инженерия

1.предмет.основные этапы.

Генетическая инженерия как новое направление возникла на стыке результатов исследований в области нескольких биологических наук

-Молекулярной генетики

-Биохимии (химии нуклеиновых кислот и энзимологии)

-Молекулярной биологии

2. Теоретические предпосылки генетической инженерии

1972 г. - дата рождения генетической инженерии

Создана первая искусственная (рекомбинантная) ДНК, содержащая несколько фрагментов ДНК, а именно :

-вируса SV40

-бактериофага Р dvgal

-галактозного оперона Escherichia col

Рекомбинантная ДНК – это молекула ДНК, сконструированная in vitro

Генетическая инженерия позволяет преодолеть установленные природой видовые барьеры и осуществить неограниченное межвидовое скрещивание, т.к. инструменты генетической инженерии лишены видовой специфичности

Аксиломарская конференция (1975) по биобезопасности работ с рекомбинантными ДНК in vitro

3. Общие принципы и методы генетической инженерии

Генетическая инженерия – конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК) или иначе – создание искусственных генетических систем, в которых гены или их части объединяются в заданной последовательности (А.А. Баев)

Генетическая инженерия – это раздел экспериментальной молекулярной биологии (С.Н. Щелкунов)

Генетическая инженерия @ генная инженерия

Схема типичного эксперимента по получению и молекулярному клонированию рекомбинантных ДНК

Молекулярное клонирование – получение копий созданной рекомбинантной ДНК

4. Ферменты генетической инженерии

Рестрикционные эндонуклеазы, Лигазы , ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, Поли (А)-полимеразы, Дезоксирибонуклеазы, Рибонуклеазы

Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы)

-Рестрикционные эндонуклеазы – это ферменты, осуществляющие образование разрывов в молекулах ДНК

-Первая рестриктаза была выделена в 1968 г. Мезельсоном и Юанем

-Одна из наиболее распространенных рестриктаз - EcoRI

Номенклатура рестриктаз (Х. Смит и Д. Натанс, 1973г.)

Название фермента является производным от родо-видового обозначения микроорганизма, оно составляется по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида (Escherichia coli – Eco). За родо-видовым названием следует в случае необходимости обозначение штамма или серотипа (Escherichia coli R – EcoR). Различные рестриктазы, одной и той же бактериальной клетки, обозначаются римскими цифрами (Escherichia coli R – EcoR I, EcoR V)

Действие рестриктаз класса I на молекулу ДНК ЕсоR K TGA (N) 8 TGTC , ЕсоR B AAC(N) 6 GTGC Фермент имеет несколько активностей : расщепление ДНК,метилирование ДНК, узнавание специфической последовательности Расщепление ДНК совмещено с гидролизом АТФ, требуется Mg2+. Расщепление проходит на расстоянии 400-700 пн от участка узнавания, при этом образуются гетерогенные продукты, что объясняется неодновременным случайным взаимодействием молекул фермента с разными участками узнавания ДНК и неодновременным началом транслокации цепей.

Нарушение специфичности действия рестриктаз происходит в случае:-внесения большого избытка рестриктаз при этом происходит расщепление ДНК по дополнительным участкам, -снижения ионной силы и повышение рН растворов, -введения в раствор органических растворителей, -введения в раствор ионов Mn2+

Рестриктазы класса II являются основными инструментами генетической инженерии. -Прототип - рестриктаза, сайт рестрикции которой выявлен впервые. -Новой считается любая рестриктаза, найденная в неизученном ранее штамме. -Ферменты, имеющие одинаковые узнаваемые последовательности и одинаково их расщепляющие называются изошизомерами

Например, рестриктазы HapII, HpaII и MnoI

4. действие рестриктаз класса II на молекулу ДНК

Образование фрагментов ДНК с тупыми концами (Alu I)

Образование фрагментов ДНК с липкими концами (EcoR I)

