3 курс / Фармакология / Рекомендации_для_фармацевтических_компаний_по_изучению_биотрансформации

помощи ТМСМ с использованием УФ, флуоресцентного или радиохимического обнаружения.

В свете известной множественности и перекрывающейся специфичности ферментов, участвующих в биотрансформации ЛС, в отношении субстратов, а также возможности наличия либо параллельных, либо последовательных путей метаболической трансформации, эксперименты должны включать несколько концентраций препарата с различным временем инкубации. Ожидаемые равновесные концентрации препарата в плазме in vivo могут быть полезными для определения диапазона концентраций препарата, использующихся для этих экспериментов.

(d) Системы и условия исследования in vitro

Методы, перечисленные в Таблице 5, могут использоваться для идентификации окислительных путей, связанных и не связанных с CYP, ответственных за образование наблюдающихся метаболитов.

Таблица 5 Методы идентификации путей биотрансформации ЛС

2. Исследования, разработанные для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

Если данные исследований in vivo у человека показывают, что изоферменты цитохрома Р-450 вносят вклад более чем в 25% клиренса препарата, необходимо проведение исследований in vitro для идентификации изоферментов цитохрома Р- 450, участвующих в биотрансформации препарата. Эта рекомендация включает случаи, при которых за окислительной биотрансформацией следуют реакции конъюгации, так как межлекарственное взаимодействие, которое ингибирует окисление исходного ЛС, может привести к повышенным уровням исходного ЛС.

(а) Общие экспериментальные методы для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

Существует три хорошо охарактеризованных метода для идентификации отдельных изоферментов цитохрома Р-450, ответственных за биотрансформацию ЛС. Соответственно, эти методы используют:

o специфические химические вещества или антитела в качестве ингибиторов фермента;

o индивидуальные человеческие рекомбинантные изоферменты цитохрома Р-450;

o банк человеческих микросом печени, охарактеризованных по активности CYP, приготовленных из отдельных печеней доноров.

Мы рекомендуем проводить, по крайней мере, два из трех методов для идентификации специфических ферментов, ответственных за биотрансформацию ЛС. Для первой группы методов могут использоваться либо объединенные микросомы печени человека, либо микросомы, приготовленные из печени отдельных доноров. Для корреляционного анализа третьей группы методов, должен использоваться банк охарактеризованных микросом из отдельных донорских печеней.

Там, где это возможно, эксперименты для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, ответственных за биотрансформацию ЛС, должны проводиться с концентрациями ЛС, предполагающимися подходящими по результатам фармакокинетических экспериментов. Эксперименты по идентификации ферментов должны проводиться при начальных условиях скорости (линейность скорости продукции метаболитов по отношению к времени и концентрации ферментов). В некоторых случаях эксперименты проводятся при нелинейных условиях вследствие аналитической чувствительности; результаты таких экспериментов должны интерпретироваться с осторожностью. Таким образом, для количественного определения каждого метаболита, образующегося под воздействием отдельных изоферментов цитохрома Р-450, выбранных для идентификации, должны быть разработаны надежные аналитические методы, основанные на надежной научной базе. Для рацемических препаратов изомеры должны исследоваться раздельно.

(b) Использование специфических химических ингибиторов для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

Большинство химических ингибиторов не абсолютно специфичны для конкретных изоферментов цитохрома Р-450, однако ценной характеристикой химических ингибиторов является их коммерческая доступность. Несмотря на отсутствие комплексности, химические ингибиторы, перечисленные в Таблице 6, могут быть использованы для идентификации отдельных изоферментов цитохрома Р-450, ответственных за биотрансформацию препарата, а также для определения относительного вклада отдельных изоферментов цитохрома Р-450.

(с) Использование рекомбинантных ферментов для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

В случае если препарат подвергается биотрансформации под воздействием только одного рекомбинантного человеческого фермента CYP, интерпретация результатов проводится относительно прямолинейно. Однако, в случае если в процесс вовлечено более одного рекомбинантного фермента CYP, измерение активности фермента по отдельности обеспечит получение информации о вкладе отдельных путей в биотрансформацию ЛС.

Рекомбинантные изоферменты цитохрома Р-450 не присутствуют в исходном окружении и часто гиперэкспрессируются. Дополнительные белки (NADPH-CYP редуктаза и цитохром b5) или состав липидов мембраны могут отличаться от нативных микросом. Имеются данные о нескольких методах количественного масштабирования полученной метаболической активности при использовании рекомбинантных изоферментов цитохрома Р-450 для определения активности, ожидаемой для микросом печени человека. Эти техники могут помочь в

определении относительного вклада каждого из ферментов в общем образовании метаболитов, но могут не отражать абсолютные скорости их формирования в микросомах печени человека in vitro.

