- •Предмет, завдання і методологія біотехнології рослин
- •Історія розвитку методу культури клітин, тканин та органів рослин
- •Організація і обладнання біотехнологічної лабораторії
- •Посуд, інструменти і матеріали
- •Миття посуду
- •Методи стерилізації посуду
- •Методи стерилізації інструментів
- •Контрольні запитання і завдання
- •Живлення культури тканин
- •Мінеральне живлення
- •Вуглеводневе живлення
- •Вітаміни
- •Стимулятори росту
- •Фітогормони
- •Рослинні екстракти
- •РН – середовища
- •Приготування живильних середовищ
- •Стерилізація живильних середовищ
- •Стерилізація рослинного матеріалу
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих органів і зародків
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих клітин і тканин
- •Культура калюсних тканин
- •Особливості калюсних клітин
- •Генетика калюсних клітин
- •Культура клітинних суспензій
- •Культивування ізольованих клітин
- •Методи оцінки результатів
- •Мікроклональне розмноження рослин
- •Методи мікроклонального розмноження рослин
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Кріоконсервація клітин рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Клітинна селекція
- •Спонтанні та індуковані мутанти
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура рослинних клітин і речовини вторинного синтезу
- •Фактори, які впливають на вихід продуктів
- •Компоненти середовища
- •Фізичні фактори
- •Селекція і відбір
- •Утворення вторинних речовин в культурах рослинних тканин
- •Глікозиди
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих протопластів і соматична гібридизація
- •Виділення і очистка ізольованих протопластів картоплі
- •Виділення протопластів із мезофілу листка
- •Виділення протопластів із культури клітин
- •Культивування ізольованих протопластів
- •Умови культивування протопластів
- •Злиття ізольованих протопластів
- •Селекція соматичних гібридів
- •Генетична трансформація
- •Вектори для генетичної трансформації рослин
- •Плазміди агробактерій як вектори для трансформації
- •Вектори на основі днк-вмісних вірусів рослин
- •Методи перенесення чужинних генів у рослини
- •Трансгени і екологія
- •Контрольні запитання і завдання
- •Практичний курс Приготування і стерилізація живильних середовищ
- •Таблиця 8
- •Робота 1. Приготування маточних розчинів для середовища Мурасиге і Скуга (мс)
- •Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (мс). Стерилізація середовища автоклавуванням
- •Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)
- •Стерилізація рослинного матеріалу Робота 4. Стерилізація насіння і вирощування асептичних рослин
- •Робота 5. Стерилізація бульб, коренеплодів і кореневищ
- •Робота 6. Стерилізація листків
- •Робота 7. Стерилізація меристем
- •Калюсна культура Робота 8. Отримання первинного калюсу із різних експлантатів асептичних рослин
- •Робота 9. Дослідження явища фізіологічної полярності
- •Робота 10. Отримання перевивної калюсної культури
- •Робота 11. Дослідження впливу співвідношення ауксин:цитокінін у живильному середовищі на ріст калюсної тканини та її тип
- •КлітиннА суспензіЯ Робота 12. Отримання клітинної суспензії з калюсної тканини
- •Мікроклональне розмноження рослин Робота 13. Мікроклональне розмноження рослин живцями
- •Робота 14. Стебловий органогенез із листкових дисків тютюну
- •Таблиця 15 Середовища для мікроклонального розмноження тютюну та моркви (1 л середовища)
- •Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну
- •Робота 16. Прямий ембріогенез
- •Хід роботи
- •Робота 17. Непрямий ембріогенез
- •Культура ізольованих протопластів вищих рослин Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин
- •Словник термінів
- •Список літератури
Умови культивування протопластів
Середовище. Основна вимога до середовищ полягає у тому, щоб у процесі культивування не відбувалося руйнування ізольованих протопластів, бо до утворення клітинної стінки протопласти – це дуже ніжні структури, і щоб воно було оптимальним для утворення клітинами колоній.
Як правило, середовище має складатися з осмотичного стабілізатора, неорганічних сполук, джерел вуглецю, вітамінів, джерел органічного азоту і фітогормонів. Як осмотичний стабілізатор можна використовувати маніт, сорбіт та їхні комбінації. Склад мінеральних солей відповідає складу мінеральних солей в середовищах для культивування клітин рослин. Можна міняти співвідношення амонійного та нітратного азоту залежно від потреб клітин, збільшувати концентрацію CaCl2 для стабілізації клітинної стінки, що формується.
