Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Экспрессия генов Патрушев

.pdf
Скачиваний:
1036
Добавлен:
30.03.2015
Размер:
7.15 Mб
Скачать

201

с использованием стабильно трансформированных клеток животных и растений, выращиваемых в культуре. В ходе этих исследований установлено, что у растений и животных в основном функционируют одни и те же механизмы трансляции. Ниже будут рассмотрены основные молекулярные механизмы, участвующие в трансляции мРНК у эукариот, с привлечением данных, полученных главным образом на дрожжах S. cerevisiae.

2.5.1. Особенности первичной структуры эукариотических мРНК

Зрелая мРНК эукариот наряду с основной последовательностью нуклеотидов, в которой закодирована информация о последовательности аминокислот в соответствующем белке, содержит целый ряд некодирующих последовательностей, присутствие которых исключительно важно для ее эффективной, регулируемой трансляции рибосомами. Одни из этих последовательностей, такие как кэп-группа и 3'-концевая поли(А), не кодируются непосредственно генами, а, как это подробно рассматривалось выше, добавляются ко- и посттранскрипционно. Другие некодирующие последовательности, в том случае, если они не являются продуктами посттранскрипционного редактирования мРНК, имеют генное происхождение. Эти последовательности часто содержат регуляторные сигналы, обеспечивающие определенный уровень трансляции мРНК рибосомами.

Участок мРНК, расположенный между кэп-группой и первым инициирующим кодоном основной открытой рамки считывания (ОРС), которая и несет информацию о последовательности аминокислот в белке, получил название 5'-концевой нетранслируемой области (5'UTR – 5' untranslated region), или лидерной последовательности. Сегмент мРНК, расположенный между последним терминирующим кодоном основной ОРС и началом поли(А)-

последовательности, называют 3'-концевой нетранслируемой областью

(3'UTR). Первое название не совсем удачно. Последовательности 5'UTR, как правило, способны образовывать сложные вторичные структуры типа "стебель-

петля" и содержать короткие ОРС (uORF – upstream open reading frame),

которые оказывают сильное влияние на эффективность трансляции мРНК (см. ниже). Помимо этого 5'UTR могут включать в себя регуляторные последовательности, распознаваемые транс-действующими белковыми факторами. Последовательности 5'UTR обеспечивают регулируемую

202

трансляцию мРНК (и координированную экспрессию соответствующих генов) в онтогенезе многоклеточных организмов.

3'UTR и поли(А)-последовательность оказывают влияние на состояние рибосом после терминации синтеза полипептидных цепей. Кроме того, по крайней мере, 3'-концевая поли(А)-последовательность участвует в инициации трансляции.

2.5.2. Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами

Как будет видно из дальнейшего изложения, инициация трансляции эукариотических мРНК может осуществляться, по крайней мере, тремя способами. В соответствии с первым наиболее распространенным механизмом (модель сканирования) рибосомы после взаимодействия с 5'-концевой последовательностью мРНК осуществляют поиск инициирующего AUG-кодона, перемещаясь вдоль 5'UTR. При реализации второго механизма рибосомы инициируют биосинтез белка на внутренних AUG-кодонах, удаленных от 5'- концевой кэп-группы. И, наконец, после освобождения полипептида из транслирующего комплекса рибосомы, не отделяясь от мРНК, способны реинициировать биосинтез белка на следующем инициирующем кодоне.

Факторы инициации трансляции. Большинство молекулярных механизмов, осуществляющих регуляцию экспрессии генов на уровне трансляции, реализуется на стадии инициации биосинтеза белка. По-видимому, этот факт находит свое отражение в большой сложности аппарата инициации трансляции. Помимо субъединиц эукариотических рибосом и белков, обычно ассоциированных с 5'- и 3'-концевыми последовательностями мРНК, в инициации принимают участие по меньшей мере 11 белковых факторов, построенных более чем из 25 полипептидов (табл. I.11).

