3.3.2. Нефелометрия и турбидиметрия

В клинической лабораторной диагностике нефелометрия применяется для определения количества частиц, выпавших в осадок – мутности раствора. Чаще всего речь идет о количественном определении белков по интенсивности преципитата¹ после проведения реакции антиген-антитело, но метод находит применение также при выполнении осадочных проб и очень редко в других случаях.

Интенсивность светорассеивания можно оценивать двояко – либо по количеству рассеянного света, либо по ослаблению прошедшего. В первом случае говорят о нефелометрии, во втором о турбидиметрии.

Если поместить мутный раствор в кювету фотометрического прибора, то световой поток, проходя через кювету, будет поглощаться (если раствор окрашен), частично проходить через кювету, не изменяя направления (трансмиссия), частично рассеиваться, изменяя свое направление, отклоняясь под различными углами (рассеивание). Трансмиссия (измеряется турбидиметрами) и рассеяние (измеряется нефелометрами) света зависят от длины волны светового потока, его частоты, интенсивности, а также от свойства рассеивающей среды: размера частиц, их формы, количества, способности к поляризации и др.

Характер (тип) рассеивания зависит от соотношения длины волны света (λ) и диаметра частицы, на которой происходит рассеивание.

Если размер частиц рассеивающей реакционной смеси значительно меньше длины волны светового потока, проходящего через кювету (диаметр частиц < 0.1λ), такой вид рассеяния называют упругим.

Интенсивность потока рассеиваемого небольшими частицами подчиняется уравнению Релея:

,

где I_r и I₀ соответственно интенсивность рассеянного и падающего света, n₁ и n – коэффициенты преломления частиц и среды; N – общее число частиц; V – объем частиц; λ – длина волны падающего света; d – расстояние до приемника; β – угол, образованный падающим и рассеянным светом.

При лабораторных исследованиях величины V, n₁, n, λ, d и β известны и постоянны для исследуемого вещества, а N = Cb; здесь C – концентрация вещества, b – толщина раствора (также известная величина). Поэтому для определенного угла β формула Релея примет вид:

I_r/I₀ = kC,

где все известные параметры объединены в коэффициент k.

В основе рассеяния на малых частицах лежит явление дифракции. Рассеивание света каждой частицей не зависит друг от друга, рассеянный свет распространяется во всех направлениях, однако максимальное количество света рассеивается под углом 0 и 180 градусов к лучу, падающему на частицу (рис. А). При длине волны 400 нм такой тип рассеивания будет характерен для частиц диаметром менее 40 нм. К таким частицам в плазме крови относятся многие плазменные белки, в том числе иммуноглобулины, β−липопротеиды, альбумин и т.д. При увеличении размеров частиц (для плазменных белков размер в диапазоне от 40 до 400 нм) рассеивание становится несимметричным и максимальное количество света рассеивается в направлении падающего луча (рис. Б). Такой тип рассеивания будет характерен при λ = 400 нм для IgM (иммуноглобулины класса М), хиломикронов и формирующихся комплексов антигенов с иммуноглобулинами. Когда размер частиц превышает длину волны света (в нашем примере диаметр больше 400 нм) несимметричность светорассеяния еще больше увеличивается (рис. В). Такой тип рассеивания будет характерен для взвеси бактерий, для клеток крови (тромбоцитов, эритроцитов) и других крупных частиц. Интенсивность рассеяния света определяется средним числом рассеивающих частиц в единице объема.

Сравнивая величины рассеянного и падающего света I_r и I₀ можно определять концентрацию веществ в растворе. Такой метод исследования называется нефелометрией, а приборы, на которых производят измерения – нефелометрами.

Измерение светорассеивания под разными углами (как правило, используются измерение малоуглового рассеивания) дает информацию о размерах частиц в растворе. В то же время, если известны размеры частиц рассеивающего вещества, то возможно по интенсивности рассеянного света при фиксированном угле измерения определить концентрацию вещества. Методы, основанные на взаимодействии антиген-антитело, высоко специфичны, поэтому практически во всех случаях известно, что измеряется. Исходя из этого, приборы для нефелометрии, как правило, программируются под измерение определенных специфических компонентов биологической жидкости, чаще всего индивидуальных белков.

Метод исследования светорассеивающих растворов по прошедшему через них свету называется турбидиметрией. Для измерения световых потоков используются турбидиметры, построенные по принципу визуальных или электрических фотометров.

При турбидиметрических исследованиях интенсивность прошедшего светового потока I_t может быть определена по уравнению:

,

где I₀ – интенсивность падающего светового потока; I_t – интенсивность потока, прошедшего через раствор; С – концентрация рассеивающих частиц в растворе; b – толщина поглощающего слоя раствора; d – средний диаметр рассеивающих частиц; k и α – константы, зависящие от природы вещества и метода измерения; λ – длина волны.

При постоянных b, d, k, α и λ получим:

lg(I₀/I_t) = tC или I_t = I₀ 10^–tC

- выражение, подобное закону Бугера-Ламберта-Бера для окрашенных прозрачных растворов. Здесь t – молярный коэффициент мутности раствора или турбидиметрия. При турбидиметрии проводится измерение прошедшего светового пучка, также как измеряется и абсорбция при фотометрии. Поэтому в качестве турбидиметра можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов, так как этот способ не требует особой конструкции прибора.

На рисунке представлена принципиальная схема измерения рассеянного света.

А - нефелометр, регистрирующий малоугловое рассеивание, Б - нефелометр, регистрирующий рассеивание под углом 90^о, В - турбидиметр

Обычно при турбидиметрических исследованиях используются короткие длины волн, как правило, 340 нм. Это связано с тем, что доля рассеянного света увеличивается обратно пропорционально четвертой степени длины волны, соответственно при меньшей длине волны прошедший свет будет составлять большую часть от падающего, то есть будет более интенсивным. В то же время оптические системы, как правило, уверенно работают в ближнем ультрафиолете при 340 нм, в более дальнем ультрафиолетовом диапазоне необходимо использовать специальную оптику.

Преимущество нефелометрии заключается в том, что можно уловить как очень маленькие, так и очень большие величины рассеянного света.

Нефелометрию применяют для определения мутности раствора, чаще всего при количественном определении белков, лекарств по интенсивности светорассеяния преципитатом после проведения реакции «антиген-антитело», но метод также находит применение при выполнении осадочных проб. Высокая чувствительность современных нефелометров позволяет применять эти методы для определения концентрации белков не только в сыворотке или плазме, но и моче, спинномозговой, суставной и амниотической жидкостях, в элюатах при ионнообменной хроматографии.