2009.-Byelorussian Pharmacopoeia_Volume 3

ферного раствора рН 2,0 Р, фильтруют и

дегазируют;

–скорость подвижной фазы: 1 мл/мин;

–спектрофотометрический детектор, длина волны 214 нм;

–уравновешивание колонки: в начальных

условиях — не менее 15 мин. Проводят холо-

стой прогон, используя вышеуказанную про-

грамму градиентного элюирования;

–объем вводимой пробы: 50 мкл. Пригодность хроматографической си-

стемы (на хроматограмме раствора сравне-

ния идентифицируют пики, соответствующие

фрагментам I, II и III):

–хроматограмма испытуемого раствора и раствора сравнения должны качественно соответствовать хроматограмме, прилагаемой к

ФСО инсулина свиного.

–фактор асимметрии: не более 1,5 для пиков фрагментов II и III;

–разрешение: не менее 1,9 между пиками фрагментов II и III.

Результаты: профиль хроматограммы испытуемого раствора соответствует профи-

лю хроматограммы раствора сравнения.

ПРИМЕЧАНИЕ: время удерживания фрагмента I одинаково для инсулина свиного и человеческого. Время удерживания фрагмента II и IV одинаково для всех инсулинов. Время удерживания фрагмента III одинаково для свиного и бычьего инсулинов.

ИСПЫТАНИЯ

Примеси с молекулярной массой, превышающей молекулярную массу инсулина. Эксклюзионная хроматография (2.2.30): определение проводят методом внутренней нормализации. Растворы хранят при температуре от 2°С до 10°С и используют в течение 7 дней. При использовании автоматического инжектора поддерживают его температуру от 2°С до 10°С.

Испытуемый раствор. 4 мг испытуемого образца растворяют в 1,0 мл 0,01 М раствора кислоты хлористоводородной.

Раствор сравнения. Используют раст-

вор около 4 мг/мл инсулина, содержащего более 0,4 % белков с высокой молекулярной массой. Может использоваться инъекционный препарат инсулина, как раствор, так и суспензия, растворенная в достаточным количестве 6 М кислоты хлористоводородной,

содержащий обнаруживаемое количество

белков с высокой молекулярной массой или

раствор, приготовленный из субстанции инсулина, растворенной в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной. Инсулин, содержащий обнаруживаемое количество белков с высокой молекулярной массой, может быть

приготовлен, если выдержать порошок инсу-

лина при комнатной температуре в течение 10 дней.

Условия хроматографирования:

–колонка длиной 0,3 м и внутренним ди-

аметром не менее 7,5 мм, заполненная силикагелем гидрофильным для хроматографии

Р(размер частиц от 5 мкм до 10 мкм), пригодным для разделения мономера инсулина от

димера и полимеров.

–подвижная фаза: смешивают 15 объемов кислоты уксусной ледяной Р, 20 объемов

ацетонитрила Р, 65 объемов раствора 1 г/л аргинина Р; фильтруют и дегазируют;

–скорость подвижной фазы: 0,5 мл/мин;

–спектрофотометрический детектор,

длина волны 276 нм;

–уравновешивание: перед использованием новой колонки для хроматографическо-

го анализа уравновешивают ее путем повтор-

ных введений раствора инсулина, содержащего белки высокой молекулярной массы (например, не менее трех повторных введений раствора сравнения). Колонку считают уравновешенной, если после двух последовательных введений получают воспроизводимые результаты.

–объем вводимой пробы: 100 мкл;

–время хроматографирования: около 35 мин;

Времена удерживания: полимерные инсулиновые комплексы — от 13 мин до 17 мин; ковалентный димер инсулина — около 17,5 мин; мономер инсулина — около 20 мин; соли — около 22 мин.

Пригодность хроматографической системы: раствор сравнения:

–коэффициент разделения пиков: не

менее 2,0 (Hp — высота пика димера относи-

тельно базовой линии; Hv — расстояние между

базовой линией и нижней точкой кривой, разделяющей пики димера и мономера).

Предельное содержание примесей: на хроматограмме испытуемого раствора сумма площадей всех пиков со временем удерживания меньшим, чем время удерживания основного пика — не более 1,0 % от суммы площадей всех пиков.

На хроматограмме испытуемого раствора не учитывают пики со временем удерживания

большим, чем время удерживания пика инсулина.

Родственные белки. Жидкостная хроматография (2.2.29.), как указано в разделе «Количественное определение», со следующей

программой градиентного элюирования:

Растворы хранят при температуре от 2°С до 10°С и используют в течение 24 ч.

Пригодность хроматографической системы указана в разделе «Количественное опре-

деление». При необходимости изменяют относительные пропорции подвижных фаз А и В для обеспечения полного элюирования А21-

дезамидоинсулина свиного перед началом гра-

диента. Профиль градиента также может регулироваться для обеспечения полного элюирования всех родственных инсулину примесей.

Объем вводимой пробы: по 20 мкл раствора

сравнения (b) и испытуемого раствора. При необходимости изменяют объем вводимой пробы

от 10 мкл до 20 мкл в соответствии с результата-

ми определения линейности для проверки при-

годности хроматографической системы, как указано в разделе «Количественное определение».

Время хроматографирования: около 50 мин.

