3 курс / Фармакология / Рекомендации_для_фармацевтических_компаний_по_изучению_биотрансформации

по исследуемому изоферменту цитохрома Р-450. Эта информация может оказаться полезной для интерпретации полученных в ходе исследования in vivo результатов.

С. Выбор «маркерных» ЛС-субстрата и взаимодействующего ЛС

1. Изучаемое ЛС как ингибитор или индуктор изоферментов цитхрома

Р-450

При исследовании in vivo изучаемого ЛС в качестве взаимодействующего ЛС, выбор субстратов для исследований in vivo зависит от изоферментов Р450, на которые оказывало влияние изучаемое ЛС в исследовании in vitro. При исследовании ингибирующих свойств изучаемого ЛС, выбранное ЛСсубстрат должно быть тем ЛС, фармакокинетика которого значительно изменяется при совместном его применении с известными специфическими ингибиторами того или иного изофермента цитохрома Р-450 т.е. ЛС должно быть чувствительным субстратом, для которого было показано, AUC увеличиваются в 5 раз или более при одновременном введении с известным ингибитором того или иного изофермента цитохрома Р-450. Чувствительные субстраты, представленные в таблице 1 рекомендуется применять в исследованиях in vivo как «маркеры» т.е. по их фармакокинетике (при их приеме внутрь) оценивается активность того или иного изофермента цитохрома Р-450.

Таблица 1 Чувствительные субстраты, являющиеся «маркерами» активности изоферментов цитохрома Р-450, рекомендованные применять в

исследованиях in vivo

В исследованиях in vivo для оценки ингибирующих / индуцирующих свойств изучаемого ЛС, для оценки активности изоферментов цитохрома Р- 450 CYP2C9 и CYP3A4, может применяться не только изучение фармакокинетике, указанных в таблице 1, чувствительных сусбтратов, но и альтернативными методами. Для оценки активности CYP3A4 рекомендуется также использовать MEGX тест (см. Приложение 2А), тест с определением соотношения 6β-гидроксикортизола / кортизол в моче (см. Приложение 2В). Для оценки активности CYP2C9, также может использоваться тест с лозартаном (см. Приложение 2С).

Исследование in vivo определяет, что изучаемое ЛС либо ингибирует, либо индуцирует тот или иной изофермент цитохрома Р-450, рекомендуется проведение дополнительных исследований с использованием набора других ЛС-субстратов, которые наиболее вероятно будут применятся в клинической практике вместе с изучаемым ЛС. В случае же если Исследование in vivo дает отрицательный результат с чувствительными субстратами (таблица 1), можно предположить, что также не будет обнаружено влияния на менее чувствительные ЛС-субстраты, а значит дополнительные исследования не требуются.

Если исследования in vivo, показали, что изучаемое ЛС является ингибитором того или иного изофермента цитохрома Р-450, то его следует отнести к одной из трех групп ингибиторов, что важно при внесении информации о возможном межлекарственном взаимодействии в инструкцию по применению ЛС (или ИКФС). Ингибиторы того или иного изофермента цитохрома Р-450 можно классифицировать на основании степени изменения AUC чувствительного субстрата («маркера») при его применении внутрь:

oесли изучаемое ЛС увеличивает AUC чувствительного субстрата при его применении внутрь в 5 раз или более, то оно может расцениваться как сильный ингибитор;

oесли изучаемое ЛС увеличивает AUC чувствительного субстрата при его применении внутрь в более чем 2 раза но менее чем в 5 раза, то

оно может расцениваться как умеренный ингибитор

oесли изучаемое ЛС увеличивает AUC чувствительного субстрата при его применении внутрь в более чем 1,25 раза но менее чем в 2 раза,

то оно может расцениваться как слабый ингибитор

Отнесение изучаемого ЛС по данным исследования in vivo, к одной из трех групп ингибиторов, позволяет определить вероятность его взаимодействия с чувствительными субстратами и ЛС-сусбтратами с узким терапевтическим диапазоном (таблица 2), что должно найти отражение в инструкции по применению ЛС и ТКФС.