(d) Использование специфических антител для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

Ингибирующий эффект антитела должен тестироваться при достаточно низких и высоких концентрациях для получения титрационной кривой. Если в биотрансформации препарата вовлечен только один изофермент цитохрома Р-450, ингибирование более 80% ожидается в наборе объединенных (pooled) или индивидуальных микросом. Если степень ингибирования мала, сложно определить, является ли частичное ингибирование результатом вовлечения других изоферментов цитохрома Р-450 в метаболическую трансформацию препарата, или антитело обладает слабым действием.

(e) Использование корреляционных анализов для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

Эта методика опирается на статистический анализ для определения корреляции между скоростью продукции отдельного метаболита и активностями, определенными для каждого изофермента цитохрома р450 в наборе микросом, приготовленных из печени отдельных доноров.

Набор охарактеризованных микросом должен включать микросомы, приготовленные, по крайней мере, из 10 отдельных печеней доноров. Вариация метаболической активности для каждого изофермента цитохрома Р-450 должна быть достаточной между отдельными донорскими печенями, для того, чтобы обеспечить адекватную статистическую силу. Активность ферментов в наборе микросом, использованных для корреляционных исследований, должна определяться с использованием подходящих субстратов-образцов и экспериментальных условий.

Результаты сомнительны, если одна удаленная точка определяет коэффициент корреляции. В случае если линия регрессии не проходит через исходную точку или около исходной точки, это может говорить о вовлечении нескольких изоферментов цитохрома Р-450 или отражать наследственную нечувствительность набора микросом.

В. Оценка ингибирования изоферментов цитохрома Р-450 in vitro

Препарат, который ингибирует специфический фермент, участвующий вбиотрансформации ЛС, может снизить метаболический клиренс совместно вводимого препарата, который является субстратом ингибированного пути метаболической трансформации. Следствием снижения метаболического клиренса является повышение концентрации в крови совместно вводимого препарата, что

может привести к развитию НЛР или усилению терапевтических эффектов. С другой стороны, ингибированный путь биотрансформации может также приводить к снижению образования активного метаболита совместно вводимого препарата, приводя к снижению эффективности этого препарата.

1. Маркерные субстраты

Эксперименты in vitro, проводимые для определения, способности препарата ингибировать конкретный изофермент цитохрома Р-450, включают инкубацию препарата с маркерными субстратами для изоферментов цитохрома Р-450.

Существует два научных критерия для выбора маркерного субстрата:

o субстрат должен быть селективным (преимущественно подвергаться биотрансформации под воздействием одного фермента объединенных микросом человеческой печени или рекомбинантными ферментами P450;

oсубстрат должен обладать простой метаболической схемой (в идеальном случае с отсутствием последовательной биотрансформации).

Существуют также некоторые практические критерии – коммерческая доступность субстрата и метаболита(ов); количественные анализы, которые являются чувствительными, быстрыми и простыми; и приемлемое время инкубации.

Предпочтительные субстраты, перечисленные в Таблице 7, соответствуют большинству критериев, перечисленных выше, и считаются научным сообществом приемлемыми.

Таблица 7 Предпочтительные и приемлемые химические субстраты для экспериментов

in vitro

2. Соображения относительно дизайна исследований ингибирования изоферментов цитохрома Р-450 in vitro

(a) Типичные эксперименты для определения значений IC50 включают инкубацию субстрата, если скорость метаболизма является достаточной, в концентрациях ниже его Km для того, чтобы более тесно связать IC50 ингибитора с Ki. Для определения Ki, как концентрация субстрата, так и концентрация ингибитора, должны варьировать для того, чтобы покрыть диапазоны выше и ниже Km препарата и Ki ингибитора.

(b)Обычно используются концентрации микросомальных белков ниже 1 мг/мл.

(c)Так как сила буфера, его тип и рН могут значительно повлиять на Vmax и Km, рекомендуется использование стандартизированных условий для количественного анализа.

(d)В ходе исследования не должно возникать истощения субстрата или ингибитора более чем на 10-30%. Однако, для субстратов с низкой Km, может оказаться сложным избежать более чем 10% истощения субстрата при низких концентрациях субстрата.