Относительное удерживание (по отноше-

нию к основному пику): А21-дезамидоинсулин свиной (небольшой пик, элюирующийся после основного пика на хроматограмме раствора сравнения (b)) — около 1,3.

Предельное содержание примесей:

–А21-дезамидоинсулин свиной (не более 2,0%): на хроматограмме испытуемого раствора площадь пика А21-дезамидоинсулина свиного

не должна превышать 2,0% от суммы площадей

всех пиков;

–сумма примесей (не более 2,0%): на хроматограмме испытуемого раствора сумма площадей всех пиков, кроме основного и пика А21-

дезамидоинсулина свиного, не должна превы-

шать 2,0% от суммы площадей всех пиков.

Проинсулин-подобные иммунореактивные примеси (PLI). Не более 10 ppm в пересче-

те на сухое вещество. Определение проводят

подходящим по чувствительности иммунохими-

ческим методом (2.7.1), например, радиоимму-

нологическим анализом, с использованием Меж-

дународного Стандартного Реактива проинсули-

на свиного для калибровки метода.

Цинк. Не более 1,0% в пересчете на сухое

вещество. Атомно-абсорбционная спектроме-

трия (2.2.23, метод 1).

Испытуемый раствор. 50,0 мг испытуемого образца растворяют в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной и доводят до объема 25,0 мл этим же растворителем. При необходимости разводят 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной до получения подходя-

щей концентрации (например, от 0,4 мкг/мл до

1,6 мкг/мл Zn).

Растворы сравнения. Используют све-

жеприготовленные растворы, содержащие

0,40 мкг/мл, 0,80 мкг/мл, 1,00 мкг/мл, 1,20 мкг/мл

и 1,60 мкг/мл Zn. Расторы готовят путем разве-

дения эталонного раствора цинкового (5 мг/мл Zn) Р 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной.

Источник излучения: лампа с полым като-

дом для определения цинка.

Длина волны: 213,9 нм.

Генератор атомного пара: воздушно-

ацетиленовое пламя подходящего состава (например, воздух — 11 л/мин, ацетилен — 2 л/мин).

Потеря в массе при высушивании (2.2.32).

Не более 10,0%. 0,200 г испытуемого образца сушат при температуре 105°С в течение 24 ч.

Сульфатная зола (2.4.14, метод А). Не

более 2,5% в пересчете на сухое вещество.

Определение проводят из 0,200 г испытуемого образца.

Бактериальные эндотоксины (2.6.14).

Менее 10 МЕ/мг, если субстанция предназначена для производства лекарственных средств для парентерального применения без последу-

ющей процедуры удаления бактериальных эн-

дотоксинов.

#Остаточные количества органических растворителей (2.4.24). Испытуемый образец должен выдерживать требования статьи (5.4).

#Микробиологическая чистота (2.6.12, 2.6.13, 5.1.4). Инсулин свиной в условиях испы-

тания не обладает антимикробным действием.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Жидкостная хроматография (2.2.29). Растворы хранят при температуре от 2°С до 10°С и используют в течение 48 ч. При использовании автоматического инжектора поддерживают его температуру от 2°С до 10°С.

Испытуемый раствор. 40,0 мг испытуемого образца растворяют в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной и доводят до объема 10,0 мл этим же растворителем.

Раствор сравнения (а). Содержимое контейнера ФСО инсулина человеческого растворяют в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной до получения концентрации 4,0 мг/мл.

Раствор сравнения (b). Содержимое контейнера ФСО инсулина свиного растворяют в

0,01 М растворе кислоты хлористоводородной

до получения концентрации 4,0 мг/мл.

Раствор сравнения (с). 1,0 мл раствора сравнения (b) доводят 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной до объема 10,0 мл.

Раствор сравнения (d). К 1,0 мл раствора сравнения (а) прибавляют 1,0 мл раствора сравнения (b).

Условия хроматографирования:

– колонка длиной 0,25 м и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная силикагелем окта-

децилсилильным для хроматографии Р с раз-

мером частиц 5 мкм;

–температура: 40°С;

–подвижная фаза: подвижная фаза А — подвижная фаза В (42:58, об/об), при необходи-

мости состав корректируют.

Следующие растворы готовят и хранят при температуре не ниже 20°С:

–подвижная фаза А: 28,4 г натрия сульфата безводного Р растворяют в воде Р и

доводят до объема 1000 мл этим же раст-

ворителем; прибавляют 2,7 мл фосфорной кислоты Р; при необходимости доводят до рН 2,3 этаноламином Р; фильтруют и дегазируют;

–подвижная фаза В: 550 мл подвижной

фазы А смешивают с 450 мл ацетонитрила Р. Полученный раствор подогревают до температуры не ниже 20°С для предотвращения выпадения осадка (смешивание подвижной фазы А с ацетонитрилом — эндотер-

мический процесс), фильтруют и дегазируют;

скорость подвижной фазы: 1 мл/мин;

–спектрофотометрический детектор,

длина волны 214 нм;

–объем вводимой пробы: по 20 мкл растворов сравнения (b), (c), (d) и испытуемого раст-

вора.

