3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_биотехнология_Технология_производства_иммунобиологических

совершенным питательным средам и иным условиям культивирования получен ряд вариантов: Торонто, Вейсензее, Дессау, Массачусетс. Эти варианты отличаются друг от друга по способности синтезировать активный токсин в зависимости от состава питательной среды и условий культивирования в среде пептического переваривания, казеиновой среде (Торонто), мясных средах триптического переваривания (Массачусетс). В Украине для производства дифтерийного анатоксина используется вариант Массачусетс. По мнению ВОЗ, данный штамм вполне подходит для производства иммуногенных дифтерийных вакцин и, по-видимому, нет оснований менять его на другой штамм. Подход к производству дифтерийной вакцины заключается в получении как можно больших количеств токсина во время фазы роста микроорганизмов и последующим превращением токсина в стабильный анатоксин с помощью наиболее эффективного метода.

Дифтерийный микроб штамма PW-8 характеризуется следующими особенностями. Морфология: тонкие, прямые, иногда слегка изогнутые, с несколько закругленными краями палочки. Длина их колеблется от 2 до 5 мкм, толщина – от 0,3 до 0,6 мкм. Палочки неподвижны, жгутиков и капсул не имеют, спор не образуют. Хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Особенно интенсивно окрашиваются метахроматические образования (зерна волютина), которые располагаются по всей длине палочки. Микроб является аэробом, оптимальная температура культивирования 32–34 °С, рН 7,4–8,0. В процессе культивирования штамм, в зависимости от условий роста, может диссоциировать на R- и S-формы. Функция токсинообразования присуща только R-форме, в связи с чем для получения высокоактивных токсинов необходимо поддерживать штамм в R-форме. По характеру роста R- и S-формы имеют существенные различия. На жидких питательных средах S-формы образуют грубую пленку, вызывают легкое помутнение среды, продуцируют токсин слабой активности. R-форма образует нежную хрупкую пленку на поверхности среды без изменения её физических свойств. Активность токсина высокая. На агаровых средах S-форма образует колонии средней величины, правильно округлой формы с ровными краями, гладкой блестящей поверхностью. R-форма на агаровых средах образует мелкие колонии, края резко изрезаны, центр выпуклый, видна радиальная исчерченность (цветок маргаритки). Для сохранения биологической активности штамма целесообразно периодически проводить селекцию с выделением отдельных колоний R-формы

с адаптацией их к составу питательной среды и условиям культивирования. Хранение штаммов в процессе производства осуществляют на средах при температуре от 4 до 10 °С.

Штаммы, используемые для приготовления дифтерийного анатоксина, необходимо идентифицировать на основании документа, в котором содержатся сведения об их происхождении и результатах всех тестов, периодически проводимых для подтверждения свойственных им характеристик. Штаммы следует хранить в виде лиофилизированных культур. Производство дифтерийного токсина должно быть основано на системе посевных серий. Культуры рабочих посевных серий должны обладать теми же характеристиками, что и штамм, из которого получена исходная посевная серия.

Как правило, промышленная ферментация и очистка продукта – процессы многоступенчатые и начинаются обычно с приготовления и стерилизации культуральной среды и оборудования. Выращивание как дифтерийной, так и столбнячной культуры проводят в реакторе (ферментере) периодического действия – выращивание в стерильных условиях без добавления в ходе ферментации свежей культуральной среды.

Питательная среда является тем необходимым субстратом, от которого во многом зависит производство анатоксинов: продуцирование культурой токсина, возможность высокой очистки от балластных компонентов. Составу питательных сред и технологии их изготовления посвящены многие исследования, результаты которых изложены в многочисленной специальной литературе.