 

 

Таблица I.11

 

Факторы инициации трансляции дрожжей S. cerevisiae

 

 

 

Фактор

Субъедин

Предполагаемая функция

 

ица

 

 

 

 

eIF1

 

Обеспечивает связывание Met-тРНК и мРНК с 40S

 

 

субчастицей рибосом и распознавание инициирующего

 

 

AUG-кодона (у животных)

eIF1A

eIF2

α, β, γ

eIF2B

α, β, γ, δ, ε

eIF3

α, β, γ, δ,

 

ε, ζ, η, θ

eIF4A

 

eIF4B

 

eIF4E

 

eIF4G

G1(p150),

 

G2(p130)

eIF4H

 

eIF5

 

eIF5A

 

eIF6

 

203

Обеспечивает диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом, связывание Met-тРНК и распознавание инициирующего кодона (у животных)

Участвует в выборе инициирующего кодона Обеспечивает обмен гуанилового нуклеотида на eIF2 Обеспечивает связывание Met-тРНК и мРНК с 40S субчастицей и диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом АТРаза, РНК-связывающая хеликаза

Хеликаза, облегчающая связывание РНК Взаимодействует с кэп-группой мРНК Взаимодействует с eIF3, eIF4E и Pab 1p

Стимулирует активность eIF4B и компонентов eIF4F Вызывает диссоциацию факторов инициации Функции неизвестны, мутации изменяют стабильность мРНК

Вызывает диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом

Учитывая сложность процесса инициации трансляции у эукариот, последовательность реакций, приводящих к образованию первой пептидной связи в строящемся полипептиде, удобно разбить на ряд последовательных этапов, что является сознательным упрощением единого процесса.

Взаимодействие мРНК с кэп-связывающим комплексом и рибосомами. Возможность вступления эукариотических мРНК в цикл трансляции как правило обеспечивается их 5'-концевыми кэп-структурами, с которыми взаимодействуют белки кэп-связывающего комплекса (CBC). Хотя основными компонентами CBC являются факторы инициации трансляции, его роль далеко не ограничивается участием в инициации синтеза белка рибосомами. Как уже обсуждалось в разделе 2.2.4, полифункциональные белки CBC интегрируют основные реакции метаболизма мРНК и их предшественников в эукариотических клетках, необходимые для осуществления эффективной регулируемой трансляции.

204

Взаимодействие eIF2 с Met-тРНК. Гетеротримерный фактор eIF2 обеспечивает взаимодействие рибосом с инициаторной Met-тРНК и мРНК in vitro. Гены всех трех субъединиц являются жизненно важными. В связанном с GTP состоянии eIF2 приобретает способность взаимодействовать с Met-тРНК с образованием тройного комплекса Met-тРНК–eIF2–GTP. Имеются данные, указывающие на участие фактора eIF2B в обмене GDP на GTP в комплексе eIF2–GDP. Неизвестна точная последовательность объединения тройного комплекса с рибосомой и мРНК. Большая часть имеющихся данных указывает на то, что взаимодействие тройного комплекса с 40S субчастицей рибосом предшествует образованию комплекса 40S-мРНК. Однако наличие феномена реинициации трансляции, при которой тройной комплекс входит в инициирующий комплекс с предсуществующим комплексом рибосома–мРНК, указывает на возможность осуществления этих событий в другой последовательности.

Формирование кэп-связывающего комплекса на мРНК. Сборка прединициационного комплекса на мРНК начинается со взаимодействия фактора eIF4E с кэп-группой мРНК. Это дает возможность объединения eIF4E и eIF4G с образованием многокомпонентного фактора eIF4F. В настоящее время не исключается возможность того, что объединение eIF4E и eIF4G предшествует взаимодействию первого с кэп-группой. У животных в состав многокомпонентного фактора eIF4F, кроме того, входит eIF4A, причем eIF4G удерживает два других фактора рядом друг с другом. Комплекс факторов eIF4F животных обладает двунаправленной ATP-зависимой РНК-хеликазной активностью, которая стимулируется фактором eIF4B. Недавно (1998 г.) обнаруженный фактор eIF4H усиливает активность eIF4F и eIF4B, однако его истинная роль в инициации трансляции остается невыясненной. Еще два белка дрожжей взаимодействуют с компонентами eIF4F: белок p20, конкурирующий с eIF4G за связывание eIF4E, а также поли(А)-связывающий белок Pab 1p, который контактирует со специфическим сайтом полипептидной цепи фактора eIF4G1. Функциональным аналогом p20 у млекопитающих является белок 4EBP – ингибитор инициации трансляции.

Полипептидная цепь eIF4G млекопитающих содержит сайты связывания факторов eIF3, eIF4E и eIF4A. На этом основании делается вывод, что eIF4G в обоих системах выполняет функции белка-адаптера, обеспечивающего сборку

205

комплекса eIF4F. Исключительно важная роль фактора eIF4E в регуляции экспрессии генов на уровне трансляции (и в канцерогенезе) будет рассмотрена в разделе 3.4.1.

