3 курс / Фармакология / Диссертация_Калитин_К_Ю_Противосудорожные_свойства_новых_парагалогенфенил
.pdf51
При этом каждый элемент s принимает два значения: 1, если соответствующий заместитель присутствует в соединении; 0, если соответствующий заместитель отсутствует в молекуле. Переменные переводились в бинарные, облегчая нахождение коэффициентов регрессии. Для определения вкладов заместителей в проявление биологического ответа использовалось уравнение:
А=Σa1+a2+a3+…+an/ Σs1+s2+s3+…+sn- a0
2.2.2 Изучение спектра противосудорожной активности соединения-
лидера на острых моделях эпилептогенеза
Определение судорожного порога на модели коразоловых судорог. Для
определения судорожного порога коразол (1% раствор или 10 мг/мл) титровался внутривенно в хвостовую вену мышей со скоростью 0,1 мл/мин с помощью шприцевого дозатора (LineOmat, Германия).
У контрольных животных после инфузии развивались следующие типы судорог: 1) одно или более миоклонических подергиваний всего тела; 2)
повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 секунды без потери рефлекса переворачивания; 3)
генерализованные клонические судороги (клонус) передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания; 4) клонические судороги, за которыми следовала тоническая экстензия передних конечностей с потерей рефлекса переворачивания; 5) тоническая экстензия задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания.
В качестве критерия оценки противосудорожного действия вещества использовалась его способность предупреждать развитие 1 и 3-й стадий судорог.
При определении порога судорожной реакции для указанных стадий животные были разделены на группы по 10 особей. Исследуемые вещества вводились интраперитонеально, и затем через 1 час начиналось титрование коразолом.
52
Рисунок 2.3 Изучение судорожного порога в тесте с коразолом
Эффект изучаемых веществ учитывался отдельно для каждой стадии как процент увеличения количества коразола, провоцирующего развитие судорожных явлений. Пороговая доза коразола рассчитывалась по формуле [Mandhane S. N.,
2007]:
Скорость введения (0,1 мл/мин) х латентный период (с) х
х концентрация раствора коразола (10 мг/мл) х 1000 / 60 х масса животного (г)
Показатели TID50 (threshold increasing dose — доза, увеличивающая порог судорог к коразолу на 50%) рассчитывались методом линейной регрессии.
Антиконвульсивная активность в тесте максимального электрошока.
При изучении антиконвульсивной активности по методике максимального электрошока [Воронина Т. А., Неробкова Л. Н., 2012] животные получали через корнеальные электроды электрические стимулы (50 Hz, 50 mA), длительностью 0,2
с. Тестируемое вещество и препарат сравнения карбамазепин изучались в диапазоне доз 1–50 мг/кг и.п. Оценивалась способность веществ предупреждать развитие тонической экстензии у мышей.
Изучение антиконвульсивного действия на модели судорог, вызванных
пикротоксином. Способность вызывать тремор и повторяющиеся клонические
судороги связана с антагонистическим влиянием пикротоксина в отношении
53
ГАМКА – рецепторов [Воронина Т.А., Гузеватых Л.С., 2012]. Исследование проводилось на мышах самцах. Контрольная группа получала пикротоксин 3,5
мг/кг и.п. Двум опытным группам вводилось изучаемое соединение в дозе 10 и 20
мг/кг и.п. и через 30 минут пикротоксин. После введения веществ в течение 1 часа вели наблюдение за животными, отмечая латентный период появления и продолжительность тремора, латентный период развития судорог и количество судорожных припадков. Изменение регистрируемых показателей в опытных группах сравнивалось с контрольными показателями.
Изучение антиконвульсивного действия на модели судорог, вызванных
ингибитором синтеза ГАМК изониазидом. Для провокации судорог [Bernasconi R. et al., 1988], белым мышам самцам вводился изониазид и.п. в дозе 250 мг/кг спустя 60 минут после интраперитонеального введения изучаемых соединений.
Животные были разделены на группы:
1)Изониазид + 0,2 мл дистилл. воды (контроль)
2)Изониазид + РУ-1205 (10 мг/кг, и.п.)
3)Изониазид + РУ-1205 (20 мг/кг, и.п.)
4)Изониазид + диазепам (3 мг/кг, и.п.)
На протяжении 120 минут регистрировалось время наступления клонических судорог и гибель животных. Высокую эффективность на данной модели проявляют препараты с анксиолитической активностью, например,
бензодиазепины [Vogel H., 2007].
