3.2. Методы выделения и очистки белков

При выделении индивидуальных белков обычно сталкиваются со следующими трудностями:

1) низкое содержание белка в исходном материале (часто менее 0,1% от сухой массы);

2) лабильность белков, что не позволяет применять традиционные методы органической химии (нагревание, перегонка, кристаллизация);

3) связь белков со структурными элементами клеток или наличие их в белково-липидных, белково-углеводных и других комплексах биологических жидкостей;

4) наличие близких физико-химических свойств у разделяемых белков.

Последовательность операций по выделению и очистке индивидуальных белков следующая:

• измельчение биологического материала до гомогенного состояния (гомогенизация);

• перевод белков в растворенное состояние (солюбилизация, экстракция);

• фракционирование белков и получение обогащенной фракции;

• выделение индивидуального белка из обогащенной фракции;

• определение гомогенности выделенного белка.

Разработаны эффективные методы выделения белков в «мягких» условиях, при низкой температуре (не выше 4°С) для предотвращения тепловой денатурации, с применением щадящих нативную структуру химических реагентов.

3.2.1. Измельчение биологического материала до

гомогенного состояния (гомогенизация)

Большинство белков, в том числе и ферментов, локализовано внутри клеток. Поэтому перед выделением белков из биологических объектов (органов и тканей животных, клеток микроорганизмов и растений) исследуемый материал тщательно измельчают до гомогенного состояния, т. е. подвергают дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной структуры с целью высвобождения клеточного содержимого. Эту процедуру называют гомогенизацией. Для разрушения клеток применяют ряд физических методов – гомогенизацию с использованием механических гомогенизаторов различных конструкций, ультразвуковую дезинтеграцию, замораживание-оттаивание и др. При выборе метода разрушения клеток следует учитывать структурные особенности животных, растительных и микробных клеток. Наиболее простым методом является гомогенизация путем растирания клеток с окисью алюминия или абразивным порошком в ступке при помощи пестика. После гомогенизации биологического материала получают гомогенат.

3.2.2. Перевод белков в растворенное состояние

(солюбилизация, экстракция)

Гомогенизацию биологического материала обычно сочетают с одновременной солюбилизацией или экстракцией белков из гомогенатов с целью перевода белков в растворенное состояние.

В качестве экстрагентов используют 8–10%-ные растворы солей (NaCl, KCl), водные растворы глицерина, слабые растворы сахарозы (особенно для солюбилизации мембранных белков), различные буферные растворы, а также органические растворители.

На растворимость белков при их солюбилизации или экстракции большое влияние оказывает рН среды, поэтому в белковой химии широко применяют буферные растворы с близкими к нейтральным значениями рН.

Чувствительность биологических систем к изменениям рН среды обусловлена рядом причин. Ионы водорода могут выступать в качестве катализатора многих процессов, быть реагентом или продуктом реакции. Кроме того, при изменении рН может измениться проницаемость клеточной мембраны. Подобно другим клеточным структурам мембраны содержат способные к ионизации группы, и в зависимости от степени их ионизации меняется конформация, а следовательно, и биологическая активность молекул, в которые входят эти группы. Это прежде всего касается ферментов.

Благодаря своей химической природе буферные растворы препятствуют изменениям рН, способствуя как растворению, так и стабилизации белков. Буферные растворы – это смеси слабых кислот и сопряженных с ними оснований. Между этими двумя формами реагентов протекают обратимые реакции в состоянии равновесия: кислота является донором протонов, сопряженное основание – акцептором протонов при условии, что оба реагента присутствуют приблизительно в равных концентрациях. Буферный раствор сохраняет постоянное значение рН, связывая протоны, образующиеся в других реакциях, или, наоборот, освобождая их, если они потребляются в каких-то других процессах. Буферное действие раствора оптимально, когда обе эти возможности реализуются в равной степени, т. е. обеспечивается определенная концентрация протонов в данной системе при различных изменениях как внутри нее, так и в сопряженной фазе.

Буферные растворы должны удовлетворять следующим требованиям:

• обладать достаточной буферной емкостью в требуемом диапазоне значений рН (±1 ед. рН от значения рK);

• иметь высокую степень чистоты;

• обладать устойчивостью к действию ферментов и гидролизу;

• рН буферных растворов должен в минимальной степени зависеть от их концентрации, температуры и ионного или солевого состава среды;

• не оказывать токсического или ингибирующего действия;

• не поглощать свет при длинах волн более 240 нм.

Клетки содержат разные соли и много заряженных органических соединений – белков, фосфолипидов, нуклеиновых кислот. Ионная сила в цитоплазме типичной клетки колеблется в пределах 0,15–0,2 М. Для того чтобы быть уверенным, что все содержимое клетки перешло в экстракт, нужно использовать буферный раствор с ионной силой и значением рН, близкими к физиологическим. Особенно широкое распространение получили трис-буферные растворы, представляющие собой смесь растворов трис-(оксиметил)-аминометана (HOCH₂)₃CNH₂ (сокращенно обозначают «трис-») с растворами соляной или других кислот.

Не все белки способны существовать в солюбилизированном состоянии, будучи изолированы от их нормального клеточного окружения. Это относится к белкам, структурно связанным с нерастворимыми компонентами клетки, такими как плазматическая мембрана, митохондрии, хлоропласты, ядерные мембраны и др. Поэтому успех выделения и очистки таких белков зависит от того, насколько полно их можно отделить от других соединений, входящих в состав клеточных структур.

Большинство мембраносвязанных белков можно экстрагировать из мембран в присутствии детергентов, разрушающих гидрофобные взаимодействия между белками и липидами либо между белковыми молекулами в составе комплексов белков с молекулами липидов или с другими белками и в конечном счете разрушающих липидный бислой. В структуру детергентов входят липофильные цепи и при встраивании молекул детергента в мембраны они вытесняют молекулы белков из липид-белковых комплексов, т. е. детергенты солюбилизируют компоненты мембран (рис. 3.1).

Рис. 3.1. Схема солюбилизации мембранных белков детергентами

В частности, для освобождения белков (ферментов), прочно связанных с биомембранами митохондрий или других субклеточных структур, применяют додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия или тритон Х-100. Тритон – это торговое название целой серии неионных детергентов на основе полиэтиленгликоля. Следует отметить, что неионные детергенты, такие как тритон Х-100, очень мягки по своему действию, и большинство белков, как мембраносвязанных, так и свободных, выдерживают концентрации тритона Х-100 до 13%. Напротив, некоторые анионные детергенты (например, додецилсульфат натрия) обладают наряду с солюбилизирующими свойствами очень сильным денатурирующим действием, и их нельзя использовать при выделении ферментов.

Следует, однако, иметь в виду, что: 1) детергенты, вызывая разрыв белок-белковых связей, могут разрушать четвертичную структуру белков; 2) избыток детергента может мешать фракционированию белков.

Необходимо отметить, что при выделении ферментов для предотвращения окисления SH-групп остатков цистеина в буферный раствор добавляют такие тиолы, как -меркаптоэтанол или дитиотреитол.

Для предотвращения денатурации и других конформационных изменений белков, выделяемых из плазматической мембраны, в буферные растворы добавляют глицерин в концентрации до 20%. Это вещество полностью смешивается с водой и образует с молекулами воды сильные водородные связи, эффективно замедляя движение молекул и тем самым снижая активность воды.

После солюбилизации или экстракции белков полученный экстракт осветляют путем осаждения обломков клеток центрифугированием. Размер частиц является определяющим фактором при выборе скорости и продолжительности центрифугирования.