Очень важно добиться того, чтобы готовый продукт не содержал веществ, которые могут вызывать токсические или аллергические реакции у человека. Если среды готовят из продуктов гидролиза белков, например, из гидролизата казеина или гидролизованной мышечной ткани, необходимо принять меры, обеспечивающие достаточную эффективность процесса гидролиза. Нельзя превышать пределы, если они установлены, содержания в готовой продукции белков млекопитающих и группоспецифических факторов крови человека. К питательным средам, используемым для получения вакцин, должны предъявляться следующие требования:

 сбалансированное количество органических веществ, так как их недостаток снижает продуцирование токсина в культуральную жидкость, а избыток органических соединений значительно затрудняет процесс отделения биомассы и усложняет переход токсина в анатоксин;

отсутствие в составе питательной среды нерасщепленных белковых молекул, так как их присутствие затрудняет процессы очистки и детоксикации;

учитывая длительный рост бактерий для накопления токсина и изменение рН среды в процессе культивирования, в составе среды должны быть буферные смеси, поддерживающие рН на необходимом уровне;

состав среды должен обеспечивать максимальное накопление токсина без значительного накопления биомассы, что, в свою очередь, упрощает процессы очистки и детоксикации;

питательные вещества должны быть установлены в строго определенных соотношениях, так как избыточная концентрация питательного вещества может ингибировать рост клеток. Если клетки растут слишком интенсивно, то накапливающиеся конечные продукты метаболизма могут нарушать нормальные биохимические процессы в клетках, а это, в свою очередь, может снижать синтез токсина. Кроме того, при недостаточности питательных веществ, например, азотистых соединений, дифтерийная культура начинает проявлять «агрессивность» и интенсивней продуцировать токсин.

За годы производства дифтерийного токсина было предложено большое количество питательных сред, отличающихся по составу и технологии получения. Их разнообразие связано со свойствами используемой культуры, технологией получения токсина и методами его очистки. Одной из наиболее часто используемых питательных сред является среда Лингуда.

Методика изготовления среды заключается в следующем: измельчен-

ную говяжью ткань помещают в холодную воду, нагревают до температуры 90 °С, с последующим охлаждением до 48–50 °С и устанавливают рН 8,0–8,2 при помощи едкого натра. В полученную смесь добавляют эмульсию свиной поджелудочной железы и при указанной температуре и рН проводят гидролиз до прекращения нарастания аминного азота (120–130 мг). Процесс триптического гидролиза прекращается добавлением ледяной уксусной кислоты (1–2 %) и кипячением смеси. Гидролизат фильтруют, устанавливают рН 8,0–8,2 и добавляют пекарские дрожжи для проведения сбраживания сахаров при 80 °С в течение 1 часа. В среду добавляют натрий молочнокислый. Среду фильтруют и стерилизуют при 112 °С в течение 30 минут. Для сохранения

ростовых свойств питательной среды можно использовать метод мембранной фильтрации через фильтры с размером пор не более 0,22 мкм.

Концентрация пептона в среде составляет 1,2–1,3 %, аминного азота 120–130 мг, что позволяет обеспечить бактерии дифтерии источником азота, который необходим культуре микроорганизмов для жизнедеятельности. В состав среды в качестве источника углеводов вводится стерильный раствор мальтозы, которая используется микроорганизмами как источник энергии.

Культивирование дифтерийной культуры можно проводить и на синтетической среде Мюллера, содержащей аминокислоты (глицин, валин, цистин, метионин и др.), минеральные соли (магний сернокислый, фосфорнокислый калий, натрий хлористый, медь сернокислая и др.), сахара (мальтоза, глюкоза и др.). Содержание LF в токсине, полученном на среде Мюллера, уступает их содержанию в токсине, полученном на среде Лингуда на 20–30 %.

Хорошие результаты токсинообразования получены на полусинтетической среде, содержащей кислотный гидролизат казеина (35 г/л). Накопленный опыт дает основание говорить о влиянии ионов железа в составе питательной среды на токсинообразование. Высокий выход токсина наблюдается при содержании ионов железа в пределах 0,05–0,4 мкг в литре.

Оптимальность состава питательной среды для культивирования вакцинных штаммов бактерий необходимо оценивать не по показателю максимального сбора биомассы, а по величине накопления культурой протективных антигенов: для дифтерии и столбняка – накопление токсинов; для гемофильной В инфекции – полисахаридов и т.д.

