4 курс / Общая токсикология (доп.) / Токсикометрия эффективных доз

Криштопенко С.В., Тихов М.С. Токсикометрия эффективных доз Нижний Новгород: ННГУ, 1997, 156 с.

Список сокращений и условных обозначений

АХ — ацетилхолин

ED50 — среднеэффективная доза, вызывающая у тест-объектов регистрируемый признак не менее чем в 50% случаев МОТ — мера относительной токсичности

LD50 — среднеэффективная доза, вызывающая у тест-объектов летальные исходы не менее чем в 50% случаев ФАВ — физиологически активные вещества ЦНС — центральная нервная система ЧСС — число сокращений сердца в минуту ЭКГ — электрокардиограмма

As — показатель асимметрии распределения выборки Ех — показатель эксцесса распределения выборки Fв — вычисленное значение критерия Фишера

FCT — стандартное (табличное) значение критерия Фишера, взятое из соответствующих таