mol_biol_2015

ПРОГРАММА КУРСА "МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ"

для биологов и медиков 2 курса,

биохимиков и биофизиков 4 курса НГУ

Определение предмета "молекулярная биология". Этапы развития.

Молекулярная биология – это наука о механизмах хранения, воспроизведения, изменения, передачи и реализации генетической информации о структуре и функциях нерегулярных биополимеров: нуклеиновых кислот и белков.

Этапы развития:

– «Детство» – первый романтический период. 1935-1944 годы. С появлением электронного микроскопа появилась возможность видеть фаги (Дельбрюк, Лурия).

– «Отрочество» – 1944-1953 годы. Здесь были произведены основные открытия, предшествовавшие расшифровке ДНК. Уотсон, Крик, Уилкинс, Франклин.

– Догматический период – 1953-1962.

– Академический период – с 1962 по наше время. С 1974 – генноинженерный попериод.

Основные открытия.

Бидл и Татум в 1940 - «1 ген – 1 фермент». В 1944, Эвери, Маклауд и Маккарти - генетическую роль ДНК. Крик - центральная догма молекулярной биологии: «ДНК -> РНК - > белок». 1962 – расшифровка генетического кода – Ниренберг, Очоа, Маттеи. В 1970 году Темин и Балтимор - обратная транскриптаза. 1974 Смит, Натанс, Арбер – открытие рестриктаз. 1987 год – Муллис – полимеразная цепная реакция. 1998 – Файер, Мэлло – ДНК-интерференция. 1961 – Жакоб, Моно, Львов – открытие генетической регуляции синтеза ферментов. 1977 – Шарп, Робертс – открытие сплайсинга. 1982 – Чек – автосплайсинг.

Доказательства генетической роли нуклеиновых кислот.

– Гриффит, 1928. Заражение капсульный пневмококком мыши приводит к ее гибели, при этом бактерии продолжают размножаться. Заражение бескапсульным штаммом не приводило к гибели мыши. Если убитый капсульный штамм смешивали с бескапсульным, то мышь погибала и в ней размножались капсульные пневмококки. Данное явление назвали трансформацией – приобретение одним организмом признаков другого организма за счет захвата части его генетической информации. В 1944 году Эвери продолжил эксперимент, разделив капсульный пневмококк на составные части: полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты. Поскольку метод выделения был щелочной, то РНК подвергалась гидролизу, и в образцах оставалась только ДНК. Затем составные части по отдельности вводили мыши. Погибала мышь только при внесении образца ДНК с бескапсульными пневмококками. Так была подтверждена генетическая роль ДНК.

В 1956 году Френкель-Конрад работал с вирусом табачной мозаики. Было показано, что существуют разные штаммы, которые вызывают разные внешние изменения. Из образцов вирусов были убраны белковые составляющие, в итоге патологические изменения сохранились, что подтвердило генетическую роль РНК. – РНК-вирусы: ВИЧ, гепатит C и другие.

Хронология открытий, подготовивших создание Уотсоном и Криком

модели двойной спирали ДНК.

Нуклеозид, нуклеотид, полинуклеотид. Нерегулярные полимеры. Нуклеозид – сахар+азотистое основание. Нуклеотид – сахар + азотистое основание + остаток фосфорки

Принципы строения двойной спирали ДНК. Виды ДНК.

1. Нерегулярность азотистых оснований и регулярность сахаров.

2. Комплементарность.

3. Антипараллельность.

4. Структура в виде двойной спирали.

Параметры В-, А- и Z-форм ДНК. Палиндромы.

Параметры	А-форма	В-форма	Z-форма
Направление закрутки	Правая	Правая	Левая
П.н. на виток	11-12	10,4	12
Высота витка	34А	28А	44,5А
Диаметр витка	23А	20А	18А
Функции	Обр-е ДНК-РНК комплексов?		Сверхспирализация ДНК во время транскрипции?

Последовательности, комплементарные которым читаются зеркально. В трёхмерной структуре образуют шпильки.

