Лабораторная работа № 2 определение активности пероксидазы в растительных экстрактах

Цель работы – освоение методов выделения пероксидазы из растительного материала и определения ее активности.

Реактивы, материалы и оборудование: стебли льна-долгунца в фазе быстрого роста; иглица хвойных деревьев; оксид алюминия; 0,02 М трис-ацетатный буферный раствор (рН 7,0), содержащий 2 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF, 2 мМ дитиотреитола; 1,66 М раствор Н₂О₂; 1%-ные спиртовые растворы о-дианизидина, гваякола и кониферилового спирта; жидкий азот; шпатели; ступки; стеклянные палочки; центрифужные пробирки; пипетки на 1, 2, 5, 10 мл; автоматические пипетки на 200 и 1000 мкл; химически чистые пробирки; эппендорфовские пробирки на 1 мл; кюветы для спектрофотометра; штативы для пробирок; электронные весы; рН-метр; центрифуга; спектрофотометр.

Выполнение работы

1. Выделение из растительного материала фракций, обогащенных пероксидазой

Навеску растительного материала (стебли льна-долгунца в фазе быстрого роста, иглица хвойных деревьев) ~13 г измельчают, помещают в фарфоровую ступку и охлаждают жидким азотом. Замороженный материал растирают в порошок и добавляют 0,02 М трис-ацетатный буферный раствор (рН 7,0) из расчета 5 мл на 1 г растительного материала. Экстракцию проводят в течение 30 мин при температуре 4°С и периодическом перемешивании.

Гомогенат количественно переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 12 000 мин^1 на протяжении 10 мин. Супернатант разливают в эппендорфовские пробирки объемом 1 мл и замораживают.

2. Определение активности пероксидазы

Экстракты размораживают, в случае наличия возможного осадка центрифугируют при 12 000 мин^1 в течение 10 мин и после предварительного разбавления определяют в них концентрацию белка одним из описанных в разделе 3.3 методов, а также пероксидазную активность.

В спектрофотометрическую кювету (l = 1 см) помещают реакционную смесь, содержащую:

• 2,3 мл раствора белка;

• 0,1 мл 1%-ного спиртового раствора субстрата.

Реакцию запускают добавлением 0,1 мл 1,66 М раствора Н₂О₂. Общий объем пробы составляет 2,5 мл. Содержимое кюветы перемешивают и измеряют изменение экстинкции раствора в течение 45−60 с на спектрофотометре Specord M-40 с помощью специальной кинетической программы. Измерения проводят при длине волны, которая позволяет регистрировать изменение экстинкции вещества, имеющего хромофорные группы. Такими веществами в реакциях окисления о-дианизидина и гваякола являются продукты реакции, а конифериловый спирт сам выступает в роли соединения, обладающего характерным спектром поглощения в УФ-области.

Таким образом, для о-дианизидина и гваякола регистрируется скорость образования продукта реакции при длине волны 460 и 470 нм соответственно, а для кониферилового спирта – скорость превращения самого субстрата при длине волны 260 нм. С помощью программного обеспечения прибора проводится расчет величины начальной скорости реакции – тангенса угла наклона касательной к кинетической кривой в нулевой точке (изменение экстинкции в секунду E/S).

Каждое определение проводят 3 раза и за результат измерения принимают среднее арифметическое значение E/S.

Величину удельной пероксидазной активности вычисляют по следующей формуле:

(4.10)

где АП – удельная пероксидазная активность, мкмоль/(мин · мг белка); n – стехиометрический коэффициент для субстрата в реакции пероксидазного окисления (n = 2 для о-дианизидина, n = 4 для гваякола, n = 1 для кониферилового спирта); E/S – изменение экстинкции в единицу времени, с^1; 60 – количество секунд в 1 мин; V₁ – объем инкубационной смеси, мл; С – концентрация белка, мг/мл; V₂ – объем внесенного раствора белка, мл;  − коэффициент молярной экстинкции продукта или субстрата реакции, М^1 · см^1 (для реакции с о-дианизидином  = 30 000 М^1 · см^1; для реакции с гваяколом  = 26 000 М^1 · см^1; для кониферилового спирта  = 17 000 М^1 · см^1); l – толщина кюветы, см; 10³ – количество миллилитров в 1 л; 65,2 · 10³ – коэффициент пересчета, учитывающий известные величины.

В связи с тем, что концентрация концентрированной перекиси водорода точно не известна, при ее разбавлении концентрацию раствора определяют спектрофотометрически при 230 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 72,7 М^1 · см^1. В 3%-ном растворе Н₂О₂ концентрация равна 1,121 М.