АОА

Ðèñ. 7. Хроматограммы стандартного раствора тиосульфатиона с концентрацией 100 мг л (1) и пробы, разбавленной в 100 раз (2). Состав элюента — 2,2 мМ Na2CO3 è 2,6 ìÌ NaHCO3, скорость элюирования — 1,7 мл мин, объем дозирующей петли — 30 мкл

процесс, понять взаимосвязь его параметров и степень влияния каждого из них на конечный результат.

Литература

1.Madden J. E., Haddad P. R. J. Chromatogr. A. 1998. V. 829.

P.65 – 80.

2.Madden J. E., Haddad P. R. J. Chromatogr. A. 1999. V. 850.

P.29 – 41.

3.Haddad P. R., Nesterenko P. N., Buchberger W. J. Chromatogr.

A.2007, doi:10.1016 j.chroma.2007.10.022.

ÓÄÊ 543.257.1

Ðèñ. 8. Хроматограммы образца, разведенного в 110 раз (1) и стандартного раствора сульфида натрия с концентрацией 9,6 мг л по сере (2). Трехколоночная схема: разделяющая колонка 5 120 мм с КанК-АСт, подавительная колонка 5 120 мм с катионообмеником СПС-SAC-8 в H+-форме, проявительная колонка 3 100 мм с тем же катионообмеником в K+-форме. Элюент — 3 мМ NaOH; расход — 1,9 мл мин, объем дозирующей петли — 30 мкл

4.Долгоносов А. М., Прудковский А. Г. ÆÀÕ. 2002. Ò. 57. ¹ 12. Ñ. 1276 – 1283.

5.Никитина Л. П., Меняйлов И. А., Шапарь В. Н. Вулканология и сейсмология. 1989. ¹ 4. С. 3 – 8.

6.Ïàò. 1161513 ÐÔ.

7.Долгоносов А. М., Прудковский А. Г., Колотилина Н. К.

ÆÀÕ. 2007. Ò. 62. ¹ 11. Ñ. 1162 – 1171.

8.Колотилина Н. К., Долгоносов А. М. ÆÀÕ. 2005. Ò. 60. ¹ 8. Ñ. 832 – 836.

Ðост интереса к разнообразным аспектам противоокислительной защиты живого организма продиктован новыми, относительно недавно полученными дан-

1ГОУ ВПО Уральский государственный экономический университет, г. Екатеринбург, Россия.

2ФГУП Уральский НИИ метрологии, г. Екатеринбург, Россия.

ными о вкладе свободнорадикальных процессов в формирование и ускорение многочисленных патологических процессов в организме человека [1]. Вещества, способные снижать концентрацию свободных радикалов в организме и защищать макромолекулы живой клетки, получили название антиоксидантов (АО). Оценка содержания этих веществ в природных

Ðèñ. 1. Схемы наиболее распространенных методов определения АОА

или созданных на их основе объектах (продуктах питания, биологически активных добавках, лекарственных препаратах), которые могут потенциально служить их источниками, необходима для выработки адекватной диеты и терапии.

Фрукты, овощи и продукты питания, произведенные на их основе, содержат большое количество разнообразных веществ, способных выступать в качестве антиоксидантов. Ниже приведены данные о содержании основных веществ, которые наряду с аскорбиновой кислотой обеспечивают антиоксидантную активность (АОА) этих продуктов [2]:

Перечисленные вещества относятся к классу полифенольных соединений. Таким образом, употребле-

ние овощей, фруктов, а также приготовленных из них напитков способно снизить риск развития болезней, связанных с дисбалансом прооксидантов и антиоксидантов в организме [3]. Этим объясняется интерес как к составу веществ, обеспечивающих антиоксидантные свойства, так и к определению общей антиоксидантной активности этих объектов, т.е. к способности чистых веществ или сложных объектов нейтрализовать свободные радикалы (СР) (O2 , HO· и др.) и активные

формы кислорода (АФК) (H2O2, O12 и др.). В настоя-

щее время становится очевидным, что интерес к АОА различных объектов перерос рамки фундаментальных исследований. Определение АОА весьма важно для медицины, фармакологии, производства пищевых продуктов и биодобавок.