Сайт рестриктазы Alu I

Большинство рестриктаз узнают тетра- и гекса- нуклеотидные последовательности

-тетра-нуклеотидные последовательности встречаются в среднем через 256 пар оснований ,рестриктазы узнающие такие последовательности называются мелкощепящими

-гекса-нуклеотидные последовательности встречаются в среднем через 4096 пар оснований

-рестриктазы, узнающие такие последовательности называются крупнощепящими

Особенности действия рестриктаз BamHI, BglII и Sau3AI-Ферменты обладают разной специфичность, но дают одинаковые липкие концы.Лигирование приводит к образованию последовательности, которая узнается другим ферментом

BamHI, BclI, BglII, XhoII-GATC,, SalGI XhoI, AvaI - NCGA

Свойства рестриктаз класса III

-Узнают несимметричные последовательности длиной 5-6 пн и расщепляют ДНК в стороне от участков узнавания на расстоянии 24-27 пн, образуя одноцепочечные 5‘-концы длиной 2-3 нуклеотида

-Требуют: АТФ и ионы Mg2+

11. Векторные молекулы ДНК

Вектор – это фрагмент, обеспечивающий репликацию гибридной молекулы ДНК в клетке)

Основные свойства вектора:

-присутствие ограниченного количества сайтов рестрикции (предпочтительно один)

-наличие генетических маркеров для отбора рекомбинантных ДНК

-сохранение репликативных функций после встраивания фрагмента чужеродной ДНК

-стабильное поддержание копий в клетках-реципиентах

Векторами могут быть плазмиды, фрагменты

хромосом, фаги, вирусы

12.

Экспрессирующий вектор – это вектор, который наряду с амплификацией обеспечивает правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в клетках- реципиентах (плазмиды)

Интегративный вектор – это вектор, который может обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном хозяина (фрагменты хромосом, фагов, вирусов)

Особенности контроля репликации векторов

Количество копий молекул вектора на клетку-

-Менее 10 Особенности контроля репликации векторов -Строгий контроль

-10-200 - Ослабленный контроль

Векторы клонирования в бактериях

• Плазмидные векторы

• Векторы на основе бактериофага λ

• Космиды

• Векторы на основе однонитевых фагов

• Фазмиды

• Векторы специального назначения

5. ДНК-лигаза

ДНК-лигаза – это фермент, катализирующий образование фосфодиэфирной связи в двухцепочечной молекуле ДНК, Т.Е. ПРОЦЕСС ЛИГИРОВАНИЯ (СШИВАНИЯ)

ДНК-лигаза фага Т4

– мономерный полипептид (молекулярная масса 68 кДа)

– катализирует образование фосфодиэфирной связи между ‘-фосфатным (5‘-р) и 3 гидроксильным (3‘-ОН) концами ДНК

Лигирование тупых концов фрагментов ДНК

Лигирование липких концов фрагментов ДНК

ДНК-лигаза фагаТ4

обеспечивает объединение любых двуцепочечных фрагментов ДНК , поэтому данный фермент является одним из важнейших ферментов создания рекомбинантных молекул ДНК

6. ДНК-полимераза I E. coli (Pol I)

Обнаружена А. Корнбергом в 1958 г.

Мономерный полипептид с молекулярной массой 103 кДа, имеет трехдоменную структуру.

Каждый домен обладает отдельной ферментативной активностью:

N-концевой домен - 5‘-3 ‘-экзонуклеазной; С-концевой - 5‘-3 ‘- полимеразной; средний домен - 3‘-5‘ - экзонуклеазной

Связывается с одноцепочечными участками двойной спирали ДНК в местах одноцепочечных разрывов, а также с концами двухцепочечных молекул ДНК

5‘-3‘- полимеразная активность Pol I

Фермент осуществляет реакцию синтеза комплементарной цепи ДНК

Необходимы:

-одноцепочечная ДНК-матрица

-комплементарный фрагмент – праймер (затравка) с 3‘-ОН концом

3‘-5‘- экзонуклеазная активность Pol I

Фермент осуществляет реакцию расщепления фосфодиэфирных связей в неспаренных участках ДНК (гидролиз ДНК с 3‘-ОН конца)

В ходе реакции убирается ошибочный нуклеотид на место которого присоединяется правильный, что обеспечивает точность полимеризации, направляемой матрицей

Необходима -одно- или двухцепочечная ДНК-матрица

5‘-3‘- экзонуклеазная активность Pol I

-Фермент осуществляет реакцию расщепления фосфодиэфирной связи одной цепи двухцепочечной ДНК, начиная со свободного 5‘-конца

-Нуклеаза может вырезать с 5‘-конца до 10 нуклеотидов

-Реакция играет важную роль в репарации повреждений ДНК in vivo

Использование ДНК полимеразы Iи ее фрагментов

-Pol I используется для ведения меченых дезоксирибонуклеотидов в синтезируемые цепи ДНК путем перемещения одноцепочечного разрыва вдоль двухцепочечной ДНК, в котором 3‘-ОН-конец используется в качестве затравки (ник-трансляция), при этом Pol I прокладывает себе путь с помощью 5‘-3 ‘- экзонуклеазной активности

-Термостабильная Taq-ДНК-полимераза широко используется для проведения ПЦР

7. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli (Pol I)

• Содержит С-концевой и средний домены Pol I

• Обладает

  • 5‘-3‘ – полимеразной

  • 3‘-5‘ – экзонуклеазной активностями

• Используется в методе репарации направляемой праймером

• Секвенирования ДНК по методу Сэнгера

• Заполнения 5‘-выступающих липких концов с образованием тупых

• Введения концевой метки

• Удаления 3‘-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК

8. РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза, РНК-полимераза, ревертаза)

• Открыта в 1970 г. Х. Теминым, С. Мизутани и независимо от них Д. Балтимором

• Состоит из двух субъединиц - α (65 кДа) и β (95 кДа)

• Обладает тремя активностями:

  • ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК Для синтеза необходим праймер

  • Активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК

  • ДНК-эндонуклеазной

9. Поли(А)-полимераза E. coli

-Поли(А)-полимераза открыта А Сиппелом в 1973 г.

-Катализирует присоединение к свободному 3‘-ОН-концу одноцепочечных молекул РНК поли(А)-последовательностей

Нуклеаза Bal31

Обнаружен в 1975 г. Х. Грей с соавторами

Фермент обладает активностями

-Экзонуклеазы, катализирующей удаление олигонуклеотидов или мононуклеотидов одновременно с 5‘- и 3‘-концов двухцепочечной ДНК, при этом обе цепи деградируют одновременно с одинаковой скоростью

-Эндонуклеазы, специфичной к одноцепочечной ДНК

Используется для образования тупых концов в экспериментах когда необходимо сблизить какие-либо функционально значимые генетические элементы

Концевая дезоксирибонуклеотидилтрансфераза (терминальная трансфераза)

• Обнаружена Ф.Боллумом в тимусе теленка

• Катализирует последовательное присоединение дезоксирибонуклеотидов к 3‘-ОН концу молекулы одноцепочечной или двухцепочечной ДНК с выступающим к 3‘-ОН концом

• Требует присутствия ионов Mg2+

• В присутствии ионов Co2+ может катаболизировать присоединение дезоксиринуклеотидов к 3‘-ОН концу двухцепочечной ДНК с тупыми концами

• С помощью этого фермента выполнен первый эксперимент по рекомбинации ДНК in vitro

10. Дезоксирибонуклеазы

-Экзонуклеаза III E.coli-Катализирует последовательное отщепление нуклеотидов из двухцепочечных ДНК в направлении 3'→5'

Фермент обладает эндонуклеазной активностью РНК-азы Н, осуществляющей гидролиз РНК в РНК-ДНК-гибридах