Виды РНК. Их роль в клетке.

gРНК – хранение ген. инфы.

mРНК – передача ген. Инфы из ядра в цитозоль.

sРНК –

rРНК – синтез белка.

tРНК – «переводчик с языка азотистых оснований на язык аминокислот».

Классификация аминокислот(pH=7).

Неполярные:  аланин, валин, изолейцин, лейцин, пролин, метионин, фенилаланин, триптофан.

Полярные незаряженные:  серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин.

Полярные заряженные -: аспартат, глутамат.

Полярные заряженные +: лизин, аргинин, гистидин.

Первичная и вторичная структура белка.

Первичная – последовательность амк. Вторичная – пространственная конформация, обусловленная Н-связями между N и O, не входящими в одну пептидную связь. Имеет вид спирали или складок.

Третичная и четвертичная структура белка.

Третичная – пространственная конформация за счёт связей: 1) Н 2) Ковалентных (диS-мостики) 3) электростатических 4) гидрофобных

Четвертичная – структура из нескольких полипептидных цепей. Обусловлена теми же взаймодействиями, что и третичная.

Глобулярные и фибриллярные белки.

Часть белков в воде образует глобулу с гидрофобным ядром, а часть остаётся в форме нитей, за счёт преобладания полярных радикалов.

Денатурация и ренатурация белков.

При воздействии высокой t, изменении pH, ионной силы, др. хим. воздействиях, белки могут терять структуру вплоть до первичной. При исчезновении воздействия они могут восстанавливать структуру.

Фолдинг белков. Шапероны и шаперонины.

Сворачивание с приобретением наиболее энергетически выгодной конформации.

Шаперон – белок, поддерживающий открытую конформацию белка при синтезе.

Шаперонин – «бочонок», оберегающий белок от воздействия среды, пока он не свернётся.

Прионы.

«Антишапероны».

Основные биологические функции белков. Структурная и буферная.

Структурная – белки образуют основу многих органелл и межклеточного вещества, цитоскелет, входят в состав мембран,

Буферная – белки поддерживают определённое значение pH, т.к. они полиэлектролиты.

Основные биологические функции белков. Трансформация энергии,

транспортная, питательная и энергетическая.

Трансформация: родопсин и ретинен – световую в электрическую. Миозины – химическую в механическую.

Транспортная: пермеазы – транспорт через мембрану. Гемоглобин – транспорт О₂ и СО_2. Трансферрин – транспорт железа по крови. Альбумин – транспорт жирных к-т. Динеин и кинезин.

Питательная: а) запасные белки, необходимые для развития зародыша и вскармливания младенца. Овальбумин – яичный белок, абсолютно необходимый для развития зародыша яйцекладущих. Глиадин – белок зерна пшеницы, необходимый для развития зародыша злаковых растений. Казеин – белок молока. б) поставка незаменимых аминокислот. Заменимые, тоже содержащиеся в белках, обеспечивают следующую, энергетическую, функцию.

Энергетическая - заменимые аминокислоты окисляются с образованием энергии в виде молекул АТФ.

Ферменты. 6 классов. Понятие о коферментах и витаминах.

1) оксидоредуктазы – катализируют окислительные процессы;

2) трансферразы – самые многочисленные ферменты (ДНК-, РНК-полимеразы и другие);

3) гидролазы (протеазы, нуклеазы...);

4) лиазы – отщепляют группы негидролитическим путем и образуют двойные связи;

5) изомеразы – переносят группы внутри молекулы с образованием изомерных форм;

6) лигазы (образуют связи C-C, C-S, C-O, C-N в реакциях, сопряженных с расщеплением АТФ).

Коферменты – органические соединения, участвующие в каталитической реакции, но, в отличие от фермента, выходящие из нее в измененном состоянии.

Витамины – соединения, которые не могут быть синтезированы в организме и должны поступать в него извне в микроколичествах.

Регуляторная и рецепторная функции белков. Белковые гормоны.

