6)Культуры клеток ткани, их классификация и использование.

Культура клеток - это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона), лучше - из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Культуры клеток - наиболее совершенная из лабораторных система для культивирования вирусов. В вирусологической практике культуры клеток чаше всего используют для:

- первичного обнаружения вирусов и их выделения из патологического материала; - накопления вируса при изготовлении вакцин и диагностикумов, поддержания вирусных штаммов в лаборатории;

- титрования вирусов;

- как тест-объект в реакции нейтрализации.

Различают следующие виды культур клеток: первично-трипсинизированные, субкультуры, перевиваемые, диплоидные, суспензионные и культуры клеток на микроносителях (сефадекс, силикагель и т.д.).

Первично-трипсинизированные культурыклеток - клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. Субкультуры получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена (трипсина) и ресуспендирования в новой питательной среде. Через 2-3 суток вырастает новый монослой. Перевиваемые культуры клеток - клетки, снятые, перевитые, пассажированные из первичных клеток с повышенной активностью роста более 10 раз. Они способны размножаться вне организма неопределенно длительное время.

Диплоидные культуры клеток- клетки, стабилизированные в процессе культивирования и сохранившие в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, но имеющие ограниченные возможности пассирования (до 50 раз). Их получают также из первичных культур клеток.

Суспензионные - это культуры клеток, выращенные в свободно суспендированном состоянии. Таким образом культивируются только перевиваемые клетки. Культуры клеток, полученные методами суспензионного культивирования и формирующие монослой на микроносителях (силикагель, сефадекс), называют поверхностно-зависимые, их можно выращивать из первичных, субкультур и диплоидных клеток.

7)Особенности культивирования риккетсий, хламидий, микоплазм.

Риккетсии и хламидии – бактерии, которые, как и вирусы, являются облигатными внутриклеточными паразитами. Поэтому для их культивирования применяются:

а)тканевые культуры;

б)куриные эмбрионы;

в)лабораторные животные.

Культивирование риккетсий проводят на переживающих тканях в жидкой среде Мейтлендов (раствор Тироде и сыворотка) при 37С 10-14 дней или на Тироде – сывороточным агаре с добавлением на поверхность измельченной эпителиальной ткани при 37С 6-10 дней.

Широко используется культивирование в 8-12-дневном курином эмбрионе. Эмбрион заражают в полость желточного мешка или на хорион-аллантоисную оболочку. Зараженные яйца помещают в термостат при 37С на 6-7 дней. Этот метод используется при изготовлении вакцин и диагностических препаратов на риккетсий. Риккетсии культивируют в организме белых мышей, которых заражают интраназально. В легких мышей накапливается большое количество риккетсий.

Риккетсии выращивают по методу Вейгля и Мосинга. Для этого платяных вшей заражают взвесью риккетсий путем введения в кишку через анальное отверстие с помощью специальных капилляров.

Пшеничнов и Райхер разработали метод культивирования риккетсий на личинках вшей, которых кормят дефибринированной кровью с риккетсиями через мембрану кожи трупа.

Культивирование вирусов.

Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты. Они размножаются в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, поэтому методы культивирования вирусов отличаются от методов культивирования бактерий.

Методы культивирования.

1. На лабораторных животных. Заражают животных (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшино), которые чувствительны к определенным вирусам: хорьков - вирусом гриппа, кроликов - вирусом бешенства, обезьян - вирусом полиомиелита. Индикация (обнаружение) вируса проводится по признакам заболевания. Недостаток метода - не все вирусы можно культивировать на животных, например, животные невосприимчивы к вирусам человека.

2. В куриных эмбрионах. Заражают куриный эмбрион (аллонтоисная полость, хорион-аллонтоисная оболочка, амниотическая полость, желточный мешок, сам эмбрион). Куриный эмбрион – очень удобен. Он защищен от попадания других микробов (стерильный), техника работы с ним проста, можно накопить большое количество вирусов. Индикация:

а)по специфическим поражениям на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона,

б)по реакции склеивания эритроцитов – реакции гемагглютинации (РГА).

Недостатки метода:

а)не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) можно вырастить в куриных эмбрионах;

б)невозможно обнаружить микроб без вскрытия эмбриона;

в)в нем много загрязняющих белков и других соединений.

3. В тканевых культурах. Тканевые культуры или клеточные культуры – клетки, выращенные вне организма на искусственных питательных средах. Для их приготовления используют чаще всего эмбриональные и опухолевые ткани. Метод тканевых культур разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток. Для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную культуру клеток. Способы обнаружения (индикации) вирусов в тканевой культуре. Вирусы можно обнаружить следующим образом.

1. По цитопатическому действию (ЦПД). В результате размножения вирусов в клетках происходят морфологические изменения клеток (вакуолизация цитоплазмы, деструкция митохондрий, округление клеток). Часть клеток погибает и отслаивается от стекла. Вместо сплошного монослоя остаются отдельные клеточные островки. ЦПД обнаруживают под микроскопом (8). По ЦПД можно не только обнаружить, но и идентифицировать вирусы. Например, вирус полиомиелита вызывает мелкозернистую деструкцию клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений клеток в виде виноградных гроздьев; вирус кори вызывает образование симпластов – многоядерных клеток.

2. По образованию включений. Включения - скопления вирусов в клетках. Они имеют различную форму и размеры. Их окрашивают по Романовскому-Гимзе или флюорохромами и наблюдают под микроскопом.

3. По гемадсорбции. Клетки, зараженные вирусами, могут адсорбировать эритроциты. Вирусы выходят на поверхность клеток и связывают эритроциты. Эритроциты добавляют к культуре и через некоторое время промывают физиологическим раствором. На поверхности клеток под микроскопом видны прилипшие эритроциты в виде разнообразных фигур;.

4. По реакция гемагглютинации. Гемагглютинация - склеивание эритроцитов под влиянием вирусов. Эритроциты добавляют к культуральной жидкости. Если в ней есть вирусы, то эритроциты склеиваются.

5. По "цветной" реакции. Клетки культуры выращиваются на жидкой среде с индикатором (метиленовым красным). Индикатор изменяет цвет (с красного на желтый) под действием кислых продуктов метаболизма при росте нормальных клеток. Если клетки заражены вирусом, то нормальный метаболизм нарушается, кислые продукты не образуются и индикатор не изменяет цвет. Таким образом, признаком размножения вирусов в клетках культуры является сохранение красного цвета среды.