Молекулярная биология клетки. Том 1

321

и ДНК; этот фермент закодирован в РНК ретровируса и при образовании дочерних вирусных частиц всегда упаковывается в их капсид. Когда одноцепочечная РНК ретровируса проникает в клетку, обратная транскриптаза сначала синтезирует ДНК-копию этой цепи РНК, в результате чего образуется гибридная ДНК-РНК-спираль, которую тот же фермент использует затем для образования двойной спирали, состоящей уже из двух цепей ДНК. Эта ДНК-копия вирусного РНК-генома включается в хромосому клетки-хозяина. Включению способствует закодированный вирусом фермент, осуществляющий сайт-специфическую рекомбинацию; он узнает определенную нуклеотидную последовательность в вирусной ДНК и катализирует включение вирусной ДНК практически в любой участок хромосомы клетки-хозяина (см. рис. 5-67, Б). Следующий этап инфекционного процесса составляет транскрипция интегрированной вирусной ДНК РНК-полимеразой клетки-хозяина; в результате появляется большое число молекул вирусной РНК, идентичных исходному инфицирующему геному. Завершается процесс трансляцией этих молекул РНК с образованием капсидных и мембранных белков, а также обратной транскриптазы; наконец, происходит сборка новых вирусных частиц, окруженных оболочкой, которые отпочковываются от клеточной мембраны (см. рис. 5-75).

Как РНК-, так и ДНК-содержащие опухолевые вирусы вызывают неопластическую трансформацию клеток, потому что присутствие в клетке вирусной ДНК индуцирует синтез новых белков, нарушающих регуляцию клеточного деления. Гены, кодирующие синтез таких белков, называются онкогенами. У опухолевых ДНК-вирусов онкогены обычно кодируют нормальные вирусные белки, необходимые для размножения вируса. Иначе обстоит дело у опухолевых РНК-вирусов: онкогены, которые они несут, представляют собой модифицированные формы нормальных генов клетки-хозяина - они для размножения вируса не требуются. Поскольку в капсид ретровируса может уместиться лишь некоторое ограниченное количество РНК, необходимые онкогенные последовательности нуклеотидов часто замещают собой существенную часть генома ретровируса и вирус оказывается дефектным. Мы расскажем позже (см. разд. 13.4.2 и разд. 21.2.1), почему изучение вирусных онкогенов послужило ключом к пониманию причин и природы рака, а также к познанию тех механизмов, которые в норме регулируют рост и деление клеток у многоклеточных организмов.

5.5.9. Некоторые транспозоны очень сходны с ретровирусами [51]

Поскольку многие вирусы способны включаться в хромосомы клеток-хозяев и выходить из них, можно предположить, что все крупные геномы содержат то или иное число различных провирусов. Вполне вероятно, что в этих геномах имеется также и ряд мобильных последовательностей ДНК, которые не образуют вирусных частиц и не могут покинуть клетку; их называют транспозонами. Транспозоны (размеры их колеблются от нескольких сотен до десятков тысяч нуклеотидных пар) обычно присутствуют в клетке в нескольких копиях. Они представляют собой нечто вроде крошечных паразитов, таящихся в хромосомах. Время от времени любой такой транспозон активируется и под влиянием собственного фермента, катализирующего сайт-специфическую рекомбинацию, переходит в какой-нибудь иной участок ДНК в пределах той же клетки. Этот процесс носит название транспозиции. Ферменты, катализирующие транспозицию, - их называют транспозазами - по большей части закодированы в ДНК самого транспозона. Большинство транспозонов переходит с места на место крайне редко (у бактерий приблизительно 1 раз на 105 генераций), так что их очень трудно отличить от

322

Рис. 5-75. Жизненный цикл одного из ретровирусов. Геном ретровируса представляет собой молекулу РНК, насчитывающую около 8500 нуклеотидов; в каждой вирусной частице упаковано две такие молекулы. Фермент обратная транскриптаза представляет собой ДНК-полимеразу, которая образует сначала ДНК-копию вирусной молекулы РНК, а затем вторую цепь ДНК, так что в итоге получается ДНК-копия РНК-генома. Включение этой двойной спирали ДНК в хромосому клетки-хозяина, катализируемое вирусным белком, необходимо для синтеза новых молекул вирусной РНК, осуществляемого РНК-полимеразой клетки-хозяина.