а) внутриклеточные белки-активаторы и белки-репрессоры, активирующие и подавляющие процесс транскрипции б) гормоны – вещества, производимые в клетках одних органов, но регулирующие работу других органов. Например, гормон инсулин производится только в бета- клетках островков Лангерганса поджелудочной железы, регулирует поступление глюкозы из крови в клетку. Инсулин, глюкагон, соматотропин, тиреотропин, АКТП, окситоцин, вазопрессин.

Защитная функция белков. Иммуноглобулины. Интерфероны. Токсины.

a) интерфероны – белки, образующиеся в клетках, пораженных вирусом, которые выходят из этих клеток и взаимодействуют с близлежащими клетками. Они выступают как лиганды, запускающие различные механизмы защиты соседних клеток от вирусов. Интерфероны тканеспецифичны. b) иммуноглобулины (антитела) – глобулярные белки, имеющие четвертичную структуру, которая образована симметрично двумя тяжелыми цепями (H, heavy) и двумя легкими (L, light) цепями. Иммуноглобулин воспринимает антигены верхними вилочками. Задача антител – связать антигены в нерастворимую сеточку – преципитат. Антитела образуются на любое чужеродное вещество. Иммуноглобулины – глобулярные белки! Антитела – это уникальная функция, характерная только для белков.

Принципиальное строение биологической мембраны.

Биологическая мембрана – это бислой фосфолипидов и белки – амфифильное соединение – заряженная часть и гидрофобная часть

Общая характеристика гистонов.

+ заряженные белки, богатые лизином и аргинином. Н2А, Н2В, Н3, Н4 образуют гистоновый октамер, на который накручивается ДНК, образуя нуклеосому.

Нуклеосомный, супербидный, петлевой уровни компактизации ДНК

эукариот. Метафазная хромосома.

1. На октамер накручивается ДНК, образуя нуклеосому. 7 раз.

2. Н1 скрепляет нуклеосомы между собой. 6-10 раз.

3. Негистоновые белки специфично соединяются с ДНК, образуя петли. 20 раз.

4. Конденсин укладывает ДНК в спираль. 10 раз.

Функции ДНК. Матричный принцип.

1. Хранение генетической нформации.

2. Её воспроизведение и передача.

3. Её реализация.

Генетический код. Его основные свойства.

1. Триплетность – каждая амк кодируется триплетом.

2. Вырожденность – боль-во амк кодируются больше, чем одним триплетом.

3. Знаки препинания – УАА, УАГ, УГА – стоп кодоны.

4. Однозначность – триплет кодирует 1 амк или является кодоном. НО! Стоп-кодон УГА кодирует селеноцистеин, а УАГ – пирролизин. АУГ кодирует метионин, а в 1-й позиции – является заглавной буквой.

5. Компактность

6. Универсальность

7. Неперекрываемость – каждый нуклеотид входит в состав одного триплета.

8. Помехоустойчивость– в триплете возможно 9 замен – итого 61*9=549. Из них 134 из-за вырожденности не приводят к смене амк, 230 не меняют класс амк, и 162 – радикальные. (230+134)/162=2,25 – коэффициент помехоустойчивости.

Структура tРНК.

Рекогниция. Аминоацилирование tРНК.

Структура рибосом про- и эукариот. Центры рибосом E.coli.

Образование инициаторного комплекса трансляции у прокариот.

Этапы трансляции у прокариот. Белковые факторы трансляции.

Регуляция трансляции на примере фага MS2.

Особенности инициации трансляции у эукариот. Роль кэпа и поли-А

хвоста в трансляции у эукариот.

Образование rРНК и белков рибосом у E.coli.

Образование рибосом у эукариот. Понятие о ядрышке.

Принципы транскрипции.

Субъединичный состав РНК-полимеразы E.coli. Holo- и Core- фермент.

Понятие об опероне.

Особенности структуры промоторов у прокариот.

Этапы транскрипции у прокариот.

Регуляция транскрипции у бактерий.

Негативная индукция. Позитивная индукция.

Негативная репрессия. Позитивная репрессия.

Аттенуация в регуляции экспрессии триптофанового оперона E.coli.