-Экзонуклеаза фага λ Катализирует последовательное отщепление мононуклеотидов в двухцепочечных ДНК при наличии в них 5' –концевых фосфатных групп. Используют для получения одноцепочечных молекул ДНК с целью их последующего секвенирования

-Нуклеаза S1 -Специфически расщепляет одноцепочечные молекулы ДНК с образованием 5'-фосфорилированных моно- и олигонуклеотидов

Эти же свойства присущи нуклеазе SI золотистой фасоли

-Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I ) -Гидролизует одно и двухцепочечные ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5'-фосфатные группы

Рибонуклеаза (РНКаза А)

-Обладает активностью эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей фофодиэфирные связи, образованные пиримидиновыми нуклеотидами

-Продуктами гидролиза являются 3'-фосфорилированные пиримидиновые мононуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие концевые пиримидин-3'-монофосфаты

-Ферменты, способные использовать в качестве субстрата катализируемых ими реакций нуклеиновые кислоты являются инструментами экспериментов по конструированию и анализу гибридных молекул НК

-Все используемые в ГИ ферменты должны быть высокоочищенными, т.к. посторонние активности могут привести к побочным реакциям и резко снизить эффективность получения целевых генетических конструкций

13. Векторная система Escherichia coli

-Плазмиды и клетки E. coli – первые объекты генетической инженерии

-Escherichia coli – самая изученная клетка из всех существующих

-Именно в E. coli был впервые обнаружен половой фактор и доказано, что он является внехромосомной двухцепочечной кольцевой молекулой ДНК (плазмидой)

Криптические плазмиды

-Плазмиды, выявляемые фенотипически несут детерминанты устойчивости к антибиотикам (R) , гены катаболизма органических соединений, не являющихся обычными источниками углерода и энергии (D) , могут обуславливать синтез токсинов бактериоцинов, антибиотиков

-Плазмиды, не выявляемые фенотипически, называются криптическими

Плазмидные векторы E. coli - pSC101, ColE1, pMB9, pBR313, pBR322, pBR325

pBR328

14. Вектор pSC101

-получен в 1973 г. в лаборатории С. Коэна как

-первая векторная плазмида

-(размер 9,1 тпн)

-имеет маркерный ген (tet) устойчивости к тетрациклину с сайтами рестрикции

HindIII, BamHI SalI

-имеет строгий контроль репликации (6 копий на клетку)

-вектор pSC101 и его производные используются для клонирования в тех случаях, когда повышение количества кодируемого вставкой белка может привести к гибели бактериальной клетки

15. Вектор ColE1

• Используется с 1974 г.

• Создан в лаборатории Х. Бойера

• Размер 6,6 тпн

• имеет ослабленный контроль репликации (20-30 копий на клетку)

• маркеры:

  • синтез колицина Е1(гены cea и kill)

  • иммунность к колицину (ген imm)

• отбор клонов проводится на среде с колицином Е1 и с газоном E. coli, чувствительным к колицину по появлению прозрачной зоны вокруг колоний, продуцирующих колицин

16. Вектор pMB9

Создан на основе делеционного варианта ColE1, обозначенного pMB8

-обладает геном иммунности к колицину, имеет один сайт EcoRI, в который перенесен ген устойчивости к тетрациклину плазмиды pSC101

-размер pMB9 - 5,3 тпн

-маркеры:-устойчивость к тетрациклину,-иммунитет к колицину

-недостаток - тест на колицин ненадежен

17. Вектор pBR313

Входит в серию плазмид pBR созданных в лаборатории Х. Бойера в 1977-1980 гг.содержит единичные сайты рестрикции: -EcoRI, HindIII, BamHI, SalI, XmaI, SmaI, HpaI