неподвижных участков хромосомы. Не знаем мы также и того, что служит пусковым механизмом для этого процесса.

Механизмы транспозиции могут быть различными. У одного крупного семейства транспозонов используемый для этой цели механизм полностью совпадает с частью жизненного цикла ретровируса. Такие элементы - их называют ретротранспозонами - известны у столь далеких друг от друга организмов, как дрожжи, плодовая мушка и млекопитающие. Одним из наиболее хорошо изученных ретротранспозонов является обнаруженный у дрожжей элемент Ту1. На первом этапе его транспозиции происходит транскрипция всего элемента с образованием РНК-копии, состоящей более чем из 5000 нуклеотидов. В этом РНК-транскрипте закодирована обратная транскриптаза, которая синтезирует кольцевую двухцепочечную ДНК-копию молекулы РНК через промежуточное соединение - гибридную двойную спираль РНК-ДНК точно так же, как это происходит в клетке, инфицированной ретровирусом (см. рис. 5-75). Аналогия сохраняется и далее, когда кольцевая ДНК включается в случайно выбранный участок хромосомы. Как и у ретровируса, включение осуществляется по типу сайт-специфической рекомбинации, представленной на рис. 5-67, Б; для этого, по всей вероятности, используется транспозаза, также закодированная в упомянутом выше длинном РНК-транскрипте. При всем поразительном сходстве с ретровирусом элемент Ту1 отличается от него тем, что будучи лишен функциональной белковой оболочки, он может перемещаться лишь внутри какой-нибудь одной клетки или может быть передан ее потомкам.

5-44

5.5.10. У другой группы транспозонов переход совершается непосредственно из одного участка генома в другой [52]

Многие транспозоны отличаются от ретротранспозонов тем, что они, по-видимому, никогда не существуют вне хромосомы клеткихозяина; транспозазы, катализирующие их перемещение, действуют на ДНК

323

Рис. 5-76. Структура транспозона, перемещающегося непосредственно из одного участка хромосомы в другой. Узнаются транспозоны этого типа по наличию у них на концах двух инвертированных повторяющихся последовательностей ДНК. Как показали эксперименты, именно эти повторяющиеся последовательности (длиной иногда не более 20 нуклеотидов) требуются для того, чтобы находящаяся между ними ДНК могла быть перенесена на новое место специальным ферментом транспозазой. На схеме показан белковый комплекс, образующийся на первом этапе процесса транспозиции. Дальнейшие события включают разрыв ДНК на концах инвертированных повторяющихся последовательностей и ряд других этапов, которые можно рассматривать как модификацию схемы, представленной на рис. 5-67, Б (см. также рис. 5-77).

транспозона в то время, как он пребывает в интегрированном состоянии в геноме хозяина. Транспозаза, как полагают, связывается с короткими нуклеотидными последовательностями, повторяющимися в инвертированном виде на обоих концах транспозона, и тем самым сближает эти концы для последующей рекомбинации, которую она катализирует (рис. 5-76). У некоторых транспозонов механизм транспозиции сводится всего лишь к разрыву и воссоединению ДНК; два конца транспозона присоединяются при этом к концам хромосомы в другом ее участке, там, где в ней возник ступенчатый разрыв (см. рис. 5-67, Б). Такие транспозоны переходят непосредственно из одного участка хромосомы в другой без сопутствующей репликации ДНК. Однако при сшивании хромосомы в том месте, откуда был удален транспозон, ее нуклеотидная последовательность нередко нарушается, т. е. в этом участке хромосомы возникает мутация.

Существуют также транспозоны, при перемещениях реплицирующиеся. Лучше других изучен пример, в котором сайт-специфическая рекомбинация «запускает» локальный синтез ДНК; одна копия реплицировавшегося транспозона включается при этом в какой-либо новый случайно выбранный участок хромосомы, а другая остается в старом участке (рис. 5-77). Механизм процесса очень близок к тому, который мы только что описали для нерепликативного пути. Известны транспозоны, способные использовать как гот, так и другой путь.

Перемещаясь сами, транспозоны всех типов прихватывают иногда и соседние нуклеотидные последовательности генома хозяина или вызывают в них перестройки. Часто результатом оказываются делеции в соседних участках генома или перенос соседних последовательностей на новое место. Присутствие в хромосомах транспозонов делает их нуклеотидные последовательности менее стабильными, нежели это считалось ранее; возможно, именно эти элементы несут ответственность за многие изменения в геномах, существенные для эволюции.

