 10-30 мин., в молоке сохраняется до 2-х мес. Устойчив к УФО, длительно сохраняется в глицерине.

Эпидемиология.

Трансмиссивное природно-очаговое заболевание с весенне-летней сезонностью.

Механизм заражения – трансмиссивный.

Пути передачи:

1. трансмиссивный (при укусе клеща);

2. алиментарный (при употреблении в пищу инфицированного сырого козьего, коровьего молока и молочных продуктов);

3. контаминация (при раздавливании и втирании присосавшегося клеща);

4. трансплацентарный (плоду от матери).

Переносчики — клещи Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus.

Резервуарами и переносчиками инфекции в природе являются иксодовые клещи, распространенные почти во всех странах Европы, на европейской части России и в Сибири; дикие животные. После кровососания на больном животном, через 5—6 дней вирус проникает во все органы клеща, концентрируясь в половом аппарате, кишечнике и слюнных железах. Вирус сохраняется в течение всей жизни клеща, т. е. в течение 2—4 лет, что делает клещей «ценным» природным резервуаром инфекции. Показатель зараженности клещей неоднороден от региона к региону и от сезона к сезону, колеблясь в пределах от 1 до 20% (максимальный зарегистрированный показатель составляет 70%). Вирус передается между поколениями клеща. Насекомое способно паразитировать на 100 видах животных.

Период наибольшей активности клещей падает на весну и первую половину лета, что отражено в названии инфекции, которую они переносят, — «весенне-летний энцефалит».

Клещи не могут летать или прыгать, они могут только зацепиться за проходящую мимо и задевающую их жертву или же упасть на нее. Как и в случае других кровососущих насекомых, укус клеща может остаться незамеченным довольно долгое время, благодаря присутствию в его слюне особых разжижающих кровь (антикоагулянтов) и обезболивающих веществ. Именно по этой причине, простой, но очень эффективной мерой по обнаружению присосавшегося клеща являются само- и взаимоосмотры по выходе из леса и на привалах. Самцы клеща, в отличие от самок, присасываются на очень короткое время, что является еще одной причиной того, что многие заболевшие не помнят факта укуса.

Не исключено и заражение людей, не посещавших лес. Это может произойти при заносе клещей животными (собаками, кошками) или людьми — на одежде, с цветами, ветками и т. д.

Наибольшему риску подвержены лица, деятельность которых связана с пребыванием в лесу: работники леспромхозов, геологоразведочных партий, строители автомобильных и железных дорог, нефте- и газопроводов, линии электропередач, топографы, охотники, туристы. В последние годы в числе больных до 75% составляют жители города, заразившиеся в пригородных лесах, на садовых и огородных участках.

Патогенез.

Вирус попадает через кожу или слизистые в клетки мононуклеарно-фагоцитарной системы, где происходит первичная репродукция вируса. Затем выходит в кровь (вирусемия), вызывая интоксикацию. С током крови попадает в клетки ЦНС, размножается, вызывая дегенеративные изменения в сером веществе спинного и головного мозга (особенно тяжелые поражения отмечают в нервных клетках передних рогов шейного отдела СМ, ядрах мозжечка и продолговатого мозга). В оболочках мозга, спинномозговых корешках, периферических нервах развивается экссудативное воспаление.

Клиника.

Инкубационный период в среднем составляет 1,5—2 недели, иногда затягиваясь до 3 недель. Разную длительность инкубационного периода можно объяснить характером укуса — чем дольше присасывался клещ, тем больше вирусов проникло в организм и тем быстрее будет развиваться заболевание.

Заболевание развивается остро, в течение нескольких дней.

Основные формы КЭ.

1. Лихорадочная (30-50%)

2. Менингеальная (40-60%)

3. Очаговая (8-15%).

Вирус поражает мягкую мозговую оболочку, серое вещество (кору) головного мозга, двигательные нейроны спинного мозга и периферические нервы, что клинически выражается в судорогах, параличах отдельных групп мышц или целых конечностей и нарушении чувствительности кожи.

Позже, когда вирусное воспаление охватывает весь головной мозг, отмечаются общемозговые симптомы— постоянные головные боли, упорная рвота, потеря сознания, вплоть до коматозного состояния или, наоборот, развивается психомоторное возбуждение с утратой ориентации во времени и пространстве.

Могут отмечаться нарушения сердечно-сосудистой системы (миокардит, сердечно­сосудистая недостаточность, аритмия), пищеварительной системы — задержка стула, увеличение печени и селезенки.

Все перечисленные симптомы отмечаются на фоне токсического поражения организма — повышение температуры тела до 39—40°С.

В небольшом проценте случаев, при поражении спинномозговых нервов, заболевание может протекать по типу «радикулита» (полирадикулоневрита).

Тяжесть заболевания зависит от возраста — вероятность выраженного поражения головного мозга резко повышается с возраста 40 лет, при возрасте старше 60 регистрируется максимальная летальность.

Осложнения клещевого энцефалита отмечаются у 30 — 80% переболевших клинически выраженной формой и в основном представлены вялыми параличами преимущественно верхних конечностей.

Летальность колеблется в пределах от 2% при европейской форме до 20% при дальневосточной (более тяжелой и опасной) форме. Смерть наступает в течение 1 недели от начала заболевания.

Реже встречаются нетипичные варианты заболевания — стертые, гриппоподобные формы; полиомиелитоподобная форма. Возможно длительное хроническое носительство вируса.

Иммунитет.