-фенотипическая детекция осуществляется при клонировании по

-HindIII, BamHI, SalI, PstI – сайтам, при этом рекомбинантные клоны

могут быть отобраны по фенотипу устойчивость / чувствительность

к антибиотикам - ампицилину и тетрациклину

18. Вектор pBR322

был получен случайно, длина 4,36 тпн, имеет два селективных маркера устойчивости к ампицилину и тетрациклину, используется в подавляющем большинстве генно-инженерных работ, на основе pBR322 были сконструированы векторы pBR325 и pBR328, в составе которых появился маркер устойчивости к хлорамфениколу

Плазмида pBR 325

При создании использовали ДНК фага PI, содержащего гены устойчивости к хлорамфениколу ( ген хлорамфениколацетил- трансферазы -cat )

29. Плазмиды серии pUC

• Созданы Дж. Виейрой и Дж. Мессингом

• Обеспечивают прямой отбор гибридных вариантов

• Селективным маркером является 5‘-концевая часть гена β-галактозидазы (lak Z), находящаяся под контролем Lak-промотора, кодирующая N-концевую часть β-галактозидазы

• Принцип отбора рекДНК

  • β-галактозидаза способна расщеплять искусственный субстрат Xgal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид ) с образованием окрашенного в голубой цвет продукта реакции

• клетки, содержащие

  • вектор с 5‘-концевой частью гена β-галактозидазы

  • недостающую 3 ‘ -концевую часть гена lak Z в хромосоме

• при выращивании на среде с Xgal в результате комплементации проявлявляют активность β-галактозидазы

• образованные этими клетками колонии окрашиваются в голубой цвет

19. Векторные системы бактерий, не относящихся к роду Escherichia

-Реализация генетической информации имеет особенности, характерные для каждой таксономической группы -Несовместимость плазмид – это неспособность плазмид стабильно сосуществовать в одной клетке -По этому признаку плазмиды распределены на группы несовместимости или Inc-группы (от англ. incompatibility) -Плазмиды, относящиеся к одной Inc-группе, обладают сходными признаками и обнаруживают значительную гомологию

Группы несовместимости E. coli - N,P,Q и W , P,Q – наиболее изученные группы несовместимости

-Плазмиды с широким кругом хозяев способны реплицироваться в бактериях различных видов (это многие плазмиды грамположительных бактерий)

Плазмиды широкого круга хозяев - Плазмиды, способные к экспрессии в клетках бактерий разных родов

20. 21. Плазмиды способные к конъюгации – процессу переноса от клетки –донора к клетке-реципиенту при непосредственном контакте клеток между собой называют конъюгативными или трансмиссивными

Перенос плазмид обеспечивает большой набор генов, объединенных в tra-оперон.Этапы конъюгации

-образование скрещивающихся пар с помощью пилей - половых ворсинок

-перенос и репликация ДНК (переносится только одна цепь плазмидной ДНК, после переноса формируется кольцевая двухцепочечная молекула)

Трансмиссивность плазмид

Нетрансмиссивные плазмиды могут быть перенесены в рецепиентные клетки с помощью конъюгативных плазмид. Этот процесс называется мобилизацией

Механизмы мобилизации

-Перенос за счет белковых продуктов генов tra-оперона, он начинается с участка oriT мобилизируемой плазмиды и для его осуществления необходимо наличие на плазмиде генов mob. Col EI и RSF 1010

-Перенос в составе коинтегратов с конъюгативными плазмидами. Коинтеграт - кольцевая молекула ДНК,в которой объединены два и более репликона, способных к независмой репликации.Коинтеграты способны диссоциировать на дискретные плазмидные репликоны.

Несовметимость плазмид – не способность стабильно сосуществовать в клетке.