Пригодность хроматографической системы:

–разрешение (на хроматограмме раствора сравнения (d) должен быть пик со временем удерживания, соответствующим времени удерживания основного пика на хроматограмме раст-

вора сравнения (b). На хроматограмме раствора

сравнения (d) идентифицируют пики, соответствующие свиному и человеческому инсулину): не менее 1,2 между пиками человеческого и сви-

ного инсулина на хроматограмме раствора срав-

нения (d). При необходимости изменяют концентрацию ацетонитрила в подвижной фазе.

–линейность: площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (b) должна

превышать площадь основного пика на хрома-

тограмме раствора сравнения (c) в 10±0,5 раз. При необходимости изменяют объем вводимой

пробы (10—20 мкл) в зависимости от уровня ли-

нейности детектора.

Суммарное содержание инсулина свиного

(C256H381N65O76S6) и А21-дезамидоинсулина свиного рассчитывают из площадей соответству-

ющих пиков на хроматограммах испытуемого раствора и раствора сравнения (b) и известного суммарного содержания инсулина свиного и А21-дезамидоинсулина свиного в ФСО инсулина свиного.

ХРАНЕНИЕ

В воздухонепроницаемом контейнере в защищенном от света при температуре -20°С до момента реализации производителем. После оттаивания инсулин может храниться при температуре (5±3)°С и использоваться для приготовления ле-

карственных средств в течение короткого проме-

жутка времени. Для предотвращения абсорбции влаги из воздуха в процессе взвешивания инсу-

лин должен быть комнатной температуры.

ИНСУЛИН ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ

Insulinum humanum

INSULIN, HUMAN

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-

10

Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-

20

Asn-OH

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-

10

Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-

20

Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH

ОПРЕДЕЛЕНИЕ.

Инсулин человеческий представляет собой

двухцепочечный пептид, имеющий структуру антидиабетического гормона, продуцируемого поджелудочной железой человека. Сум-

марное содержание инсулина человеческого

(C257H383N65O77S6) и А21-дезамидоинсулина че-

ловеческого составляет не менее 95,0% и не более 105,0% в пересчете на сухое вещество.

В целях маркировки лекарственных средств, содержащих инсулин, принято, что 0,0347 мг инсулина человеческого эквивалентны 1 МЕ инсулина.

ПРОИЗВОДСТВО

Инсулин человеческий производят либо с помощью ферментативной модификации и подходящей очистки инсулина, полученного из поджелудочной железы свиней, либо методом, основанном на технологии рекомбинантной ДНК (рДНК).

При производстве инсулина человеческого используют методы, позволяющие уменьшить степень микробиологической контаминации.

Для инсулина человеческого, полученного путем ферментативной модификации и подходящей очистки инсулина из поджелудочной железы свиней, производственный процесс валидируется, чтобы подтвердить удаление любой возможной протеолитической активности. Уполномоченный орган может предъявлять дополнительные требования.

Для инсулина человеческого, полученного методом, основанном на технологии рекомбинантной ДНК, желательно проводить следующие испытания, выполняемые для каждой

серии конечной продукции «in bulk», если иное не утверждено уполномоченным органом.

Белки клетки-хозяина. Предельное содер-

жание устанавливает уполномоченный орган.

Одноцепочный прекурсор. Предельное содержание устанавливает уполномоченный орган. Используют метод с подходящей чувстви-

тельностью.

ОПИСАНИЕ (СВОЙСТВА)

Белый или почти белый порошок.

Практически нерастворим в воде и в 96%

спирте. Растворяется в разведенных минераль-

ных кислотах и, с разрушением структуры, в разведенных растворах гидроксидов щелочных ме-

таллов.

ПОДЛИННОСТЬ (ИДЕНТИФИКАЦИЯ)

А. Просматривают хроматограммы, полу-

ченные в разделе «Количественное определение». Основной пик на хроматограмме испыту-

емого раствора по времени удерживания соот-

ветствует основному пику на хроматограмме

раствора сравнения (а).

В. Пептидное картирование (2.2.55).

СЕЛЕКТИВНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПЕПТИДНЫХ СВЯЗЕЙ.

Испытуемый раствор. Готовят раствор 2,0 мг/ мл испытуемого образца в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной. 500 мкл полученного

раствора помещают в чистую пробирку, прибавляют 2,0 мл буферного (HEPES) раствора рН 7,5 Р

и 400 мкл раствора 1 мг/мл протеазы Stafilococus aureus штамм V8 Р. Закрывают пробирку и инкубируют при температуре 25°С в течение 6 ч. Оста-

навливают реакцию прибавлением 2,9 мл сульфатного буферного раствора рН 2,0 Р.

Раствор сравнения. Готовят таким же образом и в то же самое время, как и испытуемый раствор, используя ФСО инсулина человеческого вместо испытуемого образца.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ. Жидкостная хроматография (2.2.29).