(e)Мы предлагаем использовать линейную зависимость между временем и количеством образовавшегося продукта.

(f)Мы рекомендуем использовать линейную зависимость между количеством фермента и количеством образовавшегося продукта.

(g)Любые растворители могут использоваться в низких концентрациях (< 1% (об./об.) и предпочтительно < 0.1%). Некоторые растворители ингибируют или индуцируют ферменты. Эксперимент может включать контроль с отсутствием растворителя и с растворителем.

(h)Возможно использование активного контроля (известный ингибитор).

3. Определение того, является ли новая молекулярная субстанция обратимым ингибитором.

Теоретически, значительное ингибирование фермента возникает тогда, когда концентрация имеющегося ингибитора в активном центре сопоставима с Ki или превышает Ki. Теоретически, степень взаимодействия (R, выраженная в виде кратности изменения AUC) может быть получена из следующего уравнения: R = 1+ [I]/Ki, где [I] – это концентрация ингибитора, воздействующего на активный центр фермента, а Ki – константа ингибирования.

Хотя соотношение [I]/Ki используется для предсказания вероятности ингибирующих лекарственных взаимодействий, существуют факторы, которые влияют на выбор подходящих [I] и Ki. Факторы, которые влияют на [I], включают неопределенность в отношении концентрации, которая наилучшим образом представляет концентрацию в области связывания фермента (ферменты, расположенные в желудочно-кишечном тракте против печеночных ферментов) и неопределенность в отношении влияния пресистемного воздействия. Факторы, которые влияют на Ki, включают специфичность субстрата, связывание с компонентами инкубационной системы и истощение субстрата и ингибитора.

Текущий рекомендуемый подход

Вероятность взаимодействия in vitro прогнозируется на основании соотношения [I]/Ki, где [I] представляет собой среднее равновесное значение Cmax для общего количества препарата (связанного и несвязанного) после введения наиболее высокой предполагаемой клинической дозировки. С увеличением соотношения возрастает вероятность взаимодействия. В нижеследующей таблице предложены вероятности взаимодействия in vivo на основании оценочных соотношений [I]/Ki.

Предполагаемое соотношение [I]/Ki более 0,1 считается положительным, и рекомендуется последующее исследование in vivo.

Таблица 8 Предсказание клинической значимости конкурентного ингибирования CYP

Несмотря на то, что количественные предсказания межлекарственных взаимодействий in vivo при проведении исследований in vitro не возможны, ранжирование активности различных изоферментов цитохрома Р-450 для одного препарата может помочь расставить приоритеты для оценки межлекарственных взаимодействий in vivo. При получении различных соотношений [I]/Ki для основных изоферментов цитохрома Р-450 (CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 и CYP3A), уместно начать проведение исследований in vivo, начиная с CYP, характеризующегося наибольшим соотношением [I]/Ki (или наименьшей Ki).

В случае если CYP с наибольшим соотношением [I]/Ki (или наибольшей Ki) не обнаруживает взаимодействия in vivo, не потребуется проведения исследований in vivo с другими CYP с более низким соотношением [I]/Ki (или большей Ki). Для ингибирования CYP3A необходимо оценивать два структурно не связанных субстрата. В случае если одно из двух исследований позволяет предположить наличие потенциального взаимодействия (т.е. [I]/Ki более 0,1), необходимо проведение исследования in vivo.

4. Определение того, является ли новая молекулярная субстанция ингибитором, основанным на определенном механизме.

Зависимое от времени ингибирование должно исследоваться в ходе стандартных скрининговых протоколов in vitro, так как этот феномен не может быть предсказан с полной достоверностью на основании химической структуры. Рекомендуется проведение 30-минутной пре-инкубации потенциального ингибитора перед добавлением субстрата. Любая зависимая от времени или концентрации, а также потеря скорости формирования продукта указывает на ингибирование, основанное на определенном механизме. Для соединений, содержащих амины, формирование промежуточного метаболического комплекса может быть прослежено спектроскопически. Обнаружение зависимой от времени кинетики ингибирования in vitro указывает на необходимость проведения последующих исследований у людей in vivo.

С. Оценка индукции изоферментов цитохрома Р-450 in vitro

Препарат, который индуцирует фермент, подвергающий биотрансформации другой препарат, может увеличить скорость метаболического клиренса совместно вводимого препарата, если он является субстратом индуцируемого пути биотрансформации. Потенциальным последствием такого типа межлекарственного взаимодействия становится снижение концентрации препарата в крови до субтерапевтической. С другой стороны, индуцированный путь биотрансформации может привести к усилению образования активного вещества, приводя к возникновению побочных эффектов.

