Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный аграрный университет»	Методические указания
		С2.Б.11 Ветеринарная микробиология и микология

Кафедра инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы

С2.Б.11 ветеринарная микробиология и микология методические указания

к лабораторным работам

Направление подготовки

111801 Ветеринария

Профиль подготовки

специализация Ветеринарная фармация

Квалификация выпускника

специалист

Уфа 2013

УДК637.12.04/.07:378.147

ББК 36.95+74.58

А 65

Рекомендовано к изданию методической комиссией факультета биотехнологий и ветеринарной медицины (протокол № 2 от « 04 » сентября 2013 г.)

Составитель: профессор, д-р биол. наук А. В. Андреева

доцент, канд. биол. наук З. З. Ильясова

Рецензент: зав. кафедрой морфологии, патологии, фармации

и незаразных болезней, д-р ветеринар. наук Гимранов В.В.

Ответственный за выпуск:

зав. кафедрой инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы, д-р биол. наук, профессор Андреева А.В.

г. Уфа, БГАУ, кафедра инфекционных болезней,

зоогигиены и ветсанэкспертизы

Лабораторная работа № 7 Морфология плесневых грибов и дрожжей.

Цель: Ознакомиться со строением клетки микроскопических грибов.

Оборудование и материалы: Микроскопы (простые и электрические); готовые препараты микроскопических грибов; культуры Penicillium, Mucor; физраствор или стерильная вода; предметные и покровные стекла; препаровальные иглы; плакат: «Морфология микроскопических грибов».

Микроскопические грибы – это хемоорганотрофные микроорганизмы, эукариоты, лишены фотосинтетических пигментов, широко распространены в природе. Тело грибов организовано в виде мицелия (грибница), состоящего из сплетений тонких ветвящихся нитей (гиф). Грибы насчитывают более 200 видов. Различают низшие, высшие и несовершенные грибы.

Низшие грибы (зигомицеты) имеют хорошо развитый ветвистый одноклеточный мицелий, размножаются бесполым путем спорангиоспорами. Представителем являются грибы из рода Mucor (Мукоровые грибы). Они имеют мицелий, состоящий из одной сильноразветвленной клетки, от которой отходит плодоносящий гиф — спорангиеносец. На конце гифа образуется закруглённое цилиндрическое утолщение – колумелла. На ней находится спорангии со спорами. На спорангиеносце после освобождения спорангия от спор остается колонка, а в нижней ее части — воротник. Мукоровые грибы растут на влажных зернах, кормах, стенках сырых помещений в виде сероватого пушистого налета.

Для приготовления микроскопического препарата гриба мукор (Mucor) следует снять препаровальными иглами с его поверхности черновато-серый пушистый воздушный мицелий, внести в каплю воды на предметном стекле и при помощи двух игл осторожно, не нарушая структуры мицелия, расправить гифы мицелия, плодоносящие органы. Каплю накрывают покровным стеклом и слегка придавливают. Покровное стекло во избежание образования пузырьков воздуха нужно опускать постепенно. При микроскопировании выявить одноклеточное строение мицелия и органы размножения — спорангий со спорами, спорангиеносец. Рассмотреть их под микроскопом при увеличении объектива 40 по всей длине, передвигая соответствующим образом препарат. В препарате всегда отмечается большое количество свободнолежащих спор, высыпавшихся из лопнувших спорангиев.

Высшие грибы (аскомицеты, сумчатые грибы, аск - сумка) имеют многоклеточный септированный мицелий, образуют споры в сумках – асках. Представителями являются нитевидные микроскопические грибы из родов Penicillium и Aspergillus. По отношению к субстрату мицелий бывает поверхностный, или воздушный, и погруженный, или субстратный. Различают мицелий по окраске, он может быть бесцветный или окрашенный (черный, бурый, зеленый и т.д.).

Род Pemcillium (Пеницилловые грибы, кистевики) - он имеет ветвящийся септированный мицелий (толщина нитей 2 - 3 мкм) От мицелия отходят септированные конидиеносцы, которые на конце разветвляются в виде стеригм. От них отходят расположенные в виде цепочек конидии, имеющие гладкую шаровидную форму. Расположение канидий на стеригмах напоминает кисть руки. У разных видов гриба споры неодинакового цвета — белые, зеленые и др. Перед прорастанием конидии значительно увеличиваются в объеме.

Для изучения морфологии гриба нужно брать более молодую, зеленую часть мицелия — на границе с белым краем, использовав для этого препаровальные иглы. При микроскопировании установить многоклеточные (септированные) гифы и органы размножения — конидиеносцы с кистевидными разветвлениями на концах, на которых расположены стеригмы (по 2 - 4) с цепочками одноклеточных конидий.

