Экспрессия генов Патрушев

311

очередь, может обеспечивать специфическую экспрессию заключенных в них генов на разных стадиях онтогенетического развития организма.

Рис. I.34. Структура и функционирование инсулятора ретротранспозона gypsy дрозофилы

а – последовательность инсулятора (ins), представленная 12 копиями сайта связывания белка su(Hw) (su), взаимодействующего с белком mod(mdg4) (mo). Комплекс этих белков, связанных с инсулятором, однонаправленно подавляет активность энхансеров (перечеркнутые заштрихованные эллипсы) гена yellow в соответствующих тканях; б – инактивация белка mod(mdg4) под действием мутации разрушает белковый комплекс su–mo, и подавление транскрипции под действием инсулятора становится неспецифическим (двунаправленным). Обозначения тканей дрозофилы: wng – крылья, bc – катикула тела, lv – ткани личинки, tc – тарзальные коготки, br – щетинки

Вышеупомянутый инсулятор ретротранспозона gypsy содержит 12 сайтов связывания белка su(Hw). Коровая последовательность этих сайтов гомологична октамерной последовательности, обнаруженной в различных энхансерах и промоторах позвоночных. Эта последовательность фланкирована AT-богатыми участками, которые способствуют изгибанию молекулы ДНК, требуемому для правильных ДНК-белковых взаимодействий в этом участке

312

генома. Полипептидная цепь белка su(Hw) содержит 12 доменов типа "цинковые пальцы", необходимых для его связывания с ДНК и функционирования инсулятора. Кроме того, белок su(Hw) обладает двумя кислыми доменами, локализованными вблизи его С-конца, которые обеспечивают его взаимодействие с энхансерами и нужны для подавления эффекта положения. Абсолютно необходимым для функционирования инсуляторов является и α-спиральный участок полипептидной цепи этого белка, гомологичный второму спиральному участку (helix-coiled coil) основных факторов транскрипции группы HLH-bzip, содержащему домен типа "лейциновая застежка". Поскольку такой домен обычно требуется для осуществления белок-белковых взаимодействий, полагают, что для функционирования этого инсулятора кроме белка su(Hw) необходимы и другие белки.

С помощью классического генетического анализа был идентифицирован второй компонент инсулятора su(Hw). Мутации в гене modifier of mdg4 (mod(mdg4)) ингибировали полярное действие инсулятора на энхансеры (рис. I.34,а) и усиливали мозаичный эффект положения для генов, транслоцированных в гетерохроматин. У таких мутантов действие инсулятора на подавление активности энхансеров было двунаправленным и не зависело от расстояния между энхансерами и промотором (см. рис. I.34,б). Ген mod(mdg4) кодирует, по крайней мере, три белка, которые возникают в результате альтернативного сплайсинга и содержат BTB-домен, характерный для многих факторов транскрипции, например уже упоминаемого GAGA-фактора, осуществляющего свое действие через изменение структуры хроматина. Полагают, что двунаправленное подавление функций энхансеров инсулятором gypsy в отсутствие функционально активного белка mod(mdg4) являются следствием гетерохроматизации последовательностей, окружающих инсулятор. В этой связи подавление активности энхансеров у мутантов mod(mdg4) может происходить из-за изменений в нуклеосомной структуре данных участков ДНК. Поскольку для развития эффекта требуется наличие нативных доменов типа "лейциновая застежка" и кислых доменов белка su(Hw), предполагают, что процесс гетерохроматизации ДНК в отсутствие функционального белка mod(mdg4) является следствием взаимодействия белка su(Hw) с другими белками. Ингибирующее действие инсулятора ретротранспозона gypsy может

313

распространяться на энхансеры, находящиеся по отношению к нему в транс- положении, т.е. на гомологичной хромосоме.