Условия хроматографирования:

–колонка длиной 0,10 м и внутренним диа-

метром 4,6 мм, заполненная силикагелем октадецилсилильным для хроматографии Р (размер

частиц 3 мкм) с размером пор 8 нм;

–температура: 40°С;

–подвижная фаза:

–подвижная фаза А: смешивают 100 мл

ацетонитрила для хроматографии Р, 700 мл воды Р и 200 мл сульфатного буферного раствора рН 2,0 Р, фильтруют и дегазируют;

–подвижная фаза В: смешивают 400 мл

ацетонитрила для хроматографии Р, 400 мл воды Р и 200 мл сульфатного буферного раствора рН 2,0 Р, фильтруют и дегазируют;

–скорость подвижной фазы: 1 мл/мин;

–спектрофотометрический детектор, длина волны 214 нм;

–уравновешивание колонки: в начальных

условиях — не менее 15 мин. Проводят холостой прогон, используя вышеуказанную программу градиентного элюирования;

–объем вводимой пробы: 50 мкл. Пригодность хроматографической си-

стемы (на хроматограмме раствора сравне-

ния идентифицируют пики, соответствующие

фрагментам I, II и III):

–хроматограмма испытуемого раствора и

раствора сравнения должны качественно со-

ответствовать хроматограмме, прилагаемой к

ФСО инсулина человеческого.

–фактор асимметрии: не более 1,5 для пиков фрагментов II и III;

–разрешение: не менее 3,4 между пиками фрагментов II и III.

Результаты: профиль хроматограммы испытуемого раствора, соответствует профилю хроматограммы раствора сравнения.

ПРИМЕЧАНИЕ: время удерживания фрагмента I одинаково для инсулина свиного и человеческого. Время удерживания фрагмента II и IV одинаково для всех инсулинов. Время удерживания фрагмента III одинаково для свиного и бычьего инсулинов.

ИСПЫТАНИЯ

Примеси с молекулярной массой, превышающей молекулярную массу инсулина. Эксклюзионная хроматография (2.2.30):

определение проводят методом внутренней нормализации. Растворы хранят при температуре от 2°С до 8°С и используют в течение 7 дней. При использовании автоматического инжектора поддерживают его температуру от 2°С до 8°С.

Испытуемый раствор. 4 мг испытуемого образца растворяют в 1,0 мл 0,01 М раствора кислоты хлористоводородной.

Раствор сравнения. Используют раствор около 4 мг/мл инсулина, содержащего более 0,4 % белков с высокой молекуляр-

ной массой. Может использоваться инъекционный препарат инсулина, как раствор, так и суспензия, растворенная в достаточным количестве 6 М кислоты хлористоводородной, содержащий обнаруживаемое количество белков с высокой молекулярной массой

или раствор, приготовленный из субстан-

ции инсулина, растворенной в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной. Ин-

сулин, содержащий обнаруживаемое количество белков с высокой молекулярной массой,

может быть приготовлен, если выдержать по-

рошок инсулина при комнатной температуре в течение 10 дней.

Условия хроматографирования:

–колонка длиной 0,3 м и внутренним диаметром не менее 7,5 мм, заполненная силикагелем гидрофильным для хроматографии

Р(размер частиц от 5 мкм до 10 мкм, размер пор от 12 нм до 12,5 нм), пригодным для разделения мономера инсулина от димера и по-

лимеров.

–подвижная фаза: смешивают 15 объе-

мов кислоты уксусной ледяной Р, 20 объемов

ацетонитрила Р, 65 объемов раствора 1 г/л

аргинина Р; фильтруют и дегазируют;

–скорость подвижной фазы: 0,5 мл/мин;

–спектрофотометрический детектор,

длина волны 276 нм;

–уравновешивание: перед использованием новой колонки для хроматографического анализа уравновешивают ее путем повтор-

ных введений раствора инсулина, содержа-

щего белки высокой молекулярной массы (например, не менее трех повторных введений раствора сравнения). Колонку считают урав-

новешенной, если после двух последователь-

ных введений получают воспроизводимые результаты.

–объем вводимой пробы: 100 мкл;

–время хроматографирования: около

35 мин;

Времена удерживания: полимерные инсулиновые комплексы — от 13 мин до 17 мин; ковалентный димер инсулина — около 17,5 мин; мономер инсулина — около 20 мин; соли

—около 22 мин.

Пригодность хроматографической системы: раствор сравнения:

– коэффициент разделения пиков: не менее 2,0 (Hp — высота пика димера относи-

тельно базовой линии; Hv — расстояние между

базовой линией и нижней точкой кривой, разделяющей пики димера и мономера).

Предельное содержание примесей: на хроматограмме испытуемого раствора сумма площадей всех пиков со временем удерживания, меньшим, чем время удерживания основного пика — не более 1,0% от суммы площадей всех пиков.

На хроматограмме испытуемого раствора не учитывают пики со временем удер-

живания большим, чем время удерживания пика инсулина.

Родственные белки. Жидкостная хроматография (2.2.29.), как указано в разделе «Количественное определение», со следующей программой градиентного элюирования:

Растворы хранят при температуре от 2°С до 8°С и используют в течение 24 ч.

Пригодность хроматографической системы указана в разделе «Количественное опре-

деление». При необходимости изменяют относительные пропорции подвижных фаз А и В для обеспечения полного элюирования А21-

дезамидоинсулина человеческого перед нача-

лом градиента. Профиль градиента также может регулироваться для обеспечения полного элюирования всех родственных инсулину примесей.

Объем вводимой пробы: по 20 мкл раство-

ров сравнения (а), (b), (c) и испытуемого раствора. При необходимости изменяют объем вво-

димой пробы от 10 мкл до 20 мкл в соответствии

с результатами определения линейности для

проверки пригодности хроматографической системы, как указано в разделе «Количественное определение».