В связи с этим актуальной задачей является разработка доступных методов и приборов, позволяющих проводить массовый мониторинг АОА различных объектов. Разнообразие состава и механизмов действия антиоксидантов при разных путях протекания свободнорадикальных процессов делает особенно привлекательным поиск достоверных способов суммарного определения антиоксидантных свойств. Большинство существующих на настоящий момент методов определения общей антиоксидантной активности основано на принципах конкурентного анализа, когда антиоксиданты исследуемого образца препятствуют образованию индикаторного вещества (чаще всего долгоживущего свободного радикала) и подавляют в той или иной степени развитие сигналообразующей реакции. Круг способов регистрации сигналообразующей реакции зависит от природы индикаторного соединения и включает спектрофотометрические, флуориметрические методики, измерение электрохимиче- ских сигналов, регистрацию электронного парамагнитного резонанса и некоторые другие [4 – 6].

Методы определения АОА

Наиболее распространены следующие спектрофотометрические и флуориметрические методики: TEAC, ORAC, TRAP, FRAP. На рис. 1 представлены общие схемы реализации перечисленных методов.

Метод определения эквивалентов Тролокса

[Trolox equivalent capacity assay (TEAC)] основан на способности антиоксидантов восстанавливать радикальные катионы 2,2-азинобис(3-этил бензотиазолин 6-сульфонат)а (ABTS) и тем самым ингибировать поглощение в длинноволновой части спектра (600 нм) [7]. Существенным недостатком метода является двухступенчатая реакция получения радикала. Это удлиняет время проведения анализа и может увеличить разброс результатов, несмотря на то что для анализа используют стандартизованный набор реактивов.

Определение способности абсорбировать кислородные радикалы [Oxygen radical absorption capacity (ORAC)] [8]. В этом методе регистрируют флуорес-

ценцию субстрата (В-фикоэритрина или флуоресцеина), которая возникает в результате его взаимодействия с АФК. Если в исследуемом образце есть антиоксиданты, то наблюдают уменьшение флуоресценции по сравнению с контрольным образцом.

Исследование общей способности к улавливанию радикалов [Total radical trapping parameter assay (TRAP)] [9]. В этом методе используют способность антиоксидантов взаимодействовать с пероксильным радикалом 2,2-азобис(2-амидинопропан)дигидрохло- рид (AAPH). Модификации TRAP состоят в способах регистрации аналитического сигнала. Чаще всего на завершающей стадии анализа перокси-радикал AAPH взаимодействует с люминесцирующим (люминол), флуоресцирующим (дихлорофлюоресцин-ди- ацетат, DCFH-DA) или другим оптически активным субстратом.

Âкачестве стандарта для методов TEAC, ORAC

èTRAP используют водорастворимое производное витамина Е — Trolox (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметил- хроман-2-карбокси кислоту).

Железовосстанавливающая антиоксидантная способность [Ferric reducing antioxidant power assay (FRAP)]. Здесь используется реакция восстановления Fe (III)-трипиридилтриазина äî Fe (II)-трипиридил- триазина, который имеет ярко-синее окрашивание и полосу поглощения при л = 593 нм [10]. Количество антиоксидантов в данном случае пропорционально количеству образовавшегося окрашенного вещества. Однако этим методом невозможно определение некоторых антиоксидантов, например глутатиона.

К сожалению, перечисленные выше методы оценки АОА не оперативны, требуют высококвалифицированного персонала и применения дорогостоящего оборудования. Кроме того, для получения АФК часто применяют ферментативные реакции или долгоживущие радикалы, что значительно повышает стоимость анализа.

Взаимодействие антиоксидантов со свободными радикалами и активными формами кислорода в водных средах является донорно-акцепторным, что делает весьма целесообразным изучение этого взаимодействия с использованием электрохимических

Таблица 1. Электрохимические методы определения АОА

методов, которые характеризуются высокой чувствительностью, быстротой, относительно невысокой стоимостью необходимого оборудования и реактивов, а значит, и анализа в целом. В настоящее время существует ряд подходов к определению АОА с помощью электрохимических методов (табл. 1).