Оценка антиконвульсивного действия на модели судорог, вызванных
стрихнином. Стрихнин блокирует глициновые рецепторы, которые являются аллостерическими регуляторами ГАМК-комплекса [Lehmann J. et al., 1988].
Судорожное состояние вызывалось стрихнинина нитратом (2,5 мг/кг, п.к.) у
белых мышей самцов через 60 минут после интраперитонеального введения изучаемых соединений. Было выделено четыре группы животных:
1)Стрихнин + 0,2 мл дистилл. воды (контроль)
2)Стрихнин + РУ-1205 (10 мг/кг, и.п.)
3)Стрихнин + РУ-1205 (20 мг/кг, и.п.)
4)Стрихнин + диазепам (3 мг/кг, и.п.)
54
Животные, выжившие к 10-й минуте наблюдения, рассматривались как
защищенные.
Изучение антиконвульсивного действия на модели судорог, вызванных
аминопиридином. 4-аминопиридин является блокатором калиевых каналов.
Возникновение судорог после введения аминопиридина связывают с его способностью инициировать выделение некоторых медиаторов из синаптических окончаний, среди которых доминируют возбуждающие аминокислоты [Vogel H.,
2007].
Вданной модели высокую эффективность проявляют препараты с профилем близким к вальпроату натрия.
Вэксперименте использовались мыши самцы, которые были разделены на четыре группы по 12 животных:
1)Аминопиридин + 0,2 мл дистилл. воды (контроль)
2)Аминопиридин + РУ-1205 (10 мг/кг, и.п.)
3)Аминопиридин + РУ-1205 (20 мг/кг, и.п.)
4)Аминопиридин + вальпроат натрия (301 мг/кг, и.п.)
Аминопиридин вводился в дозе 13,3 мг/кг, п.к. (ЛД97) через 30 минут после инъекций изучаемых соединений или эквивалентного объема дистиллированной
воды.
Антиконвульсивная активность на модели судорог, вызванных N-
метил-D-аспартатом. NMDA является агонистом ионотропных глутаматных рецепторов.
Для моделирования судорог мыши самцы были разделены на группы,
получавшие:
1)NMDA + 0,2 мл дистилл. воды (контроль)
2)NMDA + РУ-1205 (10 мг/кг, и.п.)
3)NMDA + РУ-1205 (20 мг/кг, и.п.)
NMDA вводился подкожно в дозе 75 мг/кг через 60 минут после введения исследуемых веществ. Наблюдения продолжались последующие 30 минут.
Животные считались незащищенными, если демонстрировали вращательное
55
поведение: два и более последовательных круговых движений на 360 градусов
[Bum E. N. et al., 2011].
2.2.3 Определение антиконвульсивной активности соединения-лидера при его хроническом введении
Изучение антиконвульсивной активности на модели киндлинг прогрессии с коразолом. Фармакологический киндлинг моделировался путем повторных введений коразола по схеме каждые 48 часов в подпороговой дозе 35
мг/кг и.п., не вызывающих судорожных состояний на начальных этапах [Спасов А.
А. и др., 2015]. Эксперимент выполнялся в утренние часы в период с 9:00 до 12:00.
Животные были разделены на 3 группы (n=15). Исследуемое вещество и референтный препарат вводились каждый день (за 30 минут до введения коразола,
либо в 9:00). В качестве эталонного препарата использовался вальпроат натрия в дозе 100 мг/кг, и.п. Исследуемое вещество вводилось в дозе 10 мг/кг, и.п. Группа негативного контроля получала растворитель (0,2 мл дистиллированной воды и.п.).
Растворитель (0,2 мл), вальпроат (100 мг/кг), РУ-1205 (10 мг/кг)
1 2 3 4 5 ………………. 25 26 27 28 29 30 31
Коразол (35 мг/кг)
Рисунок 2.4 Схема введения тестируемых веществ
Оценку судорожных реакций у животных определяли по суммарной балльной шкале:
0баллов — отсутствие изменений;
1балл — оживленное поведение, активное обнюхивание, неподвижное положение;
2балла — единичные миоклонические подергивания головы или отдельных мышц тела;
3балла — серийные подергивания всего тела, симптом Штраубе;
4балла — «барабанный бой», «дикий бег»;
5баллов — генерализованные клонико-тонические судороги с падением набок (утратой рефлекса переворачивания). Тонические судороги.