Время хроматографирования: около

50 мин.

Относительное удерживание (по отношению к основному пику): А21-дезамидоинсулин свиной (небольшой пик, элюирующийся после основного пика на хроматограмме раствора

сравнения (а)) — около 1,3.

Предельное содержание примесей:

–А21-дезамидоинсулин человеческий (не более 2,0%): на хроматограмме испытуемого раствора площадь пика А21-дезамидоинсулина человеческого не должна превышать 2,0% от

суммы площадей всех пиков;

–сумма примесей (не более 2,0%): на хроматограмме испытуемого раствора сумма площадей всех пиков, кроме основного и пика А21дезамидоинсулина человеческого, не должна превышать 2,0% от суммы площадей всех пиков;

только для полусинтетического инсулина человеческого:

–инсулин свиной (не более 1,0%): на хроматограмме испытуемого раствора площадь пика, соответствующего основному пику на хроматограмме раствора сравнения (b), не должна превышать площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (с).

Следующее испытание проводят только для инсулина человеческого, полученного путем ферментативной модификации инсулина свиного.

Проинсулин-подобные иммунореактивные примеси (PLI). Не более 10 ppm в пересчете на сухое вещество. Определение проводят

подходящим по чувствительности иммунохими-

ческим методом (2.7.1), например, радиоимму-

нологическим анализом, с использованием Меж-

дународного Стандартного Реактива проинсули-

на свиного для калибровки метода.

Цинк. Не более 1,0% в пересчете на сухое вещество. Атомно-абсорбционная спектрометрия (2.2.23, метод 1).

Испытуемый раствор. 50,0 мг испытуемого образца растворяют в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной и доводят до объема 25,0 мл этим же растворителем. При необхо-

димости разводят 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной до получения подходя-

щей концентрации (например, от 0,4 мкг/мл до 1,6 мкг/мл Zn).

Растворы сравнения. Используют свежеприготовленные растворы, содержащие 0,40 мкг/мл,

0,80 мкг/мл, 1,00 мкг/мл, 1,20 мкг/мл и 1,60 мкг/мл Zn. Расторы готовят путем разведения эталонного раствора цинкового (5 мг/мл Zn) Р 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной.

Источник излучения: лампа с полым като-

дом для определения цинка.

Длина волны: 213,9 нм.

Генератор атомного пара: воздушноацетиленовое пламя подходящего состава (например, воздух — 11 л/мин, ацетилен — 2 л/мин).

Потеря в массе при высушивании (2.2.32). Не более 10,0%. 0,200 г испытуемого образца сушат при температуре 105°С в течение 24 ч.

Сульфатная зола (2.4.14, метод А). Не более 2,5% в пересчете на сухое вещество. Определение проводят из 0,200 г испытуемого образца.

Бактериальные эндотоксины (2.6.14).

Менее 10 МЕ/мг, если субстанция предназначена для производства лекарственных средств для парентерального применения без последу-

ющей процедуры удаления бактериальных эн-

дотоксинов.

#Остаточные количества органических растворителей (2.4.24). Испытуемый образец должен выдерживать требования статьи (5.4).

#Микробиологическая чистота (2.6.12, 2.6.13, 5.1.4). Инсулин человеческий в условиях испытания не обладает антимикробным действием.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Жидкостная хроматография (2.2.29). Растворы хранят при температуре от 2°С до 8°С и используют в течение 48 ч. При использовании автоматического инжектора поддерживают его температуру от 2°С до 8°С.

Испытуемый раствор. 40,0 мг испытуемого образца растворяют в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной и доводят до объема 10,0 мл этим же растворителем.

Раствор сравнения (а). Содержимое контейнера ФСО инсулина человеческого растворяют в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной до получения концентрации 4,0 мг/мл.

Раствор сравнения (b). Содержимое кон-

тейнера ФСО инсулина свиного растворяют в

0,01 М растворе кислоты хлористоводородной

до получения концентрации 4,0 мг/мл.

Раствор сравнения (с). 1,0 мл раствора сравнения (b) доводят 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной до объема 50,0 мл. К

1,0 мл полученного раствора прибавляют 1,0 мл

раствора сравнения (а).

Раствор сравнения (d). 1,0 мл раствора сравнения (а) доводят 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной до объема 10,0 мл.

Раствор сравнения (e). К 1,0 мл раствора сравнения (а) прибавляют 1,0 мл раствора сравнения (b).

Условия хроматографирования:

–колонка длиной 0,25 м и внутренним диа-

метром 4,6 мм, заполненная силикагелем октадецилсилильным для хроматографии Р с раз-

мером частиц 5 мкм;

–температура: 40°С;

–подвижная фаза: подвижная фаза А —

подвижная фаза В (42:58, об/об), при необходи-

мости состав корректируют.