Таким образом, взаимодействию малой субчастицы рибосом с мРНК предшествует серия высоко специфических белок–белковых и белково– нуклеиновых взаимодействий, приводящих к формированию белкового комплекса вокруг кэп-группы мРНК, в котором полипептидная цепь фактора eIF4G обладает сайтом связывания eIF3. Последний, в свою очередь, специфически взаимодействует с малой субчастицей рибосом, обеспечивая ее вхождение в прединициационный комплекс. При этом 40S субчастица ассоциирована с тройным комплексом Met-тРНК–eIF2–GTP, содержащим аминоацилированную инициаторную тРНКMet.

В итоге образуется прединициационный комплекс, содержащий мРНК, 40S субчастицу рибосом, связанную с тройным комплексом Met-тРНК–eIF2– GTP и через фактор eIF3 взаимодействующую с фактором eIF4G. Последний, в свою очередь, является частью многокомпонентного фактора eIF4F, в который кроме eIF4G входят eIF4E, взаимодействующий с кэп-группой мРНК, и eIF4A, обладающий РНК-хеликазной активностью. Кроме того, в состав этого комплекса входит фактор eIF1A. В таком виде прединициационный комплекс способен перемещаться вдоль 5'UTR мРНК и осуществлять поиск инициирующего AUG-кодона.

Роль 3'-концевой поли(А)-последовательности мРНК в инициации трансляции. Помимо вышеупомянутых сайтов белок–белковых взаимодействий, N-концевая часть полипептидной цепи дрожжевого eIF4G содержит участок, взаимодействующий с поли(А)-связывающим белком Pab1p. Другим указанием на участие 3'-концевой поли(А)-последовательности мРНК в трансляции является наличие мутаций в генах рибосомных белков 60S субчастицы, супрессирующих мутации в гене pab1. Кроме того, как будет видно из дальнейшего изложения, 3'-концевая поли(А)-последовательность мРНК может обеспечивать кэп-независимую инициацию трансляции. Данные такого рода указывают на возможную ключевую роль этой последовательности в инициации синтеза белка, однако механизм данного явления остается неизвестным.

206

Выбор точки инициации трансляции и инициация биосинтеза белка.

Сформировавшись, прединициационный комплекс должен оказаться на инициирующем AUG-кодоне мРНК, в ряде случаев весьма удаленном от кэпгруппы, с которой он первоначально взаимодействует. Рибосомы прокариот локализуют точку инициации биосинтеза белка путем непосредственного взаимодействия регуляторных элементов 5'UTR их мРНК (таких, как SDпоследовательность), расположенных в области инициации трансляции TIR (translation initiation region), с 3'-концевой последовательностью 16S рРНК малой субчастицы рибосом. В эукариотической клетке не обнаружено подобных взаимодействий между мРНК и рРНК. Одной из наиболее популярных в настоящее время моделей поиска эукариотической рибосомой точки инициации трансляции является модель сканирования, в соответствии с которой прединициационный комплекс перемещается вдоль 5'UTR до первого специфически распознаваемого им инициирующего кодона.

Модель сканирующей рибосомы. Как следует из модели сканирования, сформированный прединициационный комплекс перемещается от кэп-группы мРНК вдоль 5'UTR, "проверяя" ее последовательность на наличие инициирующего AUG-кодона. В настоящее время отсутствуют твердые доказательства того, что сканирование является строго однонаправленным. Изза отсутствия в мРНК эукариот SD-подобных последовательностей и соответствующих контактов с рРНК AUG-кодон распознается в результате кодон–антикодонового взаимодействия с участием Met-тРНК, входящей в состав прединициационного комплекса. Перемещение комплекса часто должно происходить на фоне ярко выраженной вторичной структуры лидерной последовательности мРНК. В этой связи предполагается, что происходящее во время сканирования расщепление ATP сопряжено с работой РНК-хеликазы, разрушающей вторичную структуру 5'UTR. Как уже упоминалось, данная активность ассоциирована с фактором eIF4A, входящим в состав прединициационного комплекса, и стимулируется фактором eIF4B. Однако роль этих факторов, по-видимому, не ограничивается разрушением вторичной структуры лидера, поскольку их присутствие требуется и для инициации синтеза белка на мРНК с короткими 5'UTR, не обладающими выраженной вторичной структурой.