Благодаря донорно-акцепторному характеру реакции между антиоксидантами и свободными радикалами возможно использование циклической вольтамперометрии (ЦВА) для исследования АО. Антиоксидантные свойства в этом случае оцениваются как со- четание двух параметров. Параметр Emax необходим для идентификации веществ, образующих пики тока при анодной развертке. Величина пика анодного тока или площадь под анодной кривой отражают концентрацию антиоксидантов. С помощью метода ЦВА исследовали водные, ацетонитрильно-метанольные, эта- нольно-гексановые экстракты гомогенатов различных органов крыс, плазму крови здоровых людей, пациентов с поражением почек, после трансплантации костного мозга, водно-ацетонитрильные экстракты овощей и фруктов, а также молоко [11 – 13]. Результаты исследований показали, что на количество анодных волн и величину Emax оказывают существенное влияние не только качество поверхности рабочего электрода и другие особенности проведения ЦВА, но и “матрица” исследуемого объекта. Расположение максимумов тока на анодных кривых, полученных для экстрактов различных органов, при прочих равных условиях может смещаться в пределах более чем 200 мВ. Такое смещение, как и появление дополнительных анодных волн, требует применения длительных исследовательских процедур, подтверждающих состав антиоксидантов. Кроме того, близость Emax при необходимости учета количества электричества делает невозможной точную количественную оценку АОА.

Использование биосенсоров, модифицированных супероксиддисмутазой (СОД) или цитохромом C, обеспечивает высокую специфичность методики [14, 15]. Тем не менее сложная процедура приготовления такого сенсора и относительно небольшое время его службы являются существенными недостатками этого метода.

Ðèñ. 2. Схема потенциометрического метода определения АОА с использованием медиаторной системы

Избежать указанных выше недостатков позволяет безферментативный способ получения супероксиданион радикала O2 за счет электровосстановления

кислорода на катоде. Однако, как показали результаты экспериментов, в данном случае в качестве антиоксидантов регистрируются вещества, таковыми не являющиеся (редуцирующие сахара, гуминовые кислоты) [16, 17].

Разработан также способ оценки антиоксидантных свойств, основанный на кулонометрическом определении электрогенерированных титрантов [Cl2, I2, Br2, Ag (I) и др.] [18 – 20]. Данные, полученные этим методом, достаточно хорошо коррелируют с результатами, полученными хемилюминесцентным методом.

Ранее был предложен потенциометрический метод определения АОА с использованием медиаторной системы [21]. На рис. 2 представлена общая схема этого метода.

Для определения антиоксидантной активности потенциометрическим методом использовали хими- ческое взаимодействие антиоксидантов с медиаторной системой K3[Fe(CN6)] K4[Fe(CN6)], которое приводило к изменению ее окислительно-восстано- вительного потенциала. Использование редокс-пары K3[Fe(CN6)] K4[Fe(CN6)] в качестве медиатора обусловлено тем, что ее потенциал оптимальным образом отвечает условию

ER0 R EAO0 ox red EAO0 ox AO ,

Таблица 2. Результаты единичных измерений АОА свежеприготовленных соков

Концентрацию АОА рассчитывают, используя выражение

X cox cred ,

1

ãäå = 10(E1 E2 )d cred cox; d = 2,3RT nF, n = 1; E1, E2 — потенциалы, устанавливающиеся в системе до и после

введения анализируемого источника антиоксиданта, В; cox — концентрация окисленной формы медиатора, моль дм3; cred — концентрация восстановленной формы медиатора, моль дм3; X — концентрация АО, вступившего в реакцию, моль-экв. дм3.

Таким образом, для определения концентрации АО существенной является разность потенциалов, устанавливающихся в системе до и после введения анализируемого источника антиоксиданта: ДE = E1 –

– E2. В табл. 2 приведены результаты единичных измерений АОА некоторых продуктов питания.

В качестве средств измерения использовали многофункциональный потенциометрический анализатор МПА-1 (НПВП “Ива”, Россия). Рабочим электродом служил платиновый ОРП электрод (Phoenix, США) или платиновый планарный электрод (НПВП “Ива”, Россия), электрод сравнения — стандартный хлорсеребряный.