Получение дифтерийного токсина. Изучение процесса токсинообра-

зования в зависимости от соотношения питательной среды и её объема показало, что при одном и том же объеме среды с увеличением её поверхности повышается активность процесса роста и интенсивность токсинообразования дифтерийного микроба. Аэрирование и перемешивание питательной среды активизирует токсинообразование дифтерийной культуры. Усиленная аэрация увеличивает энергетическую способность микроорганизмов, а непрерывное перемешивание среды обеспечивает распределение питательных веществ и удаление с поверхности клеток бактерий продуктов обмена. Постоянный приток к микробным клеткам новых питательных веществ ускоряет течение

биологических процессов по сравнению с условиями роста микробов в стационарных условиях. При выращивании бактерий в условиях непрерывного перемешивания и аэрации они проходят шесть фаз развития (см. рис. 2).

1.Лаг-фаза или индукционный период, начинается после инокуляции в питательную среду и является периодом адаптации к новым условиям (состав питательной среды, температура, рН и т.д.); продолжительность лагфазы зависит от времени, в течение которого клетки посевного материала находились в стационарной фазе и от того, как сильно различалась среда, в которой росла культура, и новая, свежая культуральная среда. Это диктует необходимость для сокращения лаг-фазы использовать одну серию питательной среды для получения каждой партии токсина.

2.Фаза логарифмическая (лог-фаза) или экспоненциального роста – период быстрого накопления и продуктов метаболизма.

3.Фаза ускорения (линейного роста).

4.Фаза замедления.

5.Фаза стационарная или линейного роста, характеризующаяся сбалансированностью роста в установленном состоянии, то есть скорость роста остается постоянной на протяжении всего процесса культивирования, а химический состав культуральной жидкости изменяется, поскольку потребляются питательные вещества и вырабатываются продукты метаболизма, в том числе и дифтерийный токсин. Причем в этот период количество микроорганизмов увеличивается незначительно, в то время как происходит основной прирост бактериальных токсинов; фаза замедления роста – снижение скорости роста культуры и токсинообразования.

6.Фаза отмирания, в которой энергетические запасы клеток оказываются исчерпанными и метаболизм прекращается.

3

1 2

Время

Рисунок 2 – Фазы роста микроорганизмов в закрытых системах: 1 – лаг-фаза (фаза приспособления или фаза отсутствия роста); 2 – лог-фаза; 3 – фаза линейного

роста; 4 – фаза замедления роста; 5 – стационарная фаза; 6 – фаза отмирания культуры

Основное отличие размножения бактерий при перемешивании и аэрации от размножения в стационарных условиях заключается в отсутствии начальной стационарной фазы и в продолжительности фазы замедления размножения. Бактерии в условиях аэрации сразу начинают интенсивно размножаться:

1 генерация – 34–36 °С в течение 24 часов;

2 генерация – 34–36 °С при перемешивании в течение 24 часов;

3 генерация – 34–36 °С при перемешивании в течение 48 часов.

При проведении культивирования во всех трех генерациях использует-

ся 0,3–0,6 % раствор мальтозы.

Соотношение между объёмами 1, 2 и 3 генераций (у разных производителей) колеблется в диапазоне 1 : (28–30) : (25–30).

Культуры инокулята должны обладать специфической морфологией. Необходимо отметить, что на длительность лаг-фазы большое влияние оказывает фаза роста, в которой находится инокулят, полученный, в свою оче-

редь, путем культивирования клеток в небольшом объёме. Для продукции токсина в наших интересах свести к минимуму лаг-фазу. Для этого необходимо соблюдать следующие условия:

культура инокулята должна обладать максимальной активностью, а в момент введения в среду большого объёма инокулят должен находиться в фазе экспоненциального роста;

среда, в которой выращивается инокулят, должна по своему составу быть идентичной с составом среды для производственного процесса, находящейся в биореакторе;

инокулят должен составлять 5–10 % от объема среды в производственном биореакторе.

Ферментер оборудован устройствами для измерения и регулирования температуры, количества продуваемого воздуха, давления внутри ферментера, рН среды, концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости. В ферментере присутствуют приспособления для механического или химического пеногашения, а также сигнализатор уровня пены. Кроме этого, биореактор обязательно должен быть снабжен специальными опциями для подачи питательной среды и углеводов, введения инокулята, подачи воздуха

ипробоотборника.