Наблюдение проводилось в течение 30 мин после введения коразола с
помощью HD видеорегистрации. Суммарный подсчет баллов проводился
56
индивидуально для каждого животного. Затем выполнен подсчет среднего балла
для каждой группы с расчетом стандартной ошибки (m).
Противосудорожная активность соединения на киндлинг-модели
интермиттирующих ингаляций паров алкоголя.
Рисунок 2.5 Устройство установки для интермиттирующей подачи паров алкоголя
Пары этанола в концентрации 15 мг/л нагнетались воздушной помпой со скоростью 8 л/мин в ингаляционную камеру с животными (рисунок 2.5).
В течение 4 дней животные подвергались интермиттирующему воздействию алкоголя (16 ч/день с последующей отменой на 8 часов).
Было выделено 4 группы животных:
1)Воздух + растворитель (дистиллированная вода в объеме 0,1 мл на 10 г веса)
2)Пары алкоголя + растворитель
3)Пары алкоголя + вальпроат натрия в дозе 300 мг/кг, внутрибрюшинно
4)Пары алкоголя + РУ-1205 (10 мг/кг внутрибрюшинно).
57
Каждый день через 6 часов после прекращения подачи алкоголя (пик проявления эпиактивности) производилась оценка судорожной активности по шкале HIC (Handling-induced convulsions – судороги, вызванные «хендлингом»)
(таблица 2.2), а на 4 сутки ежечасно вплоть до 8 ч.
|
|
Таблица 2.2 |
|
Шкала оценки HIC |
|||
Баллы |
|
Поведенческая реакция |
|
|
|
|
|
0 |
|
Нет реакции при поднятии за хвост и вращении на 180-360 градусов |
|
|
|
|
|
1 |
|
Подергивания мимических мышц после вращения на 180-360 градусов |
|
|
|
|
|
2 |
|
Тонические судороги при вращении на 180-360 градусов |
|
|
|
|
|
3 |
|
Тонико-клонические судороги при вращении на 180-360 градусов |
|
|
|
|
|
4 |
|
Тонические судороги при поднятии за хвост |
|
|
|
|
|
5 |
|
Тонико-клонические судороги при поднятии за хвост с задержкой на 1–2 с |
|
|
|
|
|
6 |
|
Выраженные тонико-клонические судороги при поднятии за хвост |
|
|
|
|
|
7 |
|
Спонтанные тонико-клонические судороги |
|
|
|
|
|
2.2.4 |
Влияние на формирование фоновой фокальной активности |
||
отдельных нейронных колонок соматосенсорной коры2
Микроаппликация соединения-лидера осуществлялась на расстоянии до 50
мкм от регистрирующих микроэлектродов на глубине 1000 мкм [Сухов А.Г. и др.,
2009]. Объем раствора составлял менее 1 мкл, время микроаппликации занимало менее 30 с. Отведение внеклеточной фоновой активности мозга крыс осуществлялось монополярно, референтным электродом являлся один из зажимов головодержателя. Для определения фокальной активности исследуемых структур мозга использовались стеклянные микроэлектроды, наполненные 2,5 М раствором
NaCl с сопротивлением 1–5 мОм и диаметром кончика 2-3 мкм. Регистрацию фоновой фокальной проводили на жесткий диск копьютера с помощью 16-
канального АЦП L-761 (L-Card, Россия) с частотой дискретизации сигнала 1 кГц.
2 Исследование выполнено на базе НИИ нейрокибернетики им. А.Б.Когана Южного федерального университета
58
2.2.5 Влияние на развитие эпилептиформной активности, вызванной электрической стимуляцией поверхности мозга3
Для исследования антиэпилептиформных свойств использовали метод искусственного генеза эпиактивности с помощью электрической стимуляции поверхности мозга (ритмическая стимуляция током с параметрами: напряжение
120 В, длительность 10 с, частота стимуляции 10 Гц) [Сухов А.Г. и др., 2009]. Для усиления биоэлектрической активности использовался 10-канальный усилитель УБС 1/10 (Россия) с полосой пропускания от 0,1 Гц до 2000 Гц. Диапазон усиливаемых напряжений от ± 5 мкВ до ± 10 мВ. Входное сопротивление не менее
10 мОм. Выходное сопротивление не более 0,1 кОм. Регистрация вызванной биоэлектрической активности проводилась на жесткий диск копьютера с помощью
16-канального АЦП L-761 (L-Card, Россия) с частотой дискретизации сигнала 1
кГц. Для стимуляции использовались электростимуляторы ЭСЛ-2 (Россия), ГЭФИ- 3-БУ (Россия). Управление стимуляцией производилось через TTL выходы платы
L-761 (L-Card, Россия) и задавалось программно.