Можно ли приписать транспозонам еще одну важную эволюционную роль, а именно можно ли считать их древнейшими предками вирусов? Что касается ретровирусов, то они, по-видимому, действительно про-

324

Рис. 5-77. Схема, иллюстрирующая перемещение в хромосоме одного из типов транспозонов. Транспозон этого типа реплицируется в процессе транспозиции, так что, появляясь в новом участке хромосомы, он в то же время в виде одной из копий остается и в старом участке. Две инвертированные повторяющиеся последовательности ДНК на концах транспозона представлены здесь красными прямоугольниками. В начале процесса транспозиции транспозаза разрывает одну из двух цепей ДНК на обоих концах транспозона, чтобы мог начаться синтез ДНК, для которого транспозон служит матрицей. Синтез идет путем добавления нуклеотидов к 3'-концам нуклеотидных последовательностей ДНК хромосомы. Известны и последующие этапы этого процесса, но весь он в целом слишком сложен для того, чтобы рассматривать его здесь.

изошли от ретротранспозонов. Однако нельзя упускать из виду, что все ныне существующие транспозоны теснейшим образом зависят от метаболизма ДНК, у первых же клеток геномы состояли, как полагают, не из ДНК, а из РНК. Очевидно поэтому, путь к самым истокам происхождения вирусов следует искать именно в метаболизме РНК.

5.5.11. Большинство вирусов, вероятно, возникло в процессе эволюции из плазмид [53]

Даже самые крупные вирусы не способны осуществлять биосинтетические процессы самостоятельно; они зависят в этом отношении от клеток-хозяев. Среди известных нам вирусов ни один не имеет собственных рибосом и не обладает способностью синтезировать АТР, в котором он нуждается. Ясно поэтому, что клетки должны были появиться в процессе эволюции раньше вирусов. Предшественниками вирусов были, вероятно, небольшие фрагменты нуклеиновых кислот, которые приобрели способность размножаться независимо от хромосом их клеток-хозяев. Такие независимо размножающиеся элементы - их назвали плазмидами - реплицируются самостоятельно. Плазмиды встречаются как в ДНК-, так и в РНК-форме, и так же как вирусы, они содержат особую нуклеотидную последовательность, которая служит точкой начала репликации. Однако в отличие от вирусов они не способны синтезировать белок для построения белковой оболочки и, не имея такой оболочки, не могут свободно переходить из клетки в клетку. Многие из них не способны также включаться в хромосому клетки-хозяина.

Возможно, что первые РНК-плазмиды напоминали собой вироиды, встречающиеся в некоторых растительных клетках. Эти небольшие кольцевые молекулы РНК (не более 300-400 нуклеотидов) размножаются, хотя они и не кодируют никаких белков (см. рис. 10-61). Не имея капсида, вироиды существуют лишь как голые молекулы РНК и переходят от растения к растению только в том случае, когда и донорная клетка, и клеткареципиент оказываются поврежденными, т. е. когда между ними не существует мембранного барьера, который вироид не способен преодолеть. Под давлением естественного отбора такие независимо реплицирующиеся элементы могли, очевидно, включать в себя те нуклеотидные последовательности клетки-хозяина, которые облегчали их самостоятельное размножение, в том числе и некоторые последовательности, кодирующие белки. Некоторые известные нам плазмиды действительно достаточно сложны: в них закодированы белки и молекулы РНК, регулирующие их размножение, а также белки, регулирующие их распределение между дочерними клетками. Самые крупные среди известных плазмид представляют собой кольцевые

325

двухцепочечные спирали ДНК, насчитывающие свыше 100000 пар нуклеотидов.

Первый вирус возник, вероятно, когда у плазмиды появился ген, кодирующий белок капсида. Однако в капсиде умещается ограниченное количество нуклеиновой кислоты, и, значит, число генов, которые вирус может в себе заключать, лимитируется размерами капсида. Будучи вынуждены оптимальным образом использовать свой небольшой геном, некоторые мелкие вирусы (вроде бактериофага ФХІ74) обзавелись в ходе эволюции перекрывающимися генами, в которых часть нуклеотидной последовательности, кодирующей один какой-нибудь белок, используется (с той же или с иной рамкой считывания) для кодирования второго белка. У других вирусов в процессе эволюции возникли более крупные капсиды, что должно было дать им возможность приобретать новые полезные гены.