Группы несовместимости Inc (от incompatibility- несовместимость) E. coli N,P,Q и W. P,Q – наиболее изученные группы несовместимости

-Плазмиды RK2 и RSF1010 -Наиболее изученные плазмиды групп IncP (RK2) и IncQ (RSF1010)

-Важным свойством плазмид является то, что их гены имеют промоторы широкого круга хозяев, отличающиеся по структуре консервативных районов от районов промоторов E. coli

22. Челночные векторыБифункциональные (бирепликонные плазмиды)

Свойства челночных векторов:

-наличие репликона, обеспечивающего размножение рекомбинантных ДНК автономно от бактериальной хромосомы

-возможность экспрессии фенотипических маркеров

Первый челночный вектор pDP1 (19 тпн) сконструирован в 1984 г. Д. Гинеем из двух репликонов, один из которых функционирует в E. coli, а второй - в Bacteroides fragilis

В 1985-1988 г. на основе pDP1 создана серия плазмид, наиболее удачная из них pUC19 (К. Смит)

pUC303 челночный вектор для цианобактерии Anacystis nidulans и E. coli

E. coli используется в качестве промежуточного хозяина для селекции, анализа и амплификации послечего рекДНК вводят в бактерии других таксономических групп.

23. Векторы на основе бактериофага λ

Векторы на основе фага λ появились в 1974 г.. ДНК фага λ двухцепочечная, линейная, размер 48 502 пн. На концах имеются одноцепочечные ГЦ- концы длиной 12 н (обозначаются cosR и cosL). В клетках фаговая ДНК циклизуется по cos-концам и функционирует в кольцевой форме. Ковалентно-связанные cosR и cosL называются cos-сайтом Фаг развивается в клетке по литическому или лизогенному пути

-При литическом развитии происходит лизис клеток и образуются фаговые частицы

-В лизогенном пути ДНК фага интегрируется в хромосому (между генами gal и bio) и находится в форме профага.

Геном фага состоит из трех частей: первая – гены от Nu1 до J, белковые продукты которых необходимы для образования капсидов и упаковки в них ДНК, вторая – центральная, расположена между генами J и N, она содержит гены -

-redα и redβ , участвующие в рекомбинации

- int , необходимые для сайт-специфической интеграции ДНК в бактериальную хромосому (которая происходит по особым участкам (att)

-xis, контролирующие исключение профага из хромосомы

-Третья - содержит элементы контролирующие репликацию (О и Р) лизис клеток (S и R)

-Получение векторных молекул сводится к введению мутаций по участкам действия рестриктаз в несущественной для размножения фага области генома

-Жизнеспособность фага сохраняется при изменении генома в пределах 22%

-Гибридные фаги должны иметь размер в интервале 38-51 тпн

34. Особенности конструирования геномных библиотек

• Индивидуальный ген занимает небольшую часть генома

• Геном бактерий в среднем составляет 2х106 пн

• Гаплоидный геном человека - около 2х109 пн

• Клонотека генов – это набор разных последовательностей ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в сумме составляют весь геном исследуемого организма

• Репрезентативная клонотека должна заключать в себе с высокой долей вероятности любую последовательность нуклеотидов изучаемого генома

24. Структура векторов внедрения фага λ

-имеют на ДНК одиночные сайты рестрикции, - селекция рекомбинантных клонов осуществляется как выявление фаговых мутантов

Векторы замещения фага λ

-Имеют два или больше сайтов рестрикции

-Заключенные между этими участками фрагменты ДНК вектора замещаются чужеродными фрагментами ДНК

-Детекция рекомбинантных ДНК происходит как выявление делеции генов фага λ

Векторы фага λ, предназначенные для клонирования крупных фрагментов

-Можно клонировать фрагменты размером до 23 тпн (библиотека генов)

-При создании библиотеки каждый сегмент изучаемого генома должен быть представлен среди рекомбинантных ДНК

-Можно создать энциклопедию (клонотеку) генов

-При создании энциклопедии рекомбинантные ДНК последовательно перекрывают весь геном

25. Космиды

Созданы в 1978 г. Дж. Коллинз и Б. Хон для клонирования крупных фрагментов ДНК (35-51 тпн), имеют размер 4,6 тпн. Компоненты космид:

-участок плазмиды с областью начала репликации и геном устойчивости к антибиотику, -единичные сайты рестрикции, -фрагмент ДНК, содержащий cos-сайт. Этапы клонирования -чужеродная ДНК помещается между cos-сайтами космиды , -рекомбинантная ДНК упаковывается в фаговые капсиды , -инфекция клеток E. coli, -репликация рекомбинантной ДНК в форме плазмиды внутри клеток

Схема клонирования в космидах по Д. Иш-Горовиц и Дж. Бюрк

• Предложена в 1981 г.