Дальнейшим указанием на то, что действие пограничных последовательностей на соответствующие гены осуществляется через изменение структуры хроматина, было получено при исследовании их влияния на дозовую компенсацию у дрозофилы. Для экспрессии генов, расположенных на X-хромосоме самцов и самок этого организма, характерен одинаковый уровень, хотя содержание (доза) таких генов у самок в два раза выше, чем у самцов. Это равновесие достигается за счет механизма, повышающего вдвое скорость транскрипции сцепленных с X-хромосомой генов у самцов и получившего название дозовой компенсации. На X-хромосоме самцов происходит сборка мультимерных белковых комплексов (так называемых летальных комплексов), которые изменяют нуклеосомную структуру хромосомы за счет ацетилирования остатков Lys-16 гистона H4. Способность к дозовой компенсации полностью отсутствует у локусов X-хромосомы, перенесенных на аутосомы, т.е. последние подавляют этот эффект. Однако если трансген фланкирован пограничными последовательностями ретротранспозона gypsy, то у 90% трансгенов, интегрированных в аутосомы, происходит правильная дозовая компенсация. Механизм этого явления пока непонятен. Предполагают, что изменение структуры хроматина в трансгене под действием инсуляторов делает возможным сборку на нем летального комплекса или может препятствовать доступу деацетилаз к гистонам нуклеосом.

Результаты исследований белков BEAF-32, su(Hw) и mod(mdg4) указывают на то, что инсуляторы и пограничные последовательности формируют мультибелковые комплексы, регулирующие экспрессию генов через изменение структуры соседнего с ними хроматина. Такие изменения конформации хроматина могут оказывать влияние на взаимодействия между энхансерами и промоторами генов, не изменяя функциональной активности энхансеров как таковых. При этом изменения структуры хроматина, вызываемые инсуляторами, не препятствуют элонгации РНК РНКполимеразами.

В настоящее время идентифицированы и другие хромосомные белки, обеспечивающие инактивацию генов через конденсацию хроматина, которые,

314

кроме того, необходимы для поддержания хроматина и целых хромосом в конденсированном неактивном состоянии. К таким белкам, в частности, относится белок гетерохроматина 1 (HP-1) дрозофилы, ассоциированный с β- гетерохроматином. Мутации в гене, кодирующем белок HP-1, являются супрессорными, подавляющими мозаичный эффект положения (PEV). В то же время дупликация этого локуса усиливает PEV, что указывает на зависимость упаковки гетерохроматина, инактивирующей гены, от внутриклеточной концентрации белка HP-1. Для такого белка характерна высокая эволюционная консервативность, и его гомологи обнаружены у мышей, человека и растений. Использование переходов конденсации–деконденсации хроматина для регуляции экспрессии как отдельных генов, так и их громадных массивов, повидимому, является прерогативой эукариот. Еще одним ярким примером такого рода служит инактивация одной из X-хромосом самок млекопитающих в раннем эмбриогенезе.

Инактивация X-хромосом. Поскольку соматические клетки самок млекопитающих содержат две половые X-хромосомы, а самцов – только одну, у самок возникает необходимость в компенсации двойной дозы генов, сцепленных с этими хромосомами. Такая проблема решается путем инактивации одной из X-хромосом, являющейся следствием перевода ее хроматина в высококонденсированное состояние с подавленной транскрипцией. Хотя в большинстве случаев в разных клетках одного и того же животного случайным образом инактивируется или материнская, или отцовская X-хромосома, имеются специальные случаи, когда во всех клетках только отцовская хромосома становится транскрипционно неактивной. Последний случай, получивший название "импринтный тип инактивации X-хромосомы", характерен для сумчатых животных и обнаружен в некоторых клетках эмбрионов мышей. (Более подробно о генетическом импринтинге см. раздел

3.2.5.)

Лучше всего молекулярные механизмы инактивации X-хромосомы изучены у человека, мышей и сумчатых животных. В ранних эмбрионах мышей и человека обе X-хромосомы активны. У мышей инактивация X-хромосомы впервые обнаруживается в ранних эмбрионах на стадии бластоцисты, когда для всех внеэмбриональных клеток характерен импринтный тип инактивации только отцовских X-хромосом. Позднее, через 6 дней эмбрионального развития

315

во всех клетках зародыша материнские и отцовские X-хромосомы инактивируются случайным образом. Неактивное состояние хромосом высокостабильно, и их реактивация (повторная активация) имеет место лишь у самок в клетках зародышевой линии. В клетках зародышевой линии самцов единственная X-хромосома инактивируется в раннем сперматогенезе.