Следующие растворы готовят и хранят при температуре не ниже 20°С:

–подвижная фаза А: 28,4 г натрия сульфата безводного Р растворяют в воде Р и доводят до объема 1000 мл этим же растворителем; прибавляют 2,7 мл фосфорной кислоты Р; при необходимости доводят до рН 2,3 этаноламином Р; фильтруют и дегазируют;

–подвижная фаза В: 550 мл подвижной фазы А смешивают с 450 мл ацетонитрила Р. Полученный раствор подогревают до температуры не ниже 20°С для предотвращения выпадения осадка (смешивание под-

вижной фазы А с ацетонитрилом — эндотер-

мический процесс), фильтруют и дегазируют;

–скорость подвижной фазы: 1 мл/мин;

–спектрофотометрический детектор, длина волны 214 нм;

–объем вводимой пробы: по 20 мкл растворов сравнения (а), (b), (d), (е) и испытуемого раствора;

Пригодность хроматографической системы:

–разрешение (на хроматограмме раствора сравнения (е) должен быть пик со временем удерживания, соответствующим времени удерживания основного пика на хроматограмме раствора сравнения (b). На хроматограмме раствора сравнения (е) идентифицируют пики, соответствующие свиному и человеческому инсулину):

не менее 1,2 между пиками человеческого и сви-

ного инсулина на хроматограмме раствора срав-

нения (е). При необходимости изменяют концентрацию ацетонитрила в подвижной фазе.

–линейность: площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (а) должна

превышать площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (d) в 10±0,5 раз.

При необходимости изменяют объем вводимой

пробы (10—20 мкл) в зависимости от уровня ли-

нейности детектора.

Суммарное содержание инсулина человеческого (C257H383N65O77S6) и А21-дезамидоинсулина человеческого рассчитывают из площадей соответствующих пиков на хроматограммах испыту-

емого раствора и раствора сравнения (а) и из-

вестного суммарного содержания инсулина человеческого и А21-дезамидоинсулина человеческого в ФСО инсулина человеческого.

ХРАНЕНИЕ

В воздухонепроницаемом контейнере в защищенном от света при температуре не выше

-18°С до момента реализации производителем. После оттаивания инсулин может храниться при

температуре (5±3)°С и использоваться для приготовления лекарственных средств в течение короткого промежутка времени. Для предотвращения абсорбции влаги из воздуха, в процессе

взвешивания инсулин должен быть комнатной

температуры.

МАРКИРОВКА

Указывают метод получения инсулина человеческого: метод ферментативной модификации инсулина свиного или метод, основанный на технологии рекомбинантной ДНК.

ИХТИОЛ

Ichthammolum (# Ichthyolum)

ICHTHAMMOL

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Ихтиол получают дистилляцией из некоторых видов битумных сланцев с последующим сульфированием дистиллята и нейтрализацией полученного продукта раствором аммиака.

Содержит:

–сухое вещество: от 50,0 % (м/м) до 56,0 % (м/м);

–общее количество аммиака (NH3, М.м.

17,03): от 4,5 % (м/м) до 7,0 % (м/м) в пересчете

на сухое вещество;

–органически связанная сера: не менее 10,5 % (м/м) в пересчете на сухое вещество;

–сера в форме сульфата: не более 20,0 % (м/м) от общей серы.

ОПИСАНИЕ (СВОЙСТВА)

Густая черновато-коричневая жидкость. Смешивается с водой и с глицерином, ма-

лорастворим в 96 % спирте, в жирных маслах

и в вазелиновом масле. Образует однородные смеси с ланолином и вазелином.

ПОДЛИННОСТЬ (ИДЕНТИФИКАЦИЯ)

А.1,5 г испытуемого образца растворяют

в15 мл воды Р (раствор А). К 2 мл раствора А

прибавляют 2 мл кислоты хлористоводородной Р. Образуется смолистый осадок. Слива-

ют надосадочный слой жидкости. Осадок частично растворяется в эфире Р.

В. 2 мл раствора А, полученного в идентификации А, дают реакцию на аммония соли и соли летучих оснований (2.3.1).

С. Смесь раствора А и раствора натрия гидроксида разведенного Р, полученную в идентификации В, выпаривают досуха и прокаливают. К полученному остатку прибавляют 5 мл кислоты хлористоводородной разведенной Р. Выделяется газ, окрашивающий

свинцово-ацетатную бумагу Р в коричневый или черный цвет. Полученный раствор филь-

труют. Фильтрат дает реакцию (а) на сульфа-

ты (2.3.1).

ИСПЫТАНИЯ

Кислотность или щелочность. К 10,0 мл

прозрачного фильтрата, полученного как ука-

зано в разделе «Количественное определение. Общее количество аммиака», прибавляют 0,05 мл раствора метилового красного Р. При прибавлении не более 0,2 мл 0,02 М раствора кислоты хлористоводородной или 0,02 М раствора натрия гидроксида окраска раствора должна измениться.

Относительная плотность (2.2.5). От 1,040 до 1,085. Определяют относительную плотность смеси из равных объемов испытуемого образца и воды Р.