После перенесенной инфекции формируется стойкий пожизненный иммунитет в результате выработки вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и гемагглютинирующих антител. Развивается ГЗТ.

Микробиологическая диагностика.

Исследуемый материал – кровь, СМЖ, клещи, секционный материал.

1. Вирусологический метод – выделение и идентификация;

2. Серологический метод – РН, РСК, РТГА, ИФА, РЗГА, РНГА с парными сыворотками (нарастание в 4 и более раз);

3. Экспресс-метод – РИФ, РПГА, ИФА,РИА;

4. Иммунохимический и молекулярно-биологический методы – ИФА, РНГА

Профилактика.

Общие меры по профилактике укусов клещей включают:

ношение в лесу специальной одежды — сапоги, куртки с плотно застегнутыми рукавами; платок или сетка, закрывающая шею; головной убор, закрывающий волосы; само- и взаимоосмотры на выходе из леса и на привалах; скашивание травы и низкорослого кустарника, рубка сухостоя, освобождение от завалов и пней; применение жидких и аэрозольных репеллентов (специальных химических веществ для борьбы с насекомыми); кипячение сырого козьего и коровьего молока на территориях, где регистрируется клещевой энцефалит.

Специфическая (для клещевого энцефалита) профилактика осуществляется с помощью инактивированных вакцин. Быструю (через 24 часа от момента введения) профилактику также можно осуществлять с помощью однократного введения иммуноглобулина, который защищает на срок до 1 месяца.

Первая помощь при укусе клеща. Для удаления присосавшегося клеща его предварительно смазывают каким-нибудь жиром (вазелином, кремом, подсолнечным маслом), а через 15—20 минут осторожно вытягивают нитяной петлей или пинцетом, покачивая из стороны в сторону. Следует избегать разрушения клеща. Снятое насекомое следует сжечь или залить кипятком, однако его также можно принести с собой в медицинский пункт для установления инфицированности клеща вирусом. Место укуса рекомендуется обработать йодом, перекисью водорода или спирт-содержащим препаратом и тщательно вымыть руки.

Ни в коем случае не следует раздавливать клеща, поскольку в этом случае также может произойти заражение вирусом, содержащимся во внутренних органах клеща.

Вакцины. Принципиально все вакцины для профилактики клещевого энцефалита представляют собой выращенные на куриных эмбрионах, инактивированные формалином вирусы, адсорбированные на адъюванте (вещество для усиления иммунного ответа) — гидроокиси алюминия. В качестве дополнительных, стабилизирующих компонентов применяют желатин или альбумин.

На настоящий момент в России применяются четыре вакцины.

1. Культуралъная вакцина (пр-во НПО Вирион, Томск). Показана для вакцинации детей с 4 лет и взрослых до 65 лет. Курс вакцинации состоит из трех доз по схеме: 0—1—4. Альтернативная схема для быстрой защиты состоит из двух доз с интервалом 1—2 месяца, причем последняя доза вводится не позднее, чем за 2 недели до входа в природный очаг инфекции.

2. Концентрированная культуральная вакцина (пр-во Института полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва, Россия; штамм Софьин). От первой отличается тем, что может применяться с 18 лет. Курс вакцинации состоит из двух доз с интервалом 5—7 месяцев. Первую ревакцинацию делают одной дозой вакцины через 1—2 года, вторую и последующие — через три года.

3. «FSME-Immun-lnject» (пр-ва Immuno AG, Австрия в составе компании Baxter, США). Выпускается в виде шприц-доз, объем дозы — 0,5 мл для всех возрастов. Защищает от обоих вариантов инфекции — европейского и дальневосточного. Курс вакцинации состоит из 2 доз, которые вводятся с интервалом от 2 недель до 1 месяца (после такой вакцинации защищенными являются 95% привитых). Первая ревакцинация проводится через 9—13 месяцев после введения второй дозы; повторная ревакцинация — 3 года от момента введения третьей дозы. Может вводиться одновременно с иммуноглобулином. Не имеет возрастных ограничений.

4. Наиболее распространена и имеет широкий опыт применения «Энцепур» (пр-ва Chiron Behring, Германия, вирусный штамм К23).

От предыдущей отличается наличием дополнительной схемы вакцинации — три дозы по схеме 0—1—3 недель. Второе отличие — несколько большее число побочных реакций в связи с присутствием в составе вакцины желатина.

Все перечисленные вакцины обладают высокой иммуногенной активностью. Через две недели после введения последней дозы первичного курса вакцинации иммунитетом обладают от 90 до 97% привитых.

Экстренная профилактика, т.е. профилактика после укуса клеща, может быть проведена с помощью иммуноглобулинов. Срок для проведения такой профилактики ограничен тремя днями, после этого срока она теряет смысл.

В России доступны:

1. Иммуноглобулин против клещевого энцефалита человеческий жидкий (пр-во Биомед-Пермь, Россия). Вводят внутримышечно, однократно в возрасте до 12 лет — 1 мл, 12—16 лет — 2 мл, 16 лет и старше — 3 мл.

2. Иммуноглобулин против клещевого энцефалита (из лошадиной сыворотки), пр-во Россия.

3. FSME-Bulin (Immuno AG, Австрия).

Выпускают во флаконах по 1, 2, 5 и 10 мл. В целях профилактики (до укуса клеща) вводят в дозе 0,05 мл на кг массы тела. Действие начинается через 24 часа и продолжается в течение 1 месяца. Возможно повторное введение для более длительной защиты.