Свойства инактивированных X-хромосом. Все инактивированные X-

хромосомы обладают некоторыми общими свойствами. Их ДНК реплицируется в поздней S-фазе клеточного цикла, а в интерфазе они присутствуют в высококонденсированном состоянии в виде так называемых телец полового хроматина (sex chromatin bodies). Все это происходит на фоне низкого уровня ацетилирования гистонов и появления нового гистона macro H2A1, что указывает на возможные изменения структуры нуклеосом. В эмбриональных соматических клетках (но не в клетках зародышевой линии) плацентарных млекопитающих метилированы CpG-островки генов инактивированной X- хромосомы, в отличие от CpG-островков остальной части генома. Неметилированными остаются и CpG-островки инактивированных X-хромосом сумчатых животных. Большая часть вышеперечисленных свойств инактивированных X-хромосом присуща и обычному гетерохроматину. Поэтому процесс инактивации рассматривают как гетерохроматизацию X-хромосом.

У редко встречающихся индивидуумов с ненормальным числом X- хромосом – X0, XX, XXY и т.п. независимо от их числа – по-прежнему инактивированной остается только одна половая хромосома. В отличие от этого, в клетках триплоидных организмов, содержащих по три набора хромосом, инактивируется или одна, или две X-хромосомы, а у тетраплоидов – две. Такого рода данные указывают на существование механизма, поддерживающего в активном состоянии одну X-хромосому на каждые два набора аутосом. Таким образом, перед инактивацией в эмбриональных клетках происходит определение числа наборов аутосом, выбор X-хромосом, остающихся активными, и инициация инактивации остальных X-хромосом.

Инициация инактивации X-хромосом. Процесс инактивации X-

хромосом начинается на определенном участке, получившем название центра инактивации X-хромосомы (X-inactivation center). В этом участке был картирован ген Xist (X inactive specific transcript), который впоследствии был клонирован. Сегменты X-хромосомы, у которых центр инактивации удален в

316

результате делеций или транслокаций, не подвергаются инактивации. С помощью генного нокаута Xist было установлено, что для инактивации X- хромосом требуется его транскрипция. Введение гена Xist с помощью трансгеноза в аутосомы было достаточным для инициации инактивации последних.

Ген Xist как основной регулятор инактивации X-хромосом. С

помощью генного нокаута удалось показать, что за определение внутриклеточного числа X-хромосом (counting) и инициацию их инактивации отвечают разные участки гена Xist. 5'-Концевая часть гена необходима для инициации инактивации, а его 3'-концевая зона участвует в счете хромосом, в результате которого определяется, какая хромосома остается активной. X- Хромосомы с поврежденной 3'-концевой частью гена Xist всегда инактивируются. В этой серии экспериментов было также установлено, что ген Xist требуется как для случайной инактивации хромосом, так и для инактивации импринтного типа, однако его участие, возможно, не требуется для инактивации X-хромосом в мужских зародышевых клетках. В связи с тем, что на активных X- хромосомах ген Xist сильно метилирован, полагают, что его метилированное состояние сопровождается репрессией гена, препятствующей инактивации X- хромосом.

Удивительным свойством гена Xist является то, что он не кодирует белки. В результате экспрессии гена образуется большая РНК, длина которой составляет 15–17 т.о. После окончания синтеза РНК остается в ядре, а в клетках, где X-хромосома уже инактивирована, эта РНК создает "оболочку" вокруг неактивной хромосомы. В недифференцированных эмбриональных стволовых клетках, где обе X-хромосомы активны, зоны экспрессии гена Xist выявляются с помощью гибридизации in situ в виде отдельной точки на каждой хромосоме на фоне общего низкого содержания Xist-РНК. Во время дифференцировки клеток зона содержания Xist-РНК расширяется вдоль будущей неактивной хромосомы на фоне увеличения ее количества. Одновременно резко уменьшается уровень экспрессии гена Xist на хромосоме, остающейся активной.