Сульфатная зола (2.4.14, метод А). Не более 0,3%. Определение проводят из 1,00 г испытуемого образца

# Микробиологическая чистота (2.6.12, 2.6.13, 5.1.4). Ихтиол в условиях испытания обладает антимикробным действием. Посев на питательную среду №1 проводят из разведения 1:20 с добавлением раствора 40 г/л полисорбата 80 Р; на питательную среду

№8: для выявления Staphylococcus aureus

— из разведения 1:50 с добавлением раствора 40 г/л полисорбата 80 Р, для выявления Pseudomonas aeruginosa — из разведения 1:100 с добавлением раствора 40 г/л полисорбата 80 Р; на питательные среды № 2 и

№3 — из разведения 1:10.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Сухое вещество. 1,000 г испытуемого образца помещают в предварительно взвешенную колбу, содержащую небольшую стеклянную палочку и 2 г песка Р, предварительно высушенного до постоянной массы. Нагревают на водяной бане в течение 2 ч при

частом перемешивании и высушивают при температуре от 100°С до 105°С до тех пор, пока разница между двумя последовательными взвешиваниями будет не более 2,0 мг; повторное взвешивание проводят после 1 ч высушивания.

Общее количество аммиака. 2,50 г испы-

туемого образца растворяют в 25 мл теплой

воды Р. Полученный раствор количественно пе-

реносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 200 мл раствора натрия хлорида Р, доводят водой Р до объема 250,0 мл и филь-

труют, отбрасывая первые 20 мл фильтрата. К

100,0 мл прозрачного фильтрата прибавляют

25 мл раствора формальдегида Р, нейтрализованного по раствору фенолфталеина Р1, и титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до

появления розового окрашивания.

1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида

соответствует 1,703 мг NH3.

Органически связанная сера. В фарфоро-

вом тигле, вместимостью около 50 мл смеши-

вают 0,500 г испытуемого образца, 4 г натрия карбоната безводного Р и 3 мл метиленхлорида Р, нагревают и перемешивают до полного ис-

парения метиленхлорида. Прибавляют 10 г грубоизмельченного меди (II) нитрата Р, тщатель-

но перемешивают и очень осторожно нагрева-

ют на слабом огне. После прекращения началь-

ной реакции температуру медленно повышают до почернения большей части смеси. Охлаждают, помещают тигель в большой стакан, при-

бавляют 20 мл кислоты хлористоводородной Р

и, после прекращения реакции, 100 мл воды Р. Кипятят до полного растворения оксида меди. Полученный раствор фильтруют, прибавляют 400 мл воды Р, нагревают до кипения, прибавляют 20 мл раствора бария хлорида Р1, выдерживают в течение 2 ч и фильтруют. Остаток на фильтре промывают водой Р, сушат и прокаливают при температуре (600±50)°С до тех пор, пока разница между двумя последовательными взвешиваниями не будет менее 0,2 % от массы остатка.

1 г остатка соответствует 0,1374 г общего количества серы. Общее количество серы рассчитывают в процентах.

Содержание органически связанной серы рассчитывают по разнице между общим количество серы и количеством серы в форме сульфата.

Сера в форме сульфата. 2,000 г испытуе-

мого образца растворяют в 100 мл воды Р, при-

бавляют 2 г меди (II) хлорида Р, растворенного в 80 мл воды Р, доводят водой Р до объема 200,0 мл, встряхивают и фильтруют. 100,0 мл фильтрата нагревают почти до кипения, прибавляют 1 мл кислоты хлористоводородной Р и, по каплям, 5 мл раствора бария хлорида Р1 и

нагревают на водяной бане. Фильтруют, остаток на фильтре промывают водой Р, сушат и прокаливают при температуре (600±50)°С до тех пор, пока разница между двумя последовательными

взвешиваниями не будет менее 0,2 % от массы остатка.

1 г остатка соответствует 0,1374 г серы в форме сульфата.

Содержание серы в форме сульфата рассчитывают в процентах.

ЙОД

Iodum

IODINE

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Йод содержит не менее 99,5 % и не более 100,5 % I.

ОПИСАНИЕ (СВОЙСТВА)

Серовато-фиолетовые ломкие пластинки или мелкие кристаллы с металлическим блеском.

Очень мало растворим в воде, очень легко

растворим в концентрированных растворах

йодидов, растворим в спирте, малорастворим

в глицерине.

Медленно улетучивается при комнатной

температуре.

ПОДЛИННОСТЬ (ИДЕНТИФИКАЦИЯ)

А. Несколько кусочков испытуемого образ-

ца нагревают в пробирке. Выделяются пары фиолетового цвета, и образуется кристаллический суб-лимат синевато-фиолетового цвета.

В. К насыщенному раствору испытуемого образца прибавляют раствор крахмала Р.

Появляется синее окрашивание. Нагревают до обес-цвечивания. При охлаждении окрашивание появляется снова.

ИСПЫТАНИЯ

Раствор S. 3,0 г испытуемого образца растирают с 20 мл воды Р, фильтруют, фильтр промывают водой Р и фильтрат дово-

дят до объема 30 мл этим же растворителем.

К полученному раствору прибавляют 1 г порошка цинка Р. После обесцвечивания раствор фильтруют, фильтр промывают водой Р и

фильтрат доводят до объема 40 мл этим же растворителем.

Бромиды и хлориды. Не более 0,025 % (250 ppm). К 10 мл раствора S прибавляют 3 мл

раствора аммиака Р и 6 мл раствора серебра нитрата Р2. Фильтруют, фильтр промывают водой Р и фильтрат доводят до объема

20 мл этим же растворителем. К 10 мл полу-

ченного раствора прибавляют 1,5 мл кислоты азотной Р. Через 1 мин полученный раст-

вор по степени мутности не должен превы-

шать раствор, приготовленный в то же время

путем смешивания 10,75 мл воды Р, 0,25 мл

0,01 М раствора кислоты хлористоводородной, 0,2 мл кислоты азотной разведенной Р и 0,3 мл раствора серебра нитрата Р2.