• Препараты вектора делят на две части, одну из которых расщепляют рестриктазой справа от cos-сайта, а вторую слева

• Оба препарата гидролизуют BamHI

• Клонируемую ДНК гидролизуют Sau3AI или MboI, лигируют с вектором

• При такой процедуре получается один тип молекул ДНК способных упаковываться в капсиды

26. Фазмиды

векторы, состоящие из фрагментов фага и плазмиды

Обеспечивают возможность регулируемого переключения развития гибридных ДНК на фаговый или плазмидный путь

-после встройки чужеродной ДНК могут развиваться как фаги или как плазмиды

-фазмида λpMYF131 - 33 277 пн, поддерживается в клетках E. coli в форме плазмиды, увеличение размера при встраивании чужеродной ДНК придает ей свойства фага

-таким образом, фазмиды являются векторами, обеспечивающими возможность смены фаз, т.е. экспериментально регулируемого переключения развития гибридных ДНК на фаговый или плазмидный путь

28. Фагмиды

Состоят из фрагментов плазмид и нитевидных фагов

Созданы в 1981 г. Г. Долго на основе плазмиды pBR322 и фага f1

Л. Денте с соав. создали серию плазмид pEMBL, состоящих из фрагментов плазмид серии pUC и генома фага f1

Векторы с разной ориентацией фрагмента фаговой ДНК обозначают знаком «+» или «-»

Наиболее известный вектор Bluescript II KS(+/-) 2961 пн , создан на основе pEMBL19(+/-)

Обеспечивает бело-синюю селекцию рек клонов

27. Векторы на основе нитевидных фагов

используются в случаях, когда необходимо манипулировать одной цепью ДНК

нитевидные фаги E. coli (M13, fd, f1) представляют собой - кольцевую одноцепочечную ДНК длиной 6 407 (М13) и 6 408 (fd и f1),

-упакованную в трубочку, состоящую из 2700 копий оболочечного белка PvIII и закрытую на концах 4-5 молекулами минорных оболочечных белков pIII, pVI, pVII и pIX

-нитевидные фаги инфицируют только мужские бактериальные клетки

-геном фага в клетках одновременно присутствует в виде копий двухцепочечной кольцевой плазмиды и одноцепочечной ДНК в составе вирионов

-в геноме фагов существует межгенная область IR (500 н), во многие места которой могут быть внесены изменения без нарушения жизнеспособности фага

-при инфекции фаговые частицы постоянно экскретируются без лизиса

Векторы фага М13

-Векторы используются при гетеродуплексном анализе

-выделении комплементарной ДНК

-направленном мутагенезе

-секвенировании

-Использование векторных систем нитевидных фагов получило название – фаговый дисплей

30. Искусственные бактериальные хромосомы

-Предназначены для клонирования очень больших фрагментов ДНК (125-300 тпн), используются для создания библиотек фрагментов сложных геномов, в частности человека

-ВАС (от анг. bacterial artificial chromosome) созданы на основе F- плазмиды pMBO131 E. coli, в которую встроили фрагмент ДНК с cos-участками фага Х, уникальными сайтами BamHI и HindIII и промоторами фагов Т7 и Sp6

-Клонирование возможно по loxP- и cos-сайтам

YAC (от англ. yeast artificial chromosome ) созданы на основе плазмид дрожжей-сахаромицетов