Род Aspergillus (Аспергилловые грибы, леечные грибы, леечная плесень) - мицелий септирован (разделен поперечными перегородками), конидиеносцы (у некоторых видов не септированы) на вершине образуют расширение в виде головки, от которой отходят ответвления — стеригмы с отшнуровывающимися от них конидиями. Конидии располагаются по радиусам шара и напоминают наконечник лейки со струёй воды, выливающейся из лейки, поэтому эти грибы иногда называют леечной плесенью. У разных видов плесени конидии окрашены различно (черные, светло-зеленые и др.) и часто покрыты тонкими щетинками. Гриб принимает участие в минерализации органических веществ. Например, Aspergillus oryzae имеет конидии, окрашенные в желтый или желто-зеленый цвет. Эти грибы содержат ряд ферментов — амилазу, пектиназу, протеолитические ферменты и др.

Для приготовления микроскопического препарата гриба рекомендуют брать воздушный, окрашенный мицелий. При микроскопировании необходимо установить наличие одноклеточного (несептированного) конидиеносца, на его конце булавовидное вздутие, на котором расположены стеригмы с конидиями.

Несовершенные грибы имеют многоклеточный мицелий, размножаются бесполым путем при помощи конидий или вегетативно – участками гиф. Представителями являются грибы из родов Fusarium, Trichoderma, Alternaria.

Род Altemaria (Альтернария) широко распространена в почве и на растительных тканях. Гриб является возбудителем черной гнили — у корнеплодов и плодов. Иногда вызывает порчу мясных и молочных продуктов. От мицелия (многоклеточный) гриба отходят короткие конидиеносцы, на которых находятся многоклеточные конидии округло-грушевидной или заостренно-вытянутой формы, расположенные одиночно или короткими цепочками.

Для приготовления препарата гриба взять препаровальными иглами грибницу в черных ее участках. При микроскопировании найти многоклеточный мицелий и крупные многоклеточные темноокрашенные конидии, расположенные на коротких конидиеносцах.

Дрожжи - одноклеточные, лишенные хлорофилла немицелиальные грибы – эукариоты, имеют разнообразную форму: яйцевидная, эллиптическая, цилиндрическая, лимоновидная, грушевидная, округлая и шаровидная. Размножаются почкованием и делением, поэтому различают почкующиеся и делящиеся дрожжи. Размер дрожжевых клеток больше бактериальных и достигает в диаметре 8 - 10 мкм. Дрожжевые клетки неподвижны и имеют клеточную стенку, цитоплазму и ясно выраженное дифференцированное ядро. У зрелых дрожжей обнаруживаются 1-2 вакуоли различной формы. В цитоплазме имеются разные включения: гликоген, капли жира. В некоторых дрожжевых клетках может накапливаться до 30...35 % жира. При спорообразовании в дрожжевой клетке образуется от 2 до 10 спор. Дрожжевая клетка в этом случае рассматривается как аскус (сумка), а споры — как аскоспоры.

Для исследования на предметное стекло наносят каплю дрожжей и накрывают покровным стеклом (раздавленная капля). Просматривают с применением объективов 8 и 40 в затемненном поле зрения, для чего сужают диафрагму или опускают конденсор. При микроскопировании дрожжей нужно определить форму, размеры, наличие вакуоли. Процентное содержание почкующихся клеток определяют по методике, принятой для подсчета количества мертвых дрожжевых клеток.

Препарат готовят обычным способом, высушивают на воздухе, фиксируют. На препарат кладут полоску фильтровальной бумаги, красят карболовым фуксином Циля, подогревают 3-5 мин до появления паров (в результате и споры, и вегетативные формы окрашиваются в один цвет — красный), бумажку снимают. Препарат обесцвечивают, погружая в 2%-ный раствор молочной кислоты. Его промывают водой и докрашивают в течение 3...5 мин 1%-ным раствором метиленового синего, промывают водой. Зрелые аскоспоры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки — в синий.

Приготовление препаратов плесневых грибов. Плесневые грибы размножаются спорами, поэтому при приготовлении мазка исследуемую культуру необходимо держать вблизи предметного стекла. Готовят препарат «придавленная капля». Для приготовления мазка из плотных питательных сред необходима жидкая смесь состоящая из воды, этанола и глицерина в равных объемах. Мазок из жидких сред готовят методом «висячая капля».

Порядок приготовления препарата:

1. Берут чистое предметное стекло.

2. Наносят каплю жидкой смеси.

3. Фламбированной иглой берут кусочек мицелия, помещают в каплю жидкости и расправляют.

4. Накрываю покровным стеклом.

5. Микроскопируют под увеличением ×40, в затемненном поле зрения.

Дрожжи микроскопируют с помощью препарата «придавленная капля». Также готовят мазки и окрашивают простым способом, по Граму или Романовскому-Гимзе. Плесневые грибы и дрожжи окрашиваются грамположительно (Гр⁺).

Задания

1. Приготовить мазки из плесневых грибов.

2. Рассмотреть мицелий и споры.

3. Зарисовать и обозначить структурные элементы.

4. Приготовить мазки из пекарских дрожжей. Рассмотреть и зарисовать.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Морфология микроскопических грибов из рода Mucor.

2. Морфология микроскопических грибов из рода Aspergillus.

3. Морфология микроскопических грибов из рода Penicillium.

4. Как готовить микроскопические препараты из плесеней?

5. К каким организмам относятся микроскопические грибы?