В исследованиях in vivo может применяться т.н. «коктейльный подход», при котором одновременно применяется несколько чувствительных субстратов («маркеров») нескольких изоферментов цитохрома Р-450 в ходе одного исследования. Необходимым условием правильного дизайна подобного рода исследований является наличие следующих факторов:

1.Чувствительные субстраты («маркеры») должны быть специфичны дляизоферментов цитохрома Р-450;

2.между чувствительными субстратами не должно быть взаимодействий; Отрицательные результаты «коктейльного» исследования in vivo могут исключить потребность в дальнейшем исследовании отдельных изоферментов цитохрома Р-

450.Данные, полученные в ходе коктейльных исследований, могут дополнять данные, полученные в ходе других исследований in vitro и in vivo, оценивающих

способность изучаемого ЛС ингибировать или индуцировать тот или иной изофермет цитохрома Р-450.

3. Изучаемое ЛС в качестве субстрата изоферментов цитохрома Р-450

При исследовании in vivo изучаемого ЛС в качестве субстратам, выбор ингибиторов для исследований in vivo зависит от изоферментов Р450, которые по данным исследования in vitro метаболизирует изучаемое ЛС. При этом, для исследования in vivo, необходимо выбрать сильный ингибитор того или иного изофермента цитохрома Р-450, который будет являться «маркерным» ингибитором.

Вкачестве «маркерных» ингибиторов может быть выбрано любое ЛС из таблицы 3. Например, если в исследовании in vitro было показано, что изучаемое ЛС подвергается биотрансформации при участии изоферментов подсемейства CYP3A, и их вклад в элиминацию ЛС либо значителен (>25% от общего клиренса), либо неизвестен, в качестве ингибитора следует выбрать кетоконазол, так как он является сильным ингибитором CYP3A. Если результаты исследования in vivo отрицательны, тогда можно говорить о том, что было продемонстрировано отсутствие клинически значимого межлекарственного взаимодействия на уровни биотрансформации. Если исследование in vivo при использовании сильного ингибитора дало положительный результат, и спонсор желает определить, имеется ли взаимодействие между изучаемым ЛС и другими менее мощными ингибиторами, или дать рекомендацию по изменению дозирования, в большинстве случаев требуется проведение дальнейших клинических исследований (таблица 3).

Вслучае если препарат подвергается биотрансофрмации при помощи того или иного изофермента цитохрома Р-450, и его AUC увеличивается в 5 раз и более под влиянием сильного ингибитора, то изучаемое ЛС считается, чувствительным субстратом для для данного изофермента цитохрома Р-450. При этом, в инструкции по применению ЛС и ТКФС необходимо отметить, что ЛС является «чувствительным» субстратом для данного изофермента цитохрома Р-450 и его применение с сильными или умеренными ингибиторами приводит к повышению его концентрации в плазме крови и развитию НЛР. В случае если ЛС подвергается биотрансформации при помощи CYP3A, но не является чувствительным субстратом, однако его соотношение доза-ответ показывает, что даже незначительное увеличение концентрации ЛС в плазме крови при совместном применении с ингибиторами может привести к развитию серьезных НЛР (например, аритмия «torsade de pointes»), ЛС рассматривается как «субстрат того или иного изофермента цитохрома Р-450 с узким терапевтическим диапазоном» (таблица 2).

Если в исследовании in vivo с сильным ингибитором, изучаемое ЛС показало себя в качестве сусбтрата того или иного изофермента цитохрома Р-450, то его исследование с индуктором не требуется.

Таблица 2 Чувствительные субстраты и субстраты с узким терапевтическим диапазоном

изоферментов цитохрома Р-450

В случае если применяемое внутрь ЛС является субстратом CYP3A и обладает низкой биодоступностью из-за значительной пресистемной элминиации, связанной с находящимся в ЖКТ CYP3A, грейпфрутовый сок, являясь ингибитором CYP3A, может оказать значительное влияние на концентрацию данного ЛС в плазме крови и повышать риск развития НЛР, что должно быть указано в инструкции по применению и ТКФС данного ЛС.

Если ЛС является одновременно субстратом CYP3A или P-gp, то совместное применение с ним препаратов зверобоя, приведет к снижению концентрации данного ЛС в плазме крови и снижению эффективности, что также должно быть отмечено в инструкции по применению и ТКФС данного ЛС.

Таблица 3 Сильные, умеренные и слабые ингибиторы изоферментов цитохрома Р-450

Саквинавир, Телитромицин

3. Изучаемое ЛС в качестве ингибитора или индуктора переносчика P-gp

При тестировании изучаемого ЛС в отношении способности ингибировать/индуцировать P-gp, может быть оправданным выбор фексофенадин в качестве субстрата P-gp.