Обладая уникальной способностью к переносу ДНК через видовые барьеры, вирусы, почти несомненно, играли важную роль в эволюции тех организмов, которые они инфицируют. Многие вирусы часто вступают в рекомбинацию как друг с другом, так и с хромосомами клеток-хозяев; при этом они захватывают случайные фрагменты хромосом и переносят их в другие клетки или другие организмы. Кроме того, включившиеся в геном хозяина (интегрированные) копии вирусной ДНК (провирусы) становятся постоянными компонентами генома у большей части организмов. Примеры таких провирусов мы находим в семействе бактериофагов λ и среди так называемых эндогенных ретровирусов, многочисленные копии которых обнаруживаются в геномах позвоночных. Интегрированная вирусная ДНК часто видоизменяется так, что способность образовывать полноценный вирус у нее утрачивается, но она все еще может кодировать белки, причем некоторые из них оказываются полезными для клетки. Вирусы, следовательно, так же, как и половой процесс, создают возможности для ускорения эволюции, открывая для нее такой путь, как смешение генофондов различных организмов.

С помощью вирусов отдельные последовательности ДНК переносятся из генома в геном (феномен трансдукции). Таким образом, вирусы можно использовать как инструмент для переноса генов из одной клетки в другую. Вирусы, а также очень близкие к ним плазмиды и транспозоны играют важную роль в биологии клетки и по другим причинам. Благодаря тому что они относительно просто устроены, изучение процесса их размножения продвигается чрезвычайно быстро, а полученные при этом данные позволяют судить об основных генетических механизмах клеток. Кроме того, вирусы и плазмиды стали главными элементами в технологии рекомбинантной ДНК. К рассмотрению этой последней темы мы теперь и перейдем.

Заключение

Вирусы — это инфекционные частицы, которые состоят из молекул ДНК или РНК (они образуют геном вируса), упакованных в белковый капсид; у некоторых вирусов капсид окружен еще и мембранной оболочкой, основу которой составляет липидный бислой. Строение вирусного генома и способы его репликации у разных вирусов сильно варьируют. Вирус способен размножаться только в клетке-хозяине, используя для этого ее генетические механизмы. Обычно вирусная инфекция завершается лизисом инфицированной клетки и высвобождением потомства вируса. Однако некоторые вирусы могут включаться в хромосому клетки, не вызывая лизиса последней. Здесь вирусные гены (в форме провируса) реплицируются вместе с генами хозяина. Считается, что многие вирусы

326

возникли в ходе эволюции из плазмид, которые представляют собой самореплицирующиеся молекулы ДНК или РНК, не способные окружать себя белковой оболочкой.

Транспозоны - это нуклеотидные последовательности ДНК, отличающиеся от вирусов тем, что размножаясь только в клеткаххозяевах или в их потомстве, они, подобно плазмидам, не могут покинуть клетку. От плазмид же транспозоны отличаются тем, что они обычно реплицируются лишь в составе хромосомы хозяина, как ее неотъемлемая часть. Некоторые транспозоны, однако, весьма напоминают ретровирусы: они перемещаются в новые участки генома в результате обратной транскрипции промежуточного РНК-соединения. Существуют и транспозоны, способные оказаться в новом участке хромосомы, сохранив свою копию и на прежнем месте. Хотя и вирусы, и транспозоны могут рассматриваться как паразиты, они полезны тем, что вызываемые ими перестройки нуклеотидных последовательностей ДНК нередко играют важную роль в эволюции клеток и организмов.

5.6. Клонирование ДНК и генная инженерия [54]

Открытия, о которых шла речь в этой главе, были порождены стремлением ученых постичь жизнь клеток и основные механизмы наследственности. Однако в последние годы эти фундаментальные знания получили практическое применение. Методы клонирования ДНК и генная инженерия дают возможность выделять те или иные гены в достаточном количестве, «перекраивать» их по своему усмотрению и затем вновь вводить в какие-нибудь клетки и организмы. Эти методы составляют лишь часть того общего набора методов, который известен как технология рекомбинантных ДНК (о нем мы уже говорили в гл. 4). Появление технологии рекомбинантных ДНК вызвало подлинную революцию в науке о живых клетках. Кроме того, оно открыло перед медициной и промышленностью новые пути к получению в достаточном количестве тех белков, которые раньше либо были недоступны вообще, либо могли быть получены лишь в очень малых количествах.