Большую опасность представляет загрязнение реактора грибами или бактериями. Поэтому биореакторы конструируют таким образом, чтобы их можно было стерилизовать. Обычно используют пар под давлением. Внутри реактора не должно быть «застойных зон», недоступных для пара во время стерилизации. Обработке подлежат все клапаны, датчики, входные и выходные отверстия. Реакторы подвергают стерилизации либо в автоклаве, либо через рубашку при режиме: 2 часа при давлении 0,2 атм (132 ± 1) °С.

В реактор помещают среду. Необходимо тщательно контролировать температуру выращивания микроорганизмов. При снижении оптимальной температуры рост бактерий значительно замедляется, а повышение температуры активирует клеточные протеиназы и снижает выход токсина.

Процесс культивирования проводят при температуре 34–36 °С. в течение 36–50 часов. В зависимости от состава питательной среды и состояния культуры может меняться время культивирования. Так, например, при использовании казеинового кислотного гидролизата по Мюллеру выращивание проводят при 34 °С в течение 48–60 часов с добавлением мальтозы. Важным

является вопрос о концентрации водородных ионов (рН). Значение рН культуры микроорганизмов оказывает большое влияние на конечные продукты аэробного превращения источников углерода и энергии. РН среды благодаря своему действию на диссоциацию соединений, обладающих кислотными и основными свойствами, может оказать влияние на ингибирование синтеза этих соединений или изменить их токсические свойства, антигенный состав культур и их морфологию. Учитывая, что для роста коринебактерий используются органические аминосоединения, рН увеличивается за счет деаминирования этих соединений. При этом снижается активность выработки дифтерийного токсина. В случае повышения рН свыше 8,2 после 20–24 часов роста добавляют 40 %-ый раствор стерильной глюкозы. Установлено, что увеличение окислительно-восстановительного потенциала (RH 2) приводит к интенсивному накоплению дифтерийного токсина.

Серьезной помехой при культивировании микроорганизмов является образование пены в процессе биосинтеза при глубинном культивировании, что связано с увеличением содержания в питательных средах питательных субстратов, продуктов метаболизма и поверхностно-активных веществ. В случае получения дифтерийного токсина этот эффект усиливается за счет введения газовой фазы – подачи воздуха. Интенсивное пенообразование затрудняет максимальное использование емкости биореактора, так как способствует выбросу пены и потери целевого продукта. Кроме того, выброс пены зачастую приводит к нестерильности продукта. Для пеногашения в настоящее время использую различные методы: механические (разрушение пены за счет ударного воздействия твердых поверхностей, воздействие струями жидкости или газа, резкое изменение давления и др.); химические (добавление поверхностно-активных веществ, уменьшающих прочность пленок, добавление веществ, связывающих пенообразователи в поверхностно-неактивные комплексы); физические методы (электрическое пеногашение, воздействие колебаний звуковой или ультразвуковой частоты и др.); стабилизация уровня пены путем временного уменьшения подачи воздуха или временного прекращения механического перемешивания, вывода избыточной пены из биореактора. Наиболее эффективными являются химические и механические способы пеногашения или их комбинации. Использование для пеногашения при производстве дифтерийного токсина растительных масел, которые уменьшают прочность пленки, дает достаточно высокие результаты токсинообразования и значительно снижает объем пены. Причем необходимо отме-

тить отсутствие влияния данного пеногасителя на микроорганизмы и возможность удаления в процессе фильтрации.

Контроль процесса токсинообразования осуществляют путем определения следующих показателей: количество флоккулирующих единиц (Lf/мл), морфология культуры, концентрация микробных клеток, рН и бактериологическая чистота, величина минимальной смертельной дозы (dlm/мл). В результате контроля токсинообразования должно быть не менее 130–150 Lf/мл и не менее 10000 dlm/мл.

Подходящим методом определения концентрации антигена является реакция флоккуляции. Её следует выполнять с эталонным материалом, откалиброванным по отношению к Международному эталонному стандарту дифтерийного анатоксина для реакции флоккуляции.

Реакцию флоккуляции проводят следующим образом. Стандартную противодифтерийную сыворотку разводят 0,9 %-ым раствором натрия хлористого до конечной концентрации 100 МЕ/мл. Затем готовят разведения токсина (анатоксина) согласно табл. 4.