4. Изучаемое ЛС в качестве субстрата переносчика P-gp

При тестировании изучаемого ЛС в в качестве субстрата P-gp, рекомендуется использовать такой сильный ингибитор P-gp, как верапамил.

D. Путь введения

Для изучаемого ЛС путь введения обычно должен соответствовать планируемому для использования в клинике. Если разрабатываются как пероральный, так и праентеральный путь введения ЛС, то потребность в исследовании межлекарственного взаимодействия для нескольких путей введения, чаще всего перорального и парентерального, зависит наличия у изучаемого ЛС эффекта первого прохождения, который может быть связан с активностью изоферментов цитохрома Р-450 стенки и транспортеров кишечника. Если для изучаемого ЛС в качестве субстрата, характерен эффект первого прохождения через печень, то необходимо изучение межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации и транспортеров как при его пероральном, так и парентеральном введении. Для ЛС-субстратов и взаимодействующих ЛС (ингибиторов / индукторов), использующихся в качестве «маркеров», путь введения будет зависеть от доступных на рынке форм выпуска данных ЛС, хотя и предпочтительным является пероральный путь.

Е. Выбор дозировки

Исследование in vivo должно способствовать максимальной вероятности обнаружения межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации и транспортеров, как для субстрата (изучаемого ЛС или «маркера»), так и для взаимодействующего ЛС (игнибитора / индуктора) (изучаемого ЛС или «маркерного» ингибитора). По этой причине мы рекомендуем использовать максимальную планируемую или одобренную дозировку и наиболее короткий интервал между введением последующих дозировок ЛС (в качестве ингибиторов или индукторов). Например, при использовании кетоконазола в качестве ингибитора CYP3A дозировка 400 мг в день является более предпочтительной по сравнению с более низкими дозировками. В некоторых случаях, из соображений безопасности для ЛС-субстратов могут быть рекомендованы более низкие дозы, чем те, которые используются в клинике. В таких случаях, любые ограничения

чувствительности исследования in vivo для обнаружения межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации и транспортеров вследствие использования более низких дозировок должны обсуждаться спонсором в протоколе и отчете об исследовании.

F. Конечные точки

Изменения фармакокинетических параметров могут быть использованы для оценки клинической значимости межлекарственных взаимодействий на уровне биотрансформации и транспортеров. Интерпретация результатов, полученных в ходе этих исследований, будет облегчаться если они будут дополнены изучением изменения фармакодинамики ЛС, если это возможно. Примером могут служить измерение МНО (при исследовании взаимодействия варфарина с другими ЛС на уровне биотрансформации).

1.Фармакокинетические конечные точки

Входе каждого исследования in vivo должны быть получены следующие фармакокинетические параметры ЛС-субстрата (изучаемого ЛС или «маркера»): площадь под фармакокинетической кривой, AUC, максимальная концентрация (Cmax), время достижения Cmax (Tmax), общий клиренс, объем распределения и периоды полувыведения (T1/2). В некоторых случаях эти параметры также могут быть интересны и для взаимодействующего ЛС (ингибитора / индуктора), особенно в случаях, если в исследовании оцениваются возможные влияния на оба исследуемых ЛС. Дополнительные измерения могут помочь в исследованиях равновесного состояния (например, минимальная и максиммальная равновесная концентрация) для демонстрации того, что стратегии дозирования были адекватно подобраны для достижения состояния, близкого к равновесному, до и во время взаимодействия (см. раздел IV А «Дизайн исследования»). Частота забора образцов должна быть адекватной для обеспечения точного определения соответствующих фармакокинетических показателей самого ЛС и его активных метаболитов (при их наличии). Для ЛС-субстрата, вне зависимости от того, является ли он изучаемым ЛС или «маркером», важным является определение активных метаболитов (при их наличии).

2. Фармакодинамические конечные точки

Фармакокинетические показатели обычно являются достаточными для исследований межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансофрмации и транспортеров, хотя фармакодинамические показатели могут иногда дать полезную дополнительную информацию. Определение фармакодинамических показателей показано, если взаимосвязь фармакокинетики и фармакодинамики для интересующих конечных точек ЛС-субстрата не выяснена, или если фармакодинамические изменения

происходят не только вследствие фармакокинетических, но и фармакодинамичсеких взаимодействий (например, аддитивное влияние хинидина и трициклических антидепрессантов на интервал QT).