Нелетучие вещества. Не более 0,1 %. 1,00 г испытуемого образца нагревают в фарфоровой чашке на водяной бане до удаления йода. Остаток сушат при температуре от 100°С до 105°С. Масса полученного остатка

не должна превышать 1 мг.

# Микробиологическая чистота (2.6.12, 2.6.13, 5.1.4). Калия бромид в условиях испыта-

ния не обладает антимикробным действием

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

2,000 г испытуемого образца растворяют

в воде Р и доводят до объема 100,0 мл этим же

растворителем. К 10,0 мл полученного раствора прибавляют 50 мл воды Р, 5 мл кислоты азотной разведенной Р, 25,0 мл 0,1 М раствора серебра нитрата, 2 мл дибутилфталата Р и встряхивают. Титруют 0,1 М раствором аммония тиоцианата, используя в качестве индикатора 2 мл раствора железа (III) аммония сульфата Р2, энергично встряхивая вблизи точки эквивалентности.

1 мл 0,1 М раствора серебра нитрата со-

ответствует 11,90 мг КВr.

Содержание КВr в процентах рассчитывают по формуле:

a − 3,357b ,

где:

а — содержание КВr и KCl, полученное при

количественном определении рассчитанное как

содержание КВr;

b — содержание хлора, полученное в испытании на хлориды.

КАЛИЯ ГИДРОАСПАРТАТ ГЕМИГИДРАТ

Kalii hydrgenaspartas hemihydricus

POTASSIUM HYDROGEN ASPARTATE HEMIHYDRATE

HNH2

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Калия гидроаспартат гемигидрат содержит не менее 99,0 % и не более 101,0 % калия (2S)-

2-аминобутандиоата в пересчете на безводное

вещество.

ОПИСАНИЕ (СВОЙСТВА)

Белый или почти белый порошок, либо кристаллический порошок, либо бесцветные кристаллы.

Легкорастворим в воде, практически нерастворим в 96 % спирте и в метиленхлориде.

ПОДЛИННОСТЬ (ИДЕНТИФИКАЦИЯ)

А. Испытуемый образец выдерживает испытание «Удельное оптическое вращение» как указано в разделе «Испытания».

В. Просматривают хроматограммы, полученные в испытании «Нингидрин-положительные вещества». На хроматограмме испытуемого

раствора (b) обнаруживается основное пятно,

соответствующее по расположению, цвету и раз-

меру основному пятну на хроматограмме раствора сравнения (а).

С. Испытуемый образец дает реакцию (b) на калий (2.3.1).

ИСПЫТАНИЯ

Раствор S. 2,5 г испытуемого образца растворяют в воде, свободной от углерода диоксида, Р, приготовленной из воды дистиллированной Р, и доводят до объема 100 мл этим же

растворителем.

Прозрачность (2.2.1). Раствор S должен быть прозрачным.

Цветность (2.2.2, метод II). Раствор S

должен быть бесцветным.

рН (2.2.3). От 6,0 до 7,5. Измеряют рН раствора S.

Удельное оптическое вращение (2.2.7). От +18,0 до +20,5 в пересчете на безводное веще-

ство. 0,50 г испытуемого образца растворяют в

растворе 515 г/л кислоты хлористоводородной

Ри доводят до объема 25,0 мл этим же растворителем.

Нингидрин-положительные вещества.

Тонкослойная хроматография (2.2.27).

Испытуемый раствор (а). Раствор S. Испытуемый раствор (b). 1,0 мл испыту-

емого раствора (а) доводят водой Р до объема 10,0 мл.

Раствор сравнения (а). 25 мг ФСО калия гидроаспартата гемигидрата растворяют в воде Р

и доводят до объема 10 мл этим же растворителем.

Раствор сравнения (b). 1,0 мл испытуемого раствора (b) доводят водой Р до объема 20,0 мл.

Раствор сравнения (с). 10 мг ФСО глутаминовой кислоты и 10 мг испытуемого образца

растворяют в воде Р и доводят до объема 25 мл этим же растворителем.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля Р.

Подвижная фаза: кислота уксусная ледяная

Р— вода Р — бутанол Р (20:20:60, об/об/об). Наносимый объем пробы: 5 мкл.

Фронт подвижной фазы: не менее 2/3

высоты пластинки.

Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку опрыскивают раствором нингидрина Р и нагревают при температуре от 100°С до 105°C в течение 15 мин.

Пригодность хроматографической системы: раствор сравнения (с):

–на хроматограмме обнаруживаются два полностью разделенных основных пятна.

Предельное содержание примесей:

–любая примесь (не более 0,5%): на хроматограмме испытуемого раствора (а) любое пятно, кроме основного, должно быть не интенсивнее пятна на хроматограмме раствора сравнения (b).

Хлориды (2.4.4). Не более 0,02% (200 ppm).

К10 мл раствора S прибавляют 5 мл воды Р.