Повышение внутриклеточного уровня Xist-РНК происходит не за счет стимуляции транскрипции гена, но вследствие стабилизации самих молекул РНК. При этом стабильная и нестабильная РНК транскрибируются с разных

317

промоторов одного и того же гена. И стабилизация, и хромосомная локализация Xist-РНК являются необходимыми, но не достаточными условиями инактивации X-хромосомы. В ранних эмбрионах мышей на стадии предимплантации отцовские X-хромосомы покрыты оболочкой Xist-РНК, однако остаются в активном состоянии. Это указывает на участие дополнительных факторов в эмбриональной инактивации X-хромосом, которые отсутствуют в клетках ранних эмбрионов.

Установление и поддержание неактивного состояния X-хромосом.

Механизм распространения зоны неактивного хроматина вдоль X-хромосом от центра инактивации пока остается непонятным. В аутосомах, содержащих транслоцированный центр инактивации или интегрированный трансген Xist, инактивация распространяется в обе стороны на многие миллионы пар оснований. Однако в этом случае гетерохроматизация хроматина происходит менее эффективно и по-разному на индивидуальных хромосомах. При этом некоторые гены аутосом остаются в активном состоянии. Полагают, что для X- хромосом характерно наличие специфических последовательностей, необходимых для их эффективной гетерохроматизации при инактивации, которые отсутствуют в аутосомах.

Некоторые гены инактивированных X-хромосом продолжают функционировать. Часть из них имеет гомологов на Y-хромосоме и поэтому не требует дозовой компенсации. В ряде случаев их активированное состояние является следствием реактивации предварительно инактивированного хроматина. Однако для большинства таких генов механизм поддержания в активном состоянии на фоне молчащего генетического окружения остается неизвестным.

Ген Xist транскрибируется в клетках всех женских особей в присутствии метилированных CpG-островков генов инактивированных X-хромосом. В культивируемых клетках деметилирующие агенты вызывают частичную реактивацию молчащих генов на этих хромосомах. Не исключено, что кроме этих механизмов инактивированное состояние X-хромосом поддерживает и поздняя репликация их ДНК. У сумчатых животных имеет место поздняя репликация, однако не наблюдается дифференциального метилирования CpGостровков, и у них инактивированное состояние X-хромосом менее стабильно, чем у плацентарных млекопитающих. В последнем случае даже прекращение

318

транскрипции гена Xist не сопровождается реактивацией молчащих X- хромосом, однако на фоне слабого метилирования такая реактивация иногда происходит. Таким образом, поддержание инактивированного состояния X- хромосомы является сложным многоуровневым процессом.

Импринтная инактивация только отцовских X-хромосом рассматривается как эволюционно более примитивная форма дозовой компенсации у животных. Действительно, в этом случае повышается вероятность вредного воздействия на организм мутантных материнских генов, локализованных на X-хромосоме. Такая вероятность должна быть меньше при случайной инактивации в разных клетках отцовских и материнских хромосом. Наличие молекулярных механизмов, регулирующих экспрессию генов через дозовую компенсацию, позволило высказать предположение, что эволюционный обмен генами между аутосомами и половыми хромосомами является вредным для биологического вида, так как может приводить к регуляторному дисбалансу экспрессии транслоцированных генов. Был сформулирован так называемый закон Оно, в соответствии с которым гены, сцепленные с X-хромосомой у одного вида млекопитающих, должны оставаться сцепленными с X-хромосомой и у всех остальных.

Аналогично тому, что было показано на примере X-хромосомы сумчатых млекопитающих, при делении во время митоза дочерние клетки могут наследовать от родительских не только прямую генетическую информацию в виде новой копии всех генов, но и определенный уровень их активности (в данном примере – активное или неактивное состояния). Такой тип наследования генетической информации получил название эпигенетического наследования. Современная эпигенетика изучает наследуемые особенности (паттерны) экспрессии генов, вызываемые потенциально обратимыми изменениями структуры хроматина и(или) метилирования ДНК, не сопровождаемые изменениями ее первичной структуры.