Регуляторные РНК.

Особенности транскрипции у эукариот.

Множественность и специфичность РНК-полимераз эукариот.

Cis-элементы и Trans-факторы транскрипции. Понятие об энхансерах .

Образование инициаторного комплекса транскрипции с участием РНК-

полимеразы II.

Этапы процессинга mРНК эукариот:кепирование и полиаденилирование.

Этапы процессинга mРНК эукариот:сплайсинг и редактирование.

Различные механизмы сплайсинга: mРНК ядерных генов; tРНК дрожжей;

с участием матюразы.

Автосплайсинг I типа.

Автосплайсинг II типа.

Trans-сплайсинг.

Понятие об экзонах и интронах , их доля и размеры у разных классов.

Схемы альтернативного сплайсинга.

Каскад альтернативного сплайсинга при определении пола дрозофилы.

Процессинг mРНК кальцитонинового гена крысы.

РНК-интерференция. si РНК. mi РНК.

Источники разнообразия антител. Переключение классов иммуноглобулинов.

V-J рекомбинации при перестройке генов легких цепей иммуноглобулинов.

V-D-J рекомбинации при перестройке генов тяжелых цепей иммуноглобулинов.

Принципы репликации ДНК.

Доказательство полуконсервативного характера репликации.

Ферментативная система синтеза ДНК in vitro. Активирование ДНК.

ДНК-полимераза I из E.coli. Роль 3'5' и 5'3' гидролитических

активностей.

Схема непрерывной антипараллельной репликации Корнберга.

Схема непрерывной параллельной репликации Кэрнса.

Схема прерывистой антипараллельной репликации Оказаки.

ДНК-полимераза III(core), III*, holo-фермент. Их функции.

Схема размножения фага М13 и доказательство наличия РНК-затравки

при репликации ДНК.

Праймаза и праймосома.

Проблема денатурации матрицы при репликации ДНК . SSB. Геликазы.

Принципы работы и биологические функции топоизомераз.

Современная схема репликации ДНК E.coli . Модель «тромбона»

Особенности репликации ядерных ДНК эукариот. Полирепликонность.

Проблема недорепликации 3'-концов линейных молекул.

Лимит Хейфлика. Теория маргинотомии. Теломеры , теломераза и

старение.

Основные репарабельные повреждения в ДНК и принципы их

исправления.

Геномы и хромосомы.

Гены "домашнего хозяйства" и гены "роскоши".

Основы метода ренатурации ДНК в изучении структуры генома

эукариот.

Сателлитная ДНК. Особенности состава. Локализация в геноме.

Палиндромы. Роль обращенных повторов в геноме.

Умеренные повторы в геноме.

Мобильные генетические элементы про- и эукариот. Is и Tn.Эффекты их

внедрения в геном.

Line- и sine- элементы генома эукариот.

Провирусы. ВСР-строение и геном. Обратная транскрипция.

Онкорнавирусы. оnc-v и onc-c гены. Онкогены и гены-супрессоры

опухолей. Признаки трансформированных клеток.

Преимущество методов секвенирования нового поколения по сравнению

с методом Сэнгера.

Метагеномика. Объекты и методы метагеномных исследований.

Вопросы, рассматриваемые на семинарах, могут быть предложены

семинаристами на экзамене дополнительно

Общие принципы клонирования ДНК.

Гель-электрофоретическое фракционирование нуклеиновых кислот и

белков.

Использование антител для детекции белков. Вестерн-блот.

Гибридизация нуклеиновых кислот. Саузерн-блот. Нозерн-блот.

Секвенирование ДНК по Сэнгеру.

Полимеразная цепная реакция.

Литература

1. Льюин Б. Гены. Москва, БИНОМ.Лаборатория знаний, 2011.

2. Нельсон Д.,Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Москва, БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012.

3. Дымшиц Г.М.,Саблина О.В. Молекулярные основы современной биологии. Новосибирск, НГУ,2012

4. Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки . Москва Ижевск , R&C, 2013

7