Таблица 4 – Разведения токсина (анатоксина)

Определяют первоначальную пробирку (инициальная), в которой наблюдается процесс флоккуляции и производят расчет единиц флоккуляции

(LF):

LF = СС Vсыв. РТ,

Vоб. т.

где СС – стандартная сыворотка, МЕ/мл (антитоксин);

Vсыв. – объем сыворотки в инициальной пробирке, мл;

Vоб. т – объем образца токсина, мл; РТ – разведение токсина.

Образцы культур, использованных для получения разовых сборов анатоксина, необходимо испытывать на чистоту с помощью микроскопического изучения окрашенных мазков или путем посева на соответствующие культуральные среды. Разовые сборы нельзя использовать для получения объединенного материала, если на какой-либо стадии их приготовления произошла контаминация.

После завершения процесса культивирования микробную взвесь подвергают ультрацентрифугированию для отделения биомассы на сепараторах типа Вестфалия или суперцентрифугах со скоростью до 15000 об/мин. При этом должны быть приняты соответствующие меры предосторожности, предотвращающие образование потенциально опасных аэрозолей. Для отделения клеток из больших объёмов культуральной среды часто используют высокоскоростные центрифуги. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан (ротор) работающей центрифуги, клетки микроорганизмов концентрируются в нем, а осветленная среда, содержащая токсин, удаляется. Недостатком этого метода является периодическая остановка центрифуги или сепаратора для очистки барабана (ротора) от биомассы, высокая стоимость оборудования, вероятность попадания микроорганизмов в раствор токсина.

Полученный прозрачный раствор токсина направляют на стерилизующую фильтрацию через фильтры с размером пор не более 0,22 мкм, например, фильтры типа «Millipore».

В последние годы предложено пропускать клеточную суспензию с высокой скоростью параллельно поверхности ультрафильтрационной мембраны так, что через мембрану за один цикл проходит только небольшая часть циркулирующей жидкости. Остальная её часть очищает мембрану от накопившихся клеток, в результате чего скорость фильтрации падает не так быстро, как при необратимом забивании фильтра. После многочисленных циклов фильтрации через мембрану проходит почти вся культуральная жидкость. Данный принцип удобен еще и тем, что существует возможность одновременного проведения и стерилизующей фильтрации. Возможен вариант ультрафильтрации на специальных керамических модулях, при которой через

керамические фильтры с установленным порогом отсечения проходит токсин, а биомасса концентрируется в реакторе. Преимуществом такой фильтрации является отсутствие аэрозолей, относительно низкая цена оборудования, стандартизация процесса. Кроме того, два действия заменяются одним, т.к. такая фильтрация дает стерильный продукт, который поступает в реак- тор-детоксикатор. Балластные белки в процессе дальнейшей детоксикации за счет обработки формальдегидом претерпевают те же изменения, как и специфический белок токсина, и при осаждении выпадают в осадок при тех же значениях рН. Для уменьшения объема токсина, снижения количества балластных белковых компонентов, удаления остаточных продуктов питательных сред и др. проводится ультрафильтрация через аппараты с различным порогом отсечения от 10 до 50 кДа. Различные производители определяют условия в зависимости от состава питательной среды, штамма продуцента, дальнейшего метода детоксикации и очистки.

Детоксикация и очистка дифтерийного токсина. В основе процесса обезвреживания дифтерийного токсина заложен принцип необратимого изменения участка его белковой молекулы, ответственного за проявление токсичности, при полном сохранении антигенной активности. Метод детокси-

кации дифтерийного токсина формальдегидом при температуре 37 °С был предложен Рамоном в 1924 году. При изучении механизма анатоксинообразования было установлено, что процесс перехода токсина в анатоксин проходит в два этапа.

Первый этап связан с реакцией между формальдегидом и NH2- группами белка. При этой реакции образуется метилоаминная группа. На этом этапе детоксикация дифтерийного токсина протекает очень быстро: уже в течении первых-вторых суток наблюдается снижение токсичности на 95 %. Однако такое обезвреживание обратимо, и если из препарата удалить избыток формалина, токсичность восстанавливается (реверсия).