2.2.6 Механизм антиконвульсивного действия
Влияние соединения на сокращение препаратов изолированного семявыносящего протока кролика. Механизм каппа-рецепторного действия оценивался по способности угнетать вызванные низкочастотной электрической стимуляцией (10 Гц, амплитуда 50 В, 2 мс) сокращения изолированного семявыносящего протока кролика (СПК), эксклюзивно экспрессирующего каппа-
подтип опиоидных рецепторов [Oka T. et al., 1981]. Эксперимент выполнялся на установке для работы с изолированными органами Ugo Basile (Италия).
Выделенный препарат СПК длиной 10-15 мм закреплялся между двумя электродами и помещался в емкость объемом 10 мл, содержащую изотонический раствор при температуре 37°С и постоянной аэрации воздухом. Учитывался исходный сократительный ответ органов [Гречко О. Ю. и др., 2014].
3 Исследование выполнено на базе НИИ нейрокибернетики им. А.Б.Когана Южного федерального университета
59
Исследуемое вещество, а также референтные препараты
(высокоселективный агонист каппа-опиоидных рецепторов – U-50,488 и
буторфанола тартрат) добавлялись в емкость в возрастающих концентрациях. О
каппа-рецепторной активности судили по разнице сократительного ответа,
вызванного электрической стимуляцией между опытными и контрольными значениями.
Спомощью метода регрессионного анализа рассчитывались величины ЭК50
–концентрации вещества, ингибирующие сократительный ответ гладкомышечного органа на 50%. Для оценки вклада каппа-агонистического действия изучаемых веществ на сократительный ответ изолированных препаратов, проводились тесты с предварительным добавлением селективного каппа-антагониста –
норбиналторфимина (nor-BNI).
Влияние соединения на ионные токи Ca2+ и Na+ нейронов моллюска.4
Для изучения влияния на натриевые и кальциевые трансмембранные ионные токи использовали метод внутриклеточного диализа и фиксации мембранного потенциала (patch clamp) на нейронах моллюска прудовика большого (Lymnаeа stagnalis) [Вислобоков А. И. и др., 2001]. Изолированную клетку помещали на полиэтиленовую пипетку (при фиксированном потенциале -90 мВ). При создании толчков отрицательного гидростатического давления мембрана нейрона разрушалась, создавался электрический контакт внутриклеточного содержимого с неполяризующимся электродом, соединенным с усилителем фиксации потенциала.
Соединение исследовали в диапазоне концентраций 1–1000 мкМ. После измерения суммарных ионных токов выполняли замену внутриклеточного и наружного растворов на растворы для регистрации отдельных токов. Выделение чистых кальциевых или натриевых токов со стабильными параметрами, которые принимали за исходные значения (контроль), происходило через 3–5 мин. после полной замены растворов. Далее раствор в камере с нейроном заменяли раствором с исследуемым веществом. Когда изменения ионных токов, вызванные действием изучаемого вещества, стабилизировались (через 2–3 минуты), вновь
4 Исследование выполнено на базе НИИ фармакологии им. А.В. Вальдмана
60
регистрировали величины токов (эффект). После этого раствор заменяли исходным, и наблюдали динамику восстановления токов (отмывание).
На основании полученных данных с помощью компьютера были построены вольтамперные характеристики (ВАХ) мембраны ионных каналов и зависимости
"концентрация-эффект". Исходные величины токов принимали за 100%, а
установившиеся при действии соединения выражали в % от исходных значений.
Рисунок 2.6 Микроаппликация биологически активных веществ.
Влияние на эпилептиформную активность отдельных нейронных
колонок соматосенсорной коры белых крыс, вызванную введением пикротоксина.5 Электрофизиологические тесты по изучению влияния соединения-лидера на эпилептиформную активность, вызванную пикротоксином в концентрации 75 мкМ выполнялись на крысах с использованием методики микроэлектродной микроаппликации растворов [Сухов А.Г. и др., 2009].
Микроаппликация осуществлялась на расстоянии до 50 мкм от регистрирующих микроэлектродов на глубине 1000 мкм. Отведение внеклеточной активности мозга крыс осуществляли монополярно, референтным электродом являлся один из зажимов головодержателя. Для регистрации фокальной активности исследуемых
5 Исследование выполнено на базе НИИ нейрокибернетики им. А.Б.Когана Южного федерального университета