5-48

5-49

5-50

5.6.1. Рестрицирующие нуклеазы облегчают клонирование генов [55]

В 1960-е годы возможность выделить в изолированном виде отдельный ген казалась бесконечно далекой. Ген в клетке в отличие от белка не представляет собой некой дискретной единицы; он есть не что иное, как небольшой участок во много раз большей молекулы ДНК. И хотя механическим воздействием молекулы ДНК в клетке можно разделить на множество сегментов, это разделение происходит по закону случая, и фрагмент, содержащий интересующий нас ген может затеряться среди миллиона других фрагментов. Как получить нужный ген в очищенном виде? Поскольку все молекулы ДНК состоят из одних и тех же четырех видов нуклеотидов, которые входят в их состав примерно в равных пропорциях, их нельзя легко разделить подобно тому, как это делают с белками, на основе различий в их зарядах или по их способности связываться с теми или иными реагентами (см. разд. 4.4.3). Более того, если бы даже какую-нибудь схему очистки и можно было предложить, понадобилось бы очень много ДНК для того, чтобы получить нужный ген в количестве, достаточном для последующих экспериментов. Решение всех этих проблем стало реальным, когда были открыты

327

Рис. 5-78. Липкие концы, образующиеся под действием многих рестрицирующих нуклеаз (см. рис. 4-63), обеспечивают возможность соединения двух фрагментов ДНК за счет комплементарных взаимодействий. Фрагменты ДНК, соединившиеся таким путем, связываются затем ковалентно в высокоэффективной реакции, катализируемой ДНК-лигазой. Здесь представлен случай образования рекомбинантной молекулы ДНК, состоящей из плазмиды и встроенной в нее хромосомной ДНК.

ферменты, названные рестрицирующими нуклеазами (рестриктазами). Эти ферменты, которые можно выделить в очищенном виде из бактериальных клеток, разрезают двойную спираль ДНК по специфическим последовательностям из 4-8 нуклеотидов, разделяя ее на фрагменты строго определенного размера (их называют рестрикционными фрагментами). Специфичность рестрицирующих нуклеаз в отношении нуклеотидных последовательностей у разных видов бактерий различна, так что не очень трудно подобрать такую рестриктазу, которая вырежет небольшой фрагмент ДНК, содержащий определенный ген. Размер этого рестрикционного фрагмента и послужит затем ориентиром для частичной очистки данного гена (выделения его из смеси).

Еще одно свойство рестрицирующих нуклеаз делает их удобным инструментом для клонирования генов. Многие из них вызывают ступенчатые разрывы, вследствие чего на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты». Их называют липкими концами, потому что они способны к комплементарному взаимодействию с любым другим концом, образовавшимся под действием того же фермента. Благодаря липким концам, образуемым рестрицирующей нуклеазой, два фрагмента двойной спирали ДНК, происходящие из разных геномов, могут соединиться в одно целое путем спаривания оснований (рис. 5-78). Можно, например, присоединить in vitro фрагмент ДНК, содержащий какой-нибудь ген человека, к хромосоме вируса бактерий и полученную таким путем новую рекомбинантную молекулу ДНК ввести затем в бактериальную клетку. Начав с одной этой рекомбинантной молекулы ДНК, инфицировавшей одну бактериальную клетку, репликационная машина вируса может менее чем за сутки выработать свыше 1012 идентичных молекул вирусной ДНК, а значит, точно в такой же мере размножить и присоединенный к ней фрагмент ДНК человека. Вирус, используемый для подобной цели, называют клонирующим вектором.

5-51

5.6.2. Получение библиотеки ДНК с помощью вирусных или плазмидных векторов [56]

Клонирование того или иного гена начинается с создания библиотеки ДНК в вирусном или плазмидном векторе. Принципы, лежащие в основе клонирования генов, для обоих этих типов векторов одинаковы, хотя в деталях методы могут и различаться. Ради простоты мы в этой главе пренебрежем различиями и проиллюстрируем методы, о которых идет речь, применительно к плазмидам.

Плазмидные векторы, используемые при клонировании генов, пред-

328

Рис. 5-79. Очистка и амплификация специфической последовательности ДНК путем клонирования ДНК в бактериальных клетках.