На втором этапе происходят внутримолекулярные реакции: метилоаминные группы взаимодействуют с некоторыми активными радикалами аминокислот (амидные, индольные, фенольные и другие группы), что приво-

дит к созданию стабильных метиленовых мостиков. Стабильного обезвреживания можно добиться только после второго этапа формальдегидной детоксикации – образования метиленовых групп. Второй этап необратим. Он протекает достаточно медленно (20–40 суток) при температуре 39–40 °С в зоне нейтральных или слабо щелочных рН и завершается образованием дифтерийного анатоксина. Хотелось бы отметить, что условия детоксикации токсинов специфичны для каждого вида препарата. Так, можно привести данные о детоксикации токсина Cl Septicum: концентрация формалина 0,75 %; рН 6,9–7,1; температура 20–22 °С; время 10–14 суток. Вопросами детоксикации дифтерийного токсина занимаются более 70 лет, и несмотря на это, до сих пор не определен точный механизм этого процесса.

Обезвреживание дифтерийного токсина осуществляется в реакторедетоксикаторе из нержавеющей стали, с рубашкой для водяного обогрева или охлаждения, снабженного мешалкой (60–80 об/мин). При постоянном перемешивании добавляют раствор 40 % формалина до конечной концентрации формальдегида 0,4–0,6 % и инкубируют при температуре 39–40 °С в течение 5 суток. По истечении указанного срока препарат охлаждают до температуры 2–8 °С непосредственно в реакторе-детоксикаторе и проводят процесс осаждения токсина и его очистки.

Очистка дифтерийного токсина от балластных веществ позволяет снизить реактогенность препарата, повысить его иммуногенность за счет лучшей сорбции на минеральных гелях.

При постоянном перемешивании к токсину прибавляют 10 % стерильный раствор гексаметофосфата натрия (соль Грехема) до конечной концентрации 0,25 %. При постоянном перемешивании к раствору частично обезвреженного токсина прибавляют 2Н раствор трихлоруксусной кислоты до рН 3,8–4,0 (изоэлектрическая точка). Немаловажным является этап формирования осадка, который состоит из стадии зарождения и роста индивидуальных частиц, а также их последующую агрегацию, в результате которой образуются хлопья с размерами, обеспечивающими возможность их последующего отделения сепарированием. Смесь выдерживают в течение 40–60 минут

при температуре 4–10 °С. Полученную смесь подвергают сепарированию при 10–12 тыс. об/мин и температуре 4–10 °С. Осадок промывают водой для инъекций и растворяют в борно-боратном буферном растворе при рН 7,8–7,9 в отношении 1 : 15–1 : 20 к его первоначальному объёму. Продукт подвергают очистке от пигментных компонентов (порфириновые соединения) обработкой активированным углем в количестве 0,8–1,2 % и минеральными сорбентами, например, алюминия гидроокисью. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через фильтры с размером пор от 1,2 мкм до 0,22 мкм. К полученному раствору токсина добавляют 40 % раствор формалина до конечной концентрации 0,15–0,2 % формальдегида и инкубируют при температуре 39–40 °С не менее 15 суток. К этому сроку токсин полностью переходит в форму анатоксина. Возможна очистка полученного препарата путем ступенчатой ультрафильтрации раствора анатоксина через аппараты с порогом отсечения от 50 до 300 кДа. При этом возможно удалить балластные примеси с меньшими и большими молекулярными массами по сравнению с дифтерийным анатоксином.

Мы рассмотрели один из вариантов получения дифтерийного анатоксина (токсоида), основанный на очистке частично обезвреженного токсина. В то же время ряд производителей используют и другую схему получения препарата – очистку на стадии дифтерийного токсина. Полученный стерильный раствор токсина подвергают концентрации путем обработки аммонием сернокислым до 40 % насыщения. Смесь выдерживают при температуре 4–8 °С в течение 1 часа и осадок балластных белков отделяют центрифугированием. К прозрачному раствору вновь прибавляют аммоний сернокислый до 60 % насыщения, выдерживают для формирования осадка при 4–8 °С и осадок отделяют центрифугированием. Полученный осадок растворяют в воде для инъекций. На этой стадии проводят определение Lf/мл и содержание белкового азота (мг/мл). Затем раствор подвергают колоночной ионообменной хроматографии на Q-Sepharose Fast Flow. Сорбированные фракции элюируют специальным буферным раствором. Процесс хроматографической очистки проводят дважды. Полученный раствор токсина концентрируют и очищают