1. Химические индукторы в качестве положительного контроля

При исследовании способности препарата индуцировать определенный изофермент цитохрома Р-450, эксперимент должен включать приемлемый индуктор фермента в качестве контроля. Примеры таких индукторов перечислены в Таблице 9. Использование положительного контроля объясняется вариабельностью каталитической ферментной активности в препаратах гепатоцитов различных доноров. Вещества, используемые в качестве положительного контроля, должны быть мощными индукторами (более чем 2-кратное увеличение активности фермента в отношении маркерного субстрата при концентрации индуктора менее

500 μM).

Таблица 9

Химические индукторы для экспериментов in vitro

2. Дизайн исследований лекарственной индукции in vitro

В настоящее время наиболее надежным методом исследования способности препарата индуцировать ферменты является количественная оценка ферментативной активности в первичных культурах гепатоцитов после терапии, включающей потенциальный препарат-индуктор, препарат-индуктор в качестве положительного контроля (таблица 9) и гепатоциты, обработанные средой (отрицательный контроль), соответственно. Свежевыделенные человеческие гепатоциты или замороженные гепатоциты, которые можно размораживать и выращивать в культуре, являются предпочтительной тканью печени для этих исследований; иммортализованные клетки печени приемлемы, если при помощи положительного контроля можно показать, что в этой линии могут быть индуцированы CYP3A4 и CYP1A2.

(а) Концентрации тестового препарата должны основываться на концентрациях препарата в плазме человека, ожидаемых при использовании в клинике. Должны исследоваться как минимум три концентрации, попадающие в терапевтический диапазон, включая, по крайней мере, одну концентрацию, которая на порядок превышает среднюю ожидаемую концентрацию препарата в плазме. В случае если эта информация недоступна, должны быть исследованы концентрации в диапазоне двух порядков.

(b) После воздействия на гепатоциты в течение от 2 до 3 дней результирующие активности ферментов могут быть определены при помощи соответствующих маркерных препаратов, специфичных для изоферментов цитохрома Р-450 (таблица 7). Для мониторинга вызванных препаратом изменений ферментов могут использоваться либо монослои из цельных клеток, либо изолированные микросомы; однако, использование первой ткани является наиболее простым и наиболее прямым методом.

(с) При использовании свежевыделенных человеческих или замороженных гепатоцитов для исследования индукции, эксперименты должны проводиться с гепатоцитами, выделенными, по крайней мере, из трех разных донорских печеней вследствие различий индукционного потенциала внутри одного организма.

(d) При использовании иммортализованных клеток печени человека эксперименты по исследованию индукции должны проводиться троекратно.

3. Конечные точки для последующего предсказания индукции ферментов

При анализе результатов экспериментов для определения способности препарата индуцировать ферментативную активность, уместны следующие соображения.

(а) Препарат, который вызывает изменение, которое равно или превышает 40% положительного контроля, может рассматриваться в качестве положительного индуктора фермента in vitro, обосновано проведение исследования in vivo.

% положительного контроля = ((активность клеток, обработанных тестовым препаратом – активность отрицательного контроля) х 100)/(активность положительного контроля - активность отрицательного контроля)

(b) Альтернативная конечная точка - использование значения EC50 (эффективная концентрация, при которой наблюдается 50% индукция), которое представляет собой индекс активности, который может быть использован для сравнения активности различных веществ.

(с) Основываясь на современных знаниях о клеточных механизмах, ведущих к индукции фермента CYP, если исследования индукции с тестовым препаратом подтверждают, что вещество не является индуктором CYP3A4, можно сделать заключение, что тестовый препарат также не является индуктором CYP2C8, CYP2C9 или CYP2C19.

4. Другие методы, предложенные для идентификации индукции изоферментов цитохрома Р-450 in vitro

Несмотря на то, что наиболее надежным методом количественного определения индукционного потенциала препарата является измерение ферментативной активности после инкубации препарата в первичных культурах человеческих гепатоцитов, исследуются также другие методы. Некоторые из этих методов кратко описаны ниже.

(а) Western immunoblot или иммунопреципитация со специфическими поликлональными антителами.

Относительный количественный анализ определенного изофермента Р-450 требует, чтобы электрофоретическая система четко расщепляла отдельные