Получены высокие коэффициенты корреляции результатов определения АОА потенциометрическим и другими методами, включая описанные выше. В ка- честве объектов исследования в корреляционных исследованиях при сравнении с методом перекисного окисления липидов и фотоколориметрическим методом с использованием 2,2-дифенил-1-пикрилгидрази- ла служили свежеприготовленные экстракты лекарственных трав, при сравнении с методом хемилюминесценции — экстракты, настойки и бальзамы из лекарственных трав промышленного происхождения, при сравнении с методом Фолина – Чокальтеу — образцы белого и красного вин.

Результаты корреляционных исследований представлены на рис. 3, а также изложены в работе [21].

Применение потенциометрии для регистрации сигнала в сочетании с данной медиаторной системой обеспечивает оперативность процедуры анализа, позволяет избежать больших затрат на оборудование и реактивы.

Оценка основных метрологических характеристик методики

ГОСТ Р ИСО 5725–2002 и РМГ 61–2003 предлагают и регламентируют несколько методов определения метрологических характеристик аналитических методик: однофакторных планов экспериментов, аттестованных методик с известными характеристиками погрешности, с использованием стандартных образцов или аттестованных смесей и др. [22, 23].

Метод однофакторных планов экспериментов предполагает учет меняющихся факторов пробы, что при анализе продуктов питания с их сложным и изменчивым составом вызывает определенные трудности. В настоящее время не существует также аттестованных методик определения антиоксидантной активности с известными характеристиками погрешности, которые можно было бы использовать для оценки показателей точности, правильности и прецизионности данной потенциометрической методики. Применение методов с использованием стандартных образцов в этом случае также не представляется возможным, так как АОА, будучи интегральным показателем, обеспечивается наличием достаточно широкого круга веществ. В этом случае сложно соблюсти корректность при выборе одного вещества в качестве добавки. Невозможно также гарантировать отсутствие химиче- ской реакции между веществом добавки и веществами, входящими в состав пробы. Кроме того, в настоящее время не существует стандартных образцов или адекватных аттестованных смесей для определения антиоксидантной активности продуктов питания.

Исходя из вышесказанного для определения прецизионности, правильности и точности методики

100

90

20

10

0

1

2

3

4

Ðèñ. 3. Результаты корреляционных исследований АОА различными методами: 1 — перекисного окисления липидов; 2 — хемилюминесценции; 3 — фотоколориметрический метод с использованием 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила; 4 — Фолина – Чокальтеу

определения АОА продуктов питания был выбран метод разбавления анализируемой пробы.

25

20

15

%

10

Ðèñ. 4. Поддиапазоны определения АОА

Показатели прецизионности [повторяемости (уr) и воспроизводимости (уR)], правильности (±дc) и точности (±д) методики определения АОА продуктов питания определяли в соответствии с требованиями РГМ 61–2003. В табл. 3 приведены результаты определения АОА методом разбавления и оценки прецизионности, правильности и точности методики определения АОА ряда продуктов питания, экстрактов лекарственных растений, витаминных препаратах и БАД.

На рис. 4 представлены поддиапазоны определения АОА, которые были выделены на основании полученных результатов расчета метрологических характеристик:

от 0,5 до 10,0 ммоль-экв. дм3 включительно с точностью 24 %, от 10,0 до 50,0 ммоль-экв. дм3 включительно с точностью 18 %, от 50,0 до 300,0 ммоль-экв. дм3 с точностью 7 %. Показатели повторяемости и воспроизводимости по исследованным продуктам, БАД и витаминам в относительных единицах составили не более 10 %, границы относительной систематической погрешности (правильности) — не более 12 %. В настоящее время методика прошла аттестацию в ФГУП Уральский НИИ метрологии.

Таким образом, потенциометрический метод определения АОА с использованием медиаторной системы может быть с успехом применен для определения АОА широкого круга растительных или созданных на их основе объектов со сложной матрицей переменного состава. Полученные значения прецизионности, правильности и точности подтверждают стабильность потенциометрических измерений АОА, полученных в условиях как повторяемости, так и воспроизводимости.