ставляют собой небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, происходящие от более крупных плазмид, обычно присутствующих в клетках бактерий, дрожжей и млекопитающих (см. разд. 5.5.11). Как правило, они составляют лишь небольшую фракцию всей ДНК клетки-хозяина, однако благодаря малым размерам их можно легко отделить от молекул хромосомной ДНК, которые, будучи более крупными, при центрифугировании оказываются на дне пробирки. Клонирование начинают с того, что очищенные кольцевые молекулы плазмидной ДНК обрабатывают одной из рестриказ и получают таким путем линейные молекулы ДНК. Затем клеточную ДНК, из которой требуется создать библиотеку, разрезают при помощи той же рестриктазы и полученные рестрикционные фрагменты (включая и те, в которых присутствует клонируемый ген) добавляют к разрезанным плазмидам, а затем подвергают отжигу, для того чтобы могли образоваться рекомбинантные кольцевые молекулы ДНК. Ковалентное сшивание под действием ДНК-лигазы завершает образование этих рекомбинантных молекул, содержащих вставки чужеродной ДНК (см. рис. 5-78).

Следующий шаг к получению библиотеки ДНК состоит в том, что рекомбинантные кольцевые молекулы ДНК вводят в клетки (обычно бактериальные или дрожжевые), сделав их для этой цели временно проницаемыми для ДНК; клетки, как принято говорить, трансфицируют плазмидами. Теперь, когда эти клетки растут и делятся, рекомбинантные плазмиды также реплицируются, в результате чего получается в конце концов огромное количество копий кольцевых молекул, содержащих чужеродную ДНК (рис. 5-79). Многие бактериальные плазмиды несут в себе гены устойчивости к антибиотикам. Это их свойство можно использовать для того, чтобы отделить трансфицированные клетки от тех, которые остались нетрансфицированными: если выращивать бактерии в присутствии антибиотика, то выживут и образуют колонии только те клетки, которые содержат плазмиды. Эти выжившие клетки и заключают в себе библиотеку ДНК. Однако лишь немногие из них несут те рекомбинантные плазмиды, в которых находится подлежащий выделению ген. Надо уметь их идентифицировать, чтобы получить интересующую нас ДНК в очищенном виде и в достаточном количестве. Прежде чем говорить о том, каким способом можно этого достичь, нам следует описать и другой путь получения библиотеки ДНК, также используемый при клонировании.

5.6.3. Два типа библиотек ДНК используются для разных целей [57]

Описанное выше в качестве одного из этапов клонирования разрезание генома на фрагменты с помощью рестрицирующей нуклеазы называют иногда «методом дробовика» (шотган-клонирование). Фрагменты ДНК образуются при этом в огромном количестве - до миллиона, если речь идет о геноме млекопитающих, а это значит, что и число различных колоний трансфицированных клеток также должно достигать миллионов. Каждая такая колония представляет собой клон, т. е. совокупность потомков одной клетки-родоначальницы, и рекомбинантная плазмида в любой клетке клона несет одну и ту же включенную в нее нуклеотидную последовательность геномной ДНК. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а вся совокупность плазмид вмещает библиотеку геномной ДНК. Однако, поскольку разрезание геномной ДНК на фрагменты определяется случаем, лишь некоторые образовавшиеся фрагменты содержат полноценные гены; во многие из них попадает только часть какогонибудь гена, а в большинстве клонов геномной ДНК, полученных из ДНК высших эукариотических клеток,

329

Рис. 5-80. Синтез кДНК. Обратная транскриптаза синтезирует ДНК-копию (кДНК) молекулы мРНК, образуя таким путем гибридную спираль ДНК/РНК. Под действием щелочи РНК-цепь этой гибридной спирали распадается на отдельные нуклеотиды, после чего оставшаяся одноцепочечная кДНК копируется ДНК-полимеразой с образованием двухцепочечной кДНК. Как видно из схемы, для начала синтеза обоим ферментам необходима затравка. Для обратной транскриптазы затравкой служит небольшой олигонуклеотид, в данном случае к длинной последовательности polyA, имеющейся на 3'-конце почти всех мРНК, присоединяется oligo(dT).

Отметим, что у образовавшейся здесь двухцепочечной молекулы кДНК отсутствуют липкие концы; такие молекулы ДНК, с «тупыми» концами, можно клонировать при помощи нескольких процедур, сходных с той, какая представлена на рис. 5-78, хотя и менее эффективно. Можно, например, пришить к концам кДНК синтетические олигонуклеотиды, содержащие участки, в которых рестрицирующий фермент вызывает разрыв, или присоединить ферментативным путем к концам молекулы кДНК одноцепочечные «хвосты», чтобы облегчить включение этой молекулы в клонирующий вектор присутствует лишь некодирующая ДНК, составляющая, как известно, большую часть массы такого генома (см. разд. 9.1.3).