G. Размеры образца и статистические расчеты

Статистическая значимость различий фармакокинетических и фармакодинамический параметров ЛС-субстрата (изучаемого ЛС или «маркера») до и после взаимодействия должная быть оценена с помощью непараметрических статистических методов т.к. в большинстве случаев полученные данные не соответствуют нормальному распределению. В случае, сели исследование in vivo было перекрестным рекомендуется использовать парный критерий Вилкоксона, а при параллельном дизайнеметод Манна-Уитни. Различия необходимо расценивать как статически значимые при p<0,05.

V. Внесение информации о результатах исследований in vivo и in vitro в инструкцию по применению ЛС и ТКФС

Очень важно, чтобы вся информация, полученная в результате исследований биотрансофрмации и транспортеров in vitro и in vivo была отражена в инструкции по применению ЛС и ТКФС.

Информация о результатах исследований in vitro и in vivo в которых изучаемое ЛС выступало в качестве субстрата должна быть размещена в разделе «Фармакокинетика» (таблица 4).

Таблица 4 Формулировка информации о результатах исследований in vitro и in vivo, в

которых изучаемое ЛС выступало в качестве субстрата, для раздела «Фармакокинетика» инструкции по применению ЛС или ТКФС

Если в результате исследований iv vitro и in vivo обнаружено, что изучаемое ЛС является «чувствительным» субстратом или ЛС-субстратом с узким терапевтическим диапазоном того или иного изофермента цитохрома Р-450, то в разделе «Взаимодействие» инструкции по применению ЛС и ТКФС необходимо указать, что его применение с сильными или умеренными ингибиторами приводит к повышению его концентрации в плазме крови и развитию НЛР. При этом необходимо перечислить ЛС, относящиеся к сильным и умеренным ингибиторам данного изофермента цитохрома Р-450 (таблица 3), список которых эксперты Росздравнадзора должны обновлять ежегодно, внося изменения в инструкции по применению ЛС и ТКФС при очередной регистрации ЛС. В этом разделе также необходимо указать, что применение ЛС, являющегося «чувствительным» субстратом, или ЛС-субстратом с узким терапевтическим диапазоном того или иного изофермента цитохрома Р-450, с индукторами данного изофермента, может приводить к снижению его концентрации и ослаблению фармакологических эффектов.

Если в результате исследований iv vitro и in vivo обнаружено, что изучаемое ЛС является сильным или умеренным ингибитором того или иного изофермента цитохрома Р-450, то в разделе «Взаимодействие» инструкции по применению ЛС и ТКФС необходимо указать, что его применение с ЛС, являющимися «чувствительными» субстратами или ЛС-субстратом с узким терапевтическим диапазоном (таблица 2), приводит к повышению концентрации этих ЛС в плазме крови и развитию НЛР. При этом необходимо перечислить ЛС, относящиеся к «чувствительным» субстратам и ЛС-субстратам с узким терапевтическим диапазоном данного изофермента цитохрома Р-450 (таблица 2). Так же необходимо указать потенциальную возможность повышать концентрацию других ЛСсубстратов данного изофермента при их совместном применении, без перечисления конкретных ЛС. Если изучаемое ЛС по результатам исследований iv vitro и in vivo показало себя как слабый ингибитор того или иного изофермента цитохрома Р-450, то в инструкции по применению ЛС и ТКФС в разделе «Взаимодействие» необходимо указать этот факт, а также потенциальную возможность повышать концентрацию ЛС-субстратов данного изофермента при их совместном применении без перечисления конкретных ЛС.

Если в результате исследований iv vitro и in vivo обнаружено, что изучаемое ЛС является индуктором того или иного изофермента цитохрома Р-450, то в разделе «Взаимодействие» инструкции по применению ЛС и ТКФС необходимо указать, что его применение с ЛС, являющимися «чувствительными» субстратами и ЛСсубстратами с узким терапевтическим диапазоном (таблица 2), приводит к снижению концентрации этих ЛС в плазме крови и ослаблению фармакологических эффектов.

Список сильных и умеренных ингибиторов, а также «чувствительных» субстратов и ЛС-субстратов с узким терапевтическим диапазоном изоферментов цитохрома Р- 450 (таблицы 2, 3) эксперты Росздравнадзора должны обновлять ежегодно, в соответствие с чем, при очередной перерегистрации ЛС должны вноситься изменения в инструкции по применению ЛС и ТКФС.