Литература

1.Зенков Н. К., Ланкин В. З., Меньщикова Е. Б. Окислительный стресс. — М.: МАИК “Наука Интерпериодика”, 2001.

— 343 ñ.

2.Robards K., Prenzler P. D., Tucer G., Swatsitang P., Glover W.

Food Chem. 1999. V. 66. P. 401 – 436.

3.Tiwari A. K. Curr. Sci. 2001. V. 81. ¹ 9. P. 1179 – 1187.

4.Абдулин И. Ф., Турова Е. Н., Зыбина Н. Н. Заводская лабо-

ратория. Диагностика материалов. 2001. Т. 67. ¹ 6.

Ñ. 3 – 13.

5.Lindqvist A-M., Petersson K., Stocker R., Westerlund C., Witting P. Method for detection of potential co-atioxidants. U.S. Patent US6031008, ÌÏÊ7 A01N31 08. — 2000. — 14 p.

6.Темердашев З. А., Храпко Н. В., Цюпко Т. Г., Воронова О. Б.,

Балаба А. Н. Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2006. Т. 72. ¹ 11. С. 15 – 19.

7.Rice-Evance C., Miller N. J. Meth. Enzymol. 1994. V. 234. P. 279 – 293.

8.Gao G., Verdon C. P., Wu A. H., Prior R. L. Clin. Chem. 1995. V. 41. P. 1738 – 1744.

9.Gizelli A., Serafini M., Maiani G., Assini E., Ferro-Luzzi A.

Free Radical Biol. Med. 1994. V. 27. P. 29 – 36.

10.Strain J. J., Benzie I. Measurement of antioxidant (reducing) power and or antioxidant concentration. U.S. Patent US6177260, ÌÏÊ7 G01N 33 48. — 2001. — 7 p.

11.Chevion Sh., Roberts M. A., Chevion M. Free Radical Biol. Med. 2000. V. 28. ¹ 6. P. 860 – 870.

12.Kohen R., Vellaichamy E., Hrbac J., Gaty I., Tirosh O. Free Radical Biol. Med. 2000. V. 28. ¹ 6. P. 871 – 879.

13.Chen J., Gorton L., Akersson B. Anal. Chim. Acta. 2002. ¹ 474. P. 137 – 146.

14.Campanella L., Bonnani A., Favero G., Tomassetti M. Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 375. P. 1011 – 1016.

15.Ignatov S., Shishniashvili D., Ge B., Scheller F. W., Lisdat F.

Biosensor Bioelectr. 2002. V. 17. P. 191 – 199.

16.Korotkova E. I., Karbainov Y. A., Avramchic O. A. Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 375. P. 465 – 468.

17.Короткова Е. И., Аврамчик О. А., Юсубов М. С., Белоусов М. В., Андреева Т. И. Химико-фармацевтический журнал. 2003. Т. 37. ¹ 9. С. 55 – 56.

18.Абдуллин И. Ф., Турова Е. Н., Будников Г. К. ÆÀÕ. 2001. Ò. 56. ¹ 6. Ñ. 627 – 629.

19.Абдуллин И. Ф., Турова Е. Н., Гайсина Г. Х., Будников Г. К.

ÆÀÕ. 2002. Ò. 57. ¹ 6. Ñ. 666 – 670.

20.Абдуллин И. Ф., Турова Е. Н., Зиятдинова Г. К., Будников Г. К. ÆÀÕ. 2002. Ò. 57. ¹ 8. Ñ. 864 – 866.

21.Brainina Kh. Z., Ivanova A. V., Sharafutdinova E. N., Lozov-

skaya E. L., Shkarina E. I. Talanta. 2007. V. 71. ¹ 1.

P. 13 – 18.

22.ÃÎÑÒ Ð ÈÑÎ 5725–2002. Ч. 1 – 6. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. — М.: ИПК Издательство стандартов, 2002. — 208 с.

23.ÐÌÃ 61–2003. Рекомендации по межгосударственной стандартизации. ГСИ. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки. — М.: ИПК Издательство стандартов, 2004. — 4 с.