3.2.5. Импринтинг

Другим характерным примером регуляции экспрессии генов, приводящей к эпигенетическому наследованию признаков, является уже упомянутый выше импринтинг, при котором специфический характер дифференциальной активности генов определяется полом организма, от которого эти гены

319

унаследованы. В частности, у некоторых насекомых, например грибных комариков (Sciaridae), весь набор отцовских хромосом элиминируется во время сперматогенеза. У этих организмов отцовские хромосомы маркируются в цитоплазме клеток зародышевой линии, удаляются при созревании гамет и не передают свои гены следующему поколению. У млекопитающих и высших цветковых растений отцовские и материнские гены оказывают разный эффект на развитие эмбриона, но в одинаковой степени представлены в гаметах, образующихся в результате мейоза. В этом случае вклады отцовского и материнского геномов в развитие организмов не эквивалентны и происходит видимое искажение менделевских правил наследования некоторых признаков. Иными словами, характер экспрессии отцовского и материнского аллелей одного и того же гена в организме-потомке может быть различным, так как зависит от их происхождения. Молекулярные механизмы этого явления в настоящее время до конца непонятны. Предполагается, что в развитие феномена импринтинга вносят вклад зависимые от пола модификации ДНК определенных генов, в частности метилирование их регуляторных участков.

3.2.6. Метилирование ДНК в регуляции транскрипции

Единственной известной генетически запрограммированной ковалентной модификацией ДНК у высших эукариот является метилирование остатков цитозина в положении 5 с образованием 5-метилцитозина (5-mC). Эта реакция катализируется ферментом (цитозин-5)-ДНК-метилтрансферазой (Мтазой), который обнаружен у прокариот и эукариот. Каталитический механизм действия этих ферментов был подробно изучен на примере бактериальной метилазы M.HhaI, которая модифицирует соответствующий сайт рестрикции. С помощью рентгеноструктурного анализа было показано, что после взаимодействия Мтазы со специфическим участком ДНК остаток модифицируемого цитозина выпячивается из двойной спирали и образует ковалентную связь с полипептидной цепью фермента в положении С6. В этом промежуточном комплексе активированный атом углерода С5 акцептирует метильную группу S- аденозилметионина, выступающего в качестве кофактора. Полипептидные цепи Мтаз эукариот содержат на своих N-концах большой домен, который обеспечивает ядерную локализацию ферментов, их доставку к репликативным вилкам, ответ ферментов на регуляторные воздействия.

последовательности. Они также метилируют последовательности, в которых одна цепь ДНК уже содержит метильные группы. В отличие от этого эукариотические Мтазы относятся к "поддерживающим" ферментам, которые узнают и метилируют только наполовину метилированные последовательности, формирующиеся во время репликации ДНК, когда вновь синтезированная цепь неметилирована. У млекопитающих остатки С метилируются преимущественно в составе динуклеотидов CpG, однако в последнее время описаны случаи метилирования и последовательностей CpNpG. В геноме позвоночных животных метилировано 70% динуклеотидов CpG и 6–7% всех остатков цитозина.

"Поддерживающие" Мтазы животных обладают небольшой способностью осуществлять метилирование ДНК и de novo в полностью неметилированных участках, а также искусственных субстратов (олигонуклеотидов), содержащих ошибочно спаренные основания. Остается непонятным, является ли указанное свойство Мтаз достаточным для осуществления метилирования de novo обширных участков генома в эмбриогенезе или же этот процесс происходит с участием других ферментов. Известно, что гомозиготные делеции в гене Мтазы у мышей вызывают гибель зародышей в раннем эмбриогенезе, что указывает на важную роль метилирования ДНК в онтогенезе млекопитающих. Однако даже у таких мутантных эмбрионов небольшая часть последовательностей ДНК метилирована.

Метилирование остатков цитозина оказывает влияние на структурные характеристики ДНК. Это проявляется в облегчении перехода метилированных участков ДНК из B-формы в Z-форму, увеличении шага спирали ДНК и изменении кинетики образования крестообразных структур. Метильная группа 5-mC выступает на поверхности большой бороздки ДНК, находящейся в B- форме, и увеличивает ее гидрофобность, что в ряде случаев является решающим фактором при взаимодействии белков с соответствующими участками ДНК.

Регуляция экспрессии генов с помощью метилирования ДНК.

Метилирование остатков C может оказывать влияние на транскрипцию как непосредственно через изменение эффективности связывания позитивных и