Альтернативный метод начинает процесс клонирования с отбора тех последовательностей ДНК, которые транскрибируются в РНК и, значит, предположительно соответствуют генам. Осуществляется это путем извлечения из клеток мРНК (или очищенной субфракции мРНК) и затем получения комплементарной ДНК-копии (кДНК) каждой наличной молекулы мРНК; эта реакция катализируется обратной транскриптазойферментом ретровирусов, синтезирующим цепь ДНК на РНК-матрице (см. разд. 5.5.8). Одноцепочечные молекулы ДНК, синтезированные обратной транскриптазой, превращаются в двухцепочечные молекулы ДНК под действием ДНК-полимеразы, а эти двухцепочечные молекулы включаются в плазмиды и образуют клоны (рис. 5-80). Каждый полученный таким путем клон называется клоном кДНК, а вся совокупность клонов, происходящих от одного препарата мРНК, составляет библиотеку кДНК.

Как видно из рис. 5-81, клоны геномной ДНК и клоны кДНК существенным образом различаются. Геномные клоны представляют собой случайную выборку из всех нуклеотидных последовательностей ДНК данного организма. Состав геномной библиотеки не зависит от того, какой тип клеток был выбран для ее получения. В отличие от этого клоны кДНК содержат лишь те участки генома, которые транскрибируются в мРНК, а так как в клетках разных тканей наборы синтезируемых молекул мРНК различны, то и библиотеки кДНК различны для разных типов клеток, используемых при их конструировании.

330

Рис. 5-81. Схема, иллюстрирующая различия между клонами кДНК и клонами геномной ДНК. В этом примере ген А транскрибируется редко, а ген В - часто. Оба типа РНК-транскриптов подвергаются процессингу путем сплайсинга, в результате чего при образовании мРНК удаляется единственный представленный здесь интрон. Большинство генов содержит много интронов (см. табл. 9-1).

Клонирование генов на основе библиотек кДНК имеет ряд преимуществ. Первое из них связано с тем, что многие белки вырабатываются специализированными клетками в очень больших количествах, а значит, в избытке синтезируется и мРНК, кодирующая подобный белок. Библиотека кДНК для таких клеток, естественно, обогащена молекулами кДНК, кодирующей данный белок (рис. 5-81). Это обилие именно нужных молекул кДНК сильно облегчает задачу распознавания требуемого клона в библиотеке. Гемоглобин, например, синтезируется в больших количествах в развивающихся эритроцитах, и как раз по этой причине в числе первых подвергнутых клонированию генов были гены глобина.

Другое преимущество клонов кДНК заключается в том, что в них кодирующая нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается. Эукариотические гены, как известно, состоят из кодирующих последовательностей ДНК, разделенных некодирующими, так что синтез мРНК на таких генах должен сопровождаться удалением из исходного РНК-транскрипта некодирующих (интронных) участков и сплайсингом (сращиванием) остающихся фрагментов, т. е. кодирующих последовательностей. Ни бактериальные, ни дрожжевые клетки не способны осуществить такую модификацию РНК, образовавшейся путем транскрипции гена высшей эукариотической клетки. Поэтому, если цель клонирования состоит в определении аминокислотной последовательности белка по данной ДНК или в получении больших количеств белка путем экспрессии клонированного гена в бактериальной или дрожжевой клетке, то начинать предпочтительнее именно с кДНК.

Библиотеки геномной ДНК и к ДНК - неисчерпаемый источник для соответствующих работ и исследователи часто пользуются ими сообща; неуклонно растет также и число таких библиотек, поставляемых специализированными фирмами.

Рис. 5-82. Применение субтрактивной гибридизации для очистки тех редких клонов кДНК, которые соответствуют молекулам мРНК, имеющимся в Т-лимфоцитах, но отсутствующих в В-лимфоцитах. Поскольку два этих типа клеток очень сходны, большая часть мРНК должна быть

свойственна как тому, так и другому типу. Данная процедура, таким образом, представляет собой очень эффективный способ обогащения теми специализированными молекулами, по которым два этих типа клеток отличаются друг от друга. →