Информация, относящаяся к клиническим последствиям (развитие НЛР или ослабление фармакологических эффектов), не должна помещаться с детальным описанием более чем в один раздел инструкции по применению ЛС и ТКФС. В случае если в результате исследований in vivo разработаны рекомендации по изменению дозирования изучаемого ЛС, противопоказания или предупреждения (например, избегать совместного введения), эта информация должна быть размещена в соответствующих разделах инструкции по применению ЛС и ТКФС: «Режим дозирования», «Противопоказания» и «Особые указания».

Аналогичным образом вносится информация в инструкции по применению ЛС и ТКФС и по результатам исследований in vivo и in vitro транспортеров, и, в частности P-gp.

Приложение 1 Методология проведения исследований биотрансформации и

транспортеров ЛС in vitro

А. Идентификация фермента, участвующего в биотрансформации ЛС in vitro

Исследования для идентификации фермента, участвующего в метаболической трансформации препарата, часто называемые исследованиями фенотипирования реакции, представляют собой набор экспериментов, которые определяют специфические ферменты, ответственные за биотрансформацию ЛС. В окислительных и гидролитических реакциях принимают участие ферменты семейства цитохрома P450 (CYP) и ферменты, не относящиеся к CYP. Эффективным подходом является определение метаболического профиля (определение образовавшихся метаболитов и их количественной значимости) ЛС, и оценка относительного вклада изоферментов цитохрома Р-450 в клиренс перед началом исследований для определения специфических изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС. Идентификация изоферментов цитохрома Р-450 обоснована, если изоферменты цитохрома Р-450 вносят вклад в более чем 25% общего клиренса ЛС. Идентификация in vitro изоферментов цитохрома Р-450, подвергающих ЛС биотрансформации и, помогает предсказать потенциал для межлекарственных взаимодействий in vivo, влияние активности полиморфных ферментов на распределение препарата и формирование токсических или активных метаболитов. Существует небольшое количество документально зарегистрированных случаев клинически значимых межлекарственных взаимодействий, связанных с ферментами, не относящимися к CYP, но идентификация ферментов этого типа, подвергающих препарат

биотрансформации (т.е. глюкозуронилтрансфераз, сульфотрансфераз и N- ацетилтрансфераз) приветствуется. Несмотря на то, что классические исследования биотрансформации не являются общим требованием при исследовании терапевтических биопрепаратов, определенные белковые препараты модифицируют биотрансформацию ЛС, в которой участвуют изоферменты цитохрома Р-450.

1. Эксперименты по идентификации пути биотрансформации (определение метаболического профиля)

(а) Обоснование и цели

Данные, полученные в ходе исследований по идентификации пути биотрансформации ЛС in vitro, помогают определить, обосновано ли проведение экспериментов для определения ферментов, участвующих вбиотрансформации ЛС, и позволяют разработать соответствующий дизайн любых таких экспериментов. Эксперименты по идентификации пути биотрансформации должны оценивать количество и классы метаболитов, образующихся из ЛС, а также параллельность или последовательность путей биотрансформации.

(b) Выбор ткани для экспериментов по идентификации пути биотрансформации

Человеческие ткани, включая свежеизолированные гепатоциты, замороженные гепатоциты и свежеизолированные срезы печени, обеспечивают клеточную целостность в отношении ферментной архитектуры и содержат полный набор ферментов, участвующих в метаболической трансформации лекарственных препаратов. Субклеточные фракции ткани печени, фракции, которые включают микросомы, S9, цитозоль (добавление соответствующих ко-факторов при необходимости) или рекомбинантные ферменты могут использоваться в комбинации с упомянутыми выше тканями для идентификации образующихся из конкретного препарата метаболитов и классов вовлеченных в процесс ферментов.

(с) Дизайн экспериментов по идентификации пути биотрансформации

Одна из методик идентификации пути биотрансформации - инкубация препарата с гепатоцитами или срезами печени с последующим хроматографическим анализом инкубационной среды и внутриклеточного содержимого при помощи тандемной масс-спектрометрии (ТМСМ). Этот тип экспериментов приводит к прямой идентификации метаболитов, образовавшихся в ходе окислительных, гидролитических и реакций II фазы биотрансформации, и обеспечивает получение информации, касающейся параллельности или последовательности путей метаболической трансформации. Другая методика - анализ инкубационной среды при