207

В выборе AUG-кодона у эукариот участвует фактор eIF2. На это указывает тот факт, что его мутационные повреждения сопровождаются ослаблением специфичности такого выбора. Неожиданными оказались недавно полученные результаты, подчеркивающие важную роль фактора eIF5 в распознавании инициирующего кодона прединициационным комплексом. Не исключено, что этот фактор определяет точность процесса распознавания AUG и является функциональным аналогом прокариотического фактора IF3. Описаны мутантные формы eIF5, в присутствии которых in vivo в качестве инициирующего узнается кодон UUG. Не исключено, что совместное действие факторов eIF2 и eIF5 в обеспечении точности выбора инициирующего кодона становится возможным благодаря наличию на ß-субъединице eIF2 сайта связывания eIF5.

После локализации инициирующего кодона 40S субчастицей она приобретает способность объединяться с большой 60S субчастицей рибосом при участии фактора eIF5, что в конечном итоге приводит к образованию полноценного инициационного комплекса. В это время происходит отделение от комплекса ряда факторов инициации трансляции, сопряженное с гидролизом GTP. Прежде всего, освобождается комплекс eIF2–GDP, а также большинство остальных факторов инициации, включая eIF1A и eIF3. В таком виде при наличии соответствующей аминоацил-тРНК инициационный комплекс способен образовывать первую пептидную связь в строящейся полипептидной цепи, т.е. инициировать синтез белка.

Контекст и приоритеты инициирующих AUG-кодонов.

Последовательности, окружающие инициирующие AUG-кодоны, оказывают сильное влияние на эффективность инициации трансляции у позвоночных и в значительно меньшей степени у дрожжей. В последнем случае наиболее благоприятным для инициации трансляции является нуклеотид A в положении –3 по отношению к AUG (нуклеотид A в AUG-кодоне находится в положении +1), замена которого на любой другой нуклеотид снижает эффективность инициации приблизительно в два раза. Вообще, A-богатые последовательности, предшествующие AUG, характерны для мРНК дрожжей, что отличает их от мРНК позвоночных, соответствующие области мРНК которых сильнее обогащены GC. Это объясняют высокой чувствительностью аппарата трансляции дрожжей к вторичной структуре 5'UTR их мРНК, которая

208

при наличии GC-пар была бы более прочной. В следующих за AUG последовательностях мРНК дрожжей не обнаружено предпочтения в отношении A, и они, как правило, обогащены пиримидиновыми нуклеотидами.

Оптимальный контекст для инициации трансляции в клетках животных и растений, по-видимому, один и тот же: AACAATGGC. Самыми важными для инициации в обоих случаях являются пурин в положении –3 и G в положении +4. В клетках животных на эффективность трансляции мРНК оказывают влияние также нуклеотиды в положениях +5 и +6. Инициирующие кодоны в контексте, отличающемся от оптимального, узнаются рибосомами менее эффективно и допускают их прохождение до следующего инициирующего кодона. Это явление, обнаруженное в клетках животных и растений, получило название ослабленного сканирования (leaky scanning). Некоторые примеры реализации механизма ослабленного сканирования будут рассмотрены в разделе 3.4.1 (см. рис. I.40,а–в) в связи с особенностями инициации трансляции у вирусов растений.

Другим важным фактором, определяющим выбор AUG-кодона в качестве инициирующего, является его положение в 5'UTR. Как правило, ближайший к 5'- концу мРНК AUG предпочтительно используется для инициации трансляции. Это объясняют преимущественным перемещением сканирующей рибосомы в направлении 5'→3'. Многие 5'UTR содержат дополнительные AUG, не принадлежащие к основным ОРС, а также короткие ОРС (uAUG, uORF) перед основным инициирующим кодоном. И те и другие обычно оказывают ингибирующее действие на трансляцию соответствующих мРНК. Ингибирующий эффект является наиболее сильным, если расстояние первого uAUG от 5'-конца мРНК меньше 15–20 нуклеотидов. Наличие двух следующих друг за другом AUG-кодонов может сопровождаться их использованием в качестве альтернативных сайтов инициации трансляции. В этом случае одна и та же мРНК может направлять синтез двух полипептидов, различающихся лидерными пептидами, что, в свою очередь, может определять направление их внутриклеточного транспорта.

Распознавание инициирующих кодонов в процессе инициации трансляции может сопровождаться продолжительными паузами в дальнейшем перемещении рибосом вдоль мРНК при ее сканировании.