Як джерело вуглецю використовують глюкозу, сахарозу, їх суміш. Сахароза не завжди може бути придатним компонентом середовища для протопластів. У деяких випадках додають рибозу, ксилозу, фруктозу, манозу та інші цукри.
До складу вітамінів при культивуванні ізольованих протопластів мають входити тіамін HCl (В1), піридоксин HCl (В6) і нікотинова кислота (РР). При невеликій щільності висіву необхідно додавати й інші вітаміни.
Як джерела азоту до середовища додають амінокислоти, найчастіше використовують гідролізат казеїну, який є сумішшю амінокислот і додають його в тому разі, коли в середовищі недостатній вміст неорганічного азоту, а його концентрацію вже не можна збільшити.
Ауксини і цитокініни необхідні для клітинного ділення і подальшого розвитку рослинних клітин. Як правило використовують 2,4-Д, НОК, кінетин, БАП, зеатин. Оптимальні концентрації фітогормонів підбирають у кожному конкретному випадку.
Важливого значення при культивуванні ізольованих протопластів набувають і інші умови. Так, рН середовища має становити від 5,4 до 5,8.
Температура, при якій культивують ізольовані протопласти варіює в значній мірі залежно від виду. Так, для протопластів одного представника злаків – росички (Digitaria sanguinalis) оптимальною є температура 30 °С, а для пшениці 22 °С. Більшість ізольованих протопластів культивується при температурі 24 – 26 °С.
Що стосується інтенсивності світла, то у більшості випадків дослідники прийшли до висновку, що світло високої інтенсивності згубно впливає на ізольовані протопласти. Але оптимальні значення освітленості варіюють у широких межах. Так, люцерна утворює колонії у абсолютній темряві (100 – 700 Лк), а для протопластів Nemesia strumosa (немезія – норичникові) оптимальний ріст спостерігали при освітленості 80 000 Лк.
Суттєвим фактором культивування є щільність висіву протопластів. При дуже низькій щільності протопласти часто не діляться. З іншого боку, при дуже високій щільності труднощі виникають на пізніших стадіях, коли на ріст можуть впливати продукти обміну, що виділяються. Оптимальна щільність протопластів у культурі 104 – 106 пр/мл. Дещо компенсувати високу щільність висіву протопластів можна додавши до живильного середовища активоване вугілля.
У процесі культивування ізольовані протопласти регенерують нову клітинну стінку і перетворюються у звичайну клітину, яка культивується in vitro. Саме ця обставина робить ізольовані протопласти зручною моделлю для вивчення формування целюлозних мікрофібрил. Дрібні протопласти, отримані із меристематичної тканини, починають формувати стінку приблизно через 1,5 години після початку культивування і через добу клітинна стінка повністю покриває протопласти. Протопласти із дорослих листків мають більші розміри і регенерують стінку значно повільніше: через 4 години з’являються перші осередки новоутворення стінки, а через добу стінка ще не утворює суцільний покрив.
Спостереження за регенерацією клітинної стінки у протопластів скімії показали, що у цей період спостерігається сильне збільшення ендоплазматичного ретикулума. Припускають, що у шорстких ділянках ендоплазматичного ретикулума утворюються ферменти, які беруть участь у синтезі попередників целюлози.
У ході регенерації целюлозних компонентів клітинної стінки, можна виділити два періоди:
Ій період – синтез іде дуже повільно і приводить до утворення незначної кількості целюлози;
ІІй період – починається приблизно через 8 діб після культивування, і характеризується різким збільшенням (у 5 разів) швидкості синтезу целюлози.
Заново синтезована клітинна стінка не містить пектинові речовини.
Як правило, ізольовані протопласти більшості видів рослин через добу утворюють клітинну стінку, а через 2 – 3 доби відбувається перший поділ. Другий поділ відбувається на 7 – 8 добу, потім утворюється 8-клітинні колонії і на 21 – 30 добу культивування формуються багатоклітинні колонії.
При перенесенні їх на агарове середовище утворюється калюс, із якого можна отримати цілу рослину. Регенерація рослин відбувається або через ембріогенез, або через утворення калюсу з подальшою індукцією морфогенезу.