31. Векторные системы на основе вирусов животных

вирус SV40, вирус папилломы, аденовирусы, вирус герпеса, ретровирусы

Векторы на основе вируса SV40

Особенности строения вируса SV40

-гены SV40 в значительной степени перекрываются

-представляют собой кольцевую ДНК длиной 5 243 пн

-область начала репликации (ori) перекрывается с промоторными последовательностями ранней и поздней транскрипции

-белок Т-антигена является единственно необходимым для эффективной репликации вируса в инфицированных клетках

-Внедрение вируса в хромосомную ДНК не является сайт-специфическим

-при получении рекДНК важно сохранить неповрежденным участок начала репликации

-вставки или делеции без потери жизнеспособности SV40 могут происходить ограниченно: большинство векторов на основе SV40 получено замещением участка ДНК области поздних генов вируса по сайтам HpaII, EcoRI, BamHI, HaeII, AccI, KpnI

-Впервые экспрессия эукариотического гена β-глобина кролика была достигнута в лаборатории П. Берга в 1979 г

32. Векторные системы растений

• Ti и Ri плазмиды Agrobacterium tumefaciens

• вирус табачной мозаики (TMV)

• вирус мозаики коровьего гороха (CPMV)

Векторы на основе Ti плазмиды

-Ti плазмида (от англ. tumor inducing) грамотрицательных почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens, вызывает заболевание «корончатый галл»

-Размер 200-250 тпн, содержит Т-область (transferred DNA) 10-30 тпн, 35 генов вирулентности (vir), способна передаваться в растительную клетку.

-Перенос плазмиды происходит через пили бактерий, а затем через канал в клеточной мембране растения

-ДНК проникает в ядро растительной клетки и встраивается в геном, сайты инсерции случайны, однако имеется преимущественное внедрение в транскрипционно активные области генома

-Т-ДНК кодирует ферменты синтеза фитогормонов, индуцирующих разрастание трансформированных клеток, а также ферменты синтеза аминокислот и сахаров

-Гены ферментов биосинтеза гормонов и необычных аминокислот эволюционно адаптированы для экспрессии только в растительных клетках, поэтому агробактерии являются «природными генными инженерами

33. Методы отбора и анализа рекомбинантных молекул ДНК

-фенотипическая селекция - применяется при тестировании векторных плазмид, детерминирующих устойчивость трансформированных клеток к антибиотикам (тетрациклин, ампициллин), -прямая селекция сразу после высева трансформантов на селективную среду возможна для векторов имеющих летальные для клеток-реципиентов гены

-гибридизация нуклеиновых кислот in situ-применяется в случае необходимости отбора рекДНК, содержащих специфические последовательности, которые используются в качестве зонда

-функциональная комплементация предложен Р. Дэвисом в 1976 г.

заключается в эффекте комплементации рекДНК мутации клетки-реципиента, -рекДНК с фрагментом хромосомной ДНК дрожжей-сахаромицетов, лигированная с ДНК вектора фага λ, после трансформации, способна комплементировать мутацию hisB E. coli , поэтому рекомбинантные клетки можно отобрать на питательной среде без гистидина

. радиоиммуноанализ белков in situ В основе метода – способность иммуноглобулинов связываться с полистиролом или поливинилом

На поверхности этих материалов происходит иммуносорбция антигена

После взаимодействия с меченными антителами комплексы антиген-антитело выявляются радиоавтографически

33

-блоттинг по СаузернуBlotting (промокание) предложен Е. Саузерном в 1975 г. для ДНК , по аналогии разработаны -Northern blotting для РНК

,- Western blotting для белков. -иммуноблотинг

Иммуноблотинг - это анализ смеси белков на твердой подложке-мембране методом иммунодетекции. Дот-блот анализ (от англ. dot - пятно) - это анализ смеси биополимеров (белков или нуклеиновых кислот) без предварительного фракционирования секвенирование