Инициирующие кодоны, отличающиеся от AUG. Трансляция в

209

клетках млекопитающих и насекомых может начинаться на кодонах, которые отличаются от канонического AUG. В природных мРНК в качестве альтернативного инициирующего кодона чаще всего встречается CUG и значительно реже – AUC и ACG. В клетках дрожжей любые не-AUG-кодоны распознаются очень неэффективно. Эффективность может быть повышена мутациями в субъединицах фактора eIF2 β и γ. Кодон AUU обычно открывает первую ОРС у некоторых вирусов растений. В этом случае эффективность инициации трансляции составляет 10% от эффективности на каноническом кодоне AUG, который располагается ниже первого. Таким образом, использование вирусами на одной матрице неканонического и канонического кодонов является одним из регуляторных механизмов, контролирующих соотношение синтезирующихся полипептидных цепей на уровне трансляции позволяющих рибосоме достичь в процессе сканирования второго инициирующего кодона и инициировать на нем синтез белка.

У млекопитающих вышерасположенный неканонический инициирующий кодон также, как правило, сопровождается каноническим кодоном. При этом дополнительная инициация трансляции на неканоническом кодоне чаще всего характерна для ОРС, кодирующих регуляторные белки. Образование по такому механизму полипептидных цепей, удлиненных с N-концевой части, приводит к появлению у них новой регуляторной активности, а сам процесс инициации на неканоническом кодоне может контролироваться условиями внутри клетки.

Влияние вторичной структуры мРНК на инициацию трансляции.

Вторичные структуры в 5'UTR мешают сканированию мРНК 40S субчастицами рибосом. Уровень ингибирования инициации трансляции зависит от положения таких структур относительно 5'-конца матрицы. Например, в лизатах ретикулоцитов кроликов структура типа стебель–петля со стабильностью –30 ккал/моль ингибирует инициацию трансляции, если расположена в непосредственной близости от кэп-структуры и не замечается рибосомами при удалении от 5'-конца более чем на 52 нуклеотида. В последнем случае у сканирующего прединициационного комплекса хватает энергии для разрушения этой структуры 5'UTR, но он не может быть собран при наличии шпильки, расположенной в непосредственной близости от кэп-структуры. Тем не менее, шпильки, удаленные от 5'-конца мРНК, могут подавлять трансляцию более чем на 85%, если их стабильность превышает –50 ккал/моль.

210

Интересно отметить, что структуры типа стебель–петля, образованные вслед за инициирующим AUG-кодоном, могут повышать эффективность инициации трансляции. Полагают, что такие структуры вызывают задержку сканирующего комплекса на инициирующем кодоне, что повышает вероятность его правильного распознавания. Например, элемент вторичной структуры, локализованный на 14 нуклеотидов ниже инициирующего кодона, оказывает стимулирующее влияние на распознавание слабых AUG-кодонов, а также инициирующих кодонов, отличающихся от AUG.

Шунтирование при сканировании мРНК. У некоторых вирусов растений, в частности при трансляции 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV), содержащей лидерную последовательность, в процессе инициации имеет место модифицированное сканирование, получившее название рибосомного шунта (см. рис. I.40,г). По этому механизму сканирующие рибосомы могут непосредственно переноситься из донорного в акцепторный сайт на РНК, избегая линейного сканирования расположенной между ними последовательности нуклеотидов. Такое явление было исследовано на искусственных матрицах, содержащих между донорным и акцепторным сайтами последовательности нуклеотидов, образующих интенсивную вторичную структуру. При этом в отсутствие функционирования шунта последовательности обладали ингибирующим действием, точно предсказываемым на основании модели сканирования. Интересно, что шунтирование внутренних последовательностей сканирующими рибосомами может происходить, хотя и с меньшей эффективностью, и in trans, т.е. в условиях, когда донорный и акцепторный сайты располагаются на разных молекулах РНК. Механизмы, лежащие в основе шунтирования, в настоящее время до конца не изучены. Полагают, что ключевую роль в этом могут играть специфические взаимодействия участков РНК, расположенных на больших расстояниях друг от друга. Механизм шунтирования обнаружен при трансляции РНК вируса Сендай, тройной лидерной последовательности аденовирусов, а также у паповавирусов.

Реинициация трансляции. В отличие от прокариотических, мРНК эукариот, как правило, моноцистронны, т.е. содержат только одну основную ОРС. Однако как уже упоминалось выше, часто 5'UTR эукариотических мРНК содержат короткие ОРС. Например, у дрожжей известно несколько сотен видов