ультрафильтрацией или диализом. Очищенный дифтерийный токсин контролируют на содержание Lf/мл, белкового азота (мг/мл) и эндотоксина. Раствор токсина подвергают детоксикации с помощью формалина. Для стабилизации токсина в раствор добавляют аминокислоты: лизин и N-ацетил-триптофан и процесс детоксикации продолжают в течение 18–21 дня при температуре 34–35 °С, причем формалин добавляют дробно, порциями в течение первых трех дней. При очистке полностью обезвреженного анатоксина используют метод спиртового фракционирования с последующей стабилизацией препарата аминокислотой – глицин.

Контроль очищенного концентрированного дифтерийного анаток-

сина. Это следующий этап изготовления. Полученный препарат контролируют в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения по следующим тестам:

1.Стерильность – проводят тест на бактериальную и грибковую стерильность в соответствии с требованиями ДФУ изд. 1/2.

2.Специфическая токсичность – проводят на 5-ти морских свинках массой 250–350 г.

Каждой свинке вводят подкожно 1 мл анатоксина того разведения, в котором содержится не менее 500 Lf анатоксина. Погибших животных нужно подвергнуть аутопсии с целью выявления симптомов дифтерийной интоксикации (например, красные надпочечники). Очищенный анатоксин считается успешно прошедшим испытание, если ни у одной морской свинки в течение 6 недель с момента введения не обнаружены симптомы специфической интоксикации и если к концу периода наблюдения в живых остается не менее 80 % животных. В Украине дополнительно проводят контроль на кроликах, путем введения внутрикожно 20 Lf анатоксина с последующим наблюдением за появлением специфической эритемы в местах введения. Кроме того, доза вводимого препарата в Украине составляет на морских свинках 1500 Lf, что в значительной степени гарантирует безвредность используемого препарата. При получении отрицательных результатов допускается проведение повторного процесса детоксикации с последующим контролем.

3.Реверсия токсичности – проводят с целью подтверждения невозможности реверсии токсичности в процессе хранения. Очищенный концентрированный анатоксин разводят до той его концентрации и концентрации химических веществ, какие приняты для готовой вакцины. Разведенный препарат хранят при температуре 34–37 °С и температуре 2–8 °С в течение 6 недель. Затем образцы препарата контролируют по тесту «специфическая токсичность».

4.Чистота антигена – проводят путем определения Lf/мл и белкового азота (мг/мл).

Очищенный анатоксин считается прошедшим испытание, если он содержит не менее 1500 Lf на 1 мг белкового азота.

5.рН – определение проводят потенциометрически. Норма рН от 6,0

до 7,3.

6.Количество остаточного свободного инактивирующего агента

(формальдегида) определяют, например, калориметрическим методом при взаимодействии формальдегида со смесью фуксина и серной кислоты. Содержание формальдегида в анатоксине, разведенном до концентрации готового препарата, не должно превышать 0,2 г/л.

7.Определение концентрации антигена. Определение необходимо проводить реакцией флоккуляции (Lf/мл) с противодифтерийной флоккулирующей сывороткой.

8.Определение белкового азота. Содержание белкового азота определяют по методу Кьельдаля или по методу Несслера.

9.Определение эндотоксинов LAL-тестом или тестом на пироген-

ность.

10.Определение фракционного состава анатоксина методом электро-

форетического разделения в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия.

Процесс изготовления дифтерийного анатоксина приведен на рис. 3. Во время проведения контроля препарат хранится при температуре 2–8 °С.

1.4.2. Столбняк

Столбнячный токсин (Clostridium tetani toxin) представляет собой белок, непрочно связанный со стромой бактериальной клетки. Процесс образования токсина (тетаноспазмина) в культуре находится в прямой зависимости от наличия в питательной среде гистидинсодержащих пептидов. Предполагают, что эти пептиды индуцируют у столбнячных палочек синтез особой протеазы (пептидазы), принимающей участие или в активации тетаноспазмина, или же в его отщеплении от субклеточных мембранных структур. Молекулярная масса тетаноспазмина находится в пределах 141–160 кДа. Токсический белок термолабилен и после 20–25 минут прогрева при 60–62 °С теряет активность. Токсин состоит из двух субъединиц с молекулярными массами 53 и 107 кДа. При диссоциации оба фрагмента лишены токсических свойств. В культуральной жидкости обнаруживается помимо тетаноспазмина еще один компонент – тетанолизин с молекулярной массой около 60 кДа. Тетанолизин выделяется из клеток по типу экзотоксина с первых дней развития популяции через неповрежденные структуры клетки, по-видимому, посредством активного переноса. Тетаноспазмин через клеточные стенки не проходит и выделяется в культуральную жидкость лишь при распаде микробных клеток, главным образом, в фазе ускоренной гибели популяции.

Штаммы clostridium tetani. Возбудитель столбняка относится к группе анаэробов и представляет собой грамположительную палочку длиной 4–8 мкм и толщиной 0,3–0,8 мкм, располагающуюся в одиночку или цепочкой. Она хорошо растет на средах, предназначенных для анаэробов. На среде типа Китт-Тароцци рост столбнячных бацилл проявляется в виде помутнения среды и сопровождается выделением осадка и газа. На полужидком агарагаре столбиком при росте столбнячной палочки можно наблюдать появление плотных чечевицеобразных колоний (R-формы) и колоний, напоминающих пушинку (S-формы). S-форма обладает более выраженными токсигенными свойствами. Между спорообразованием и токсинообразованием существует определенная связь. Высокотоксигенные штаммы имеют слабо выраженную способность к спорообразованию, и наоборот. Столбнячная палочка вырабатывает несколько токсических и ферментных веществ, имеющих значение в патогенезе заболевания: тетаноспазмин, гемолизин и ферменты фибринолизин и протеазы. Тетаноспазмин вызывает типичную клиническую

картину столбняка; гемолизин обладает кардиотоксическим и гемолитическим действием. Ферменты столбнячной палочки расщепляют высокомолекулярные соединения тканей микроорганизма и способствуют быстрейшему проникновению и распространению тетаноспазмина. В Украине, России, Германии при производстве столбнячного токсина используют штамм Колле 154, № 471 и 473, в других странах используется штамм Гарвард. В литературе имеются указания на влияние возраста посевного материала. Отмечено преимущество старых культур от 2 месяцев до 3 лет. Рабочие штаммы хранят на питательных средах при 4–8 °С. Хранение архивных штаммов осуществляется в лиофилизированном состоянии. Штаммы, используемые для производства вакцин, должны быть идентифицированы на основании документа, в котором содержатся сведения об их происхождении, характеристиках в момент выделения, а также подробные данные о результатах всех тестов, регулярно проводимых для подтверждения свойственных этим штаммам характеристик.

Питательные среды. Для получения столбнячного токсина используется ряд питательных сред, подробно описанных в литературе. Выбор питательной среды во многом зависит от используемого штамма бактерий, методов культивирования, очистки и детоксикации. На территории СНГ для культивирования используется казеиново-растительная среда, так как в этих странах используется один штамм столбнячной культуры и достаточно близкие технологические схемы получения препаратов. Казеин (гликопротеин молока) является приемлемым источником питания столбнячной культуры. При проведении кислотного гидролиза казеина в гидролизате обнаруживаются аминокислоты, необходимые для роста культуры Cl. Tetani и образования столбнячного.

Методика изготовления среды заключается в следующем: готовят смесь казеина (содержание жира не более 2 %), очищенной воды, концентрированной хлористоводородной кислоты в соотношении 1 : 15 : 0,5. Гидролиз проводят при температуре 127 °С в течение 2 часов. Нерасщепленный в процессе гидролиза белок осаждают в изоэлектрической точке. Полученный гидролизат разводят водой до конечного содержания пептона около 3,0 % и обрабатывают активированным углем для осветления (из расчета 2 кг угля на 100 литров гидролизата). Смесь кипятят в течение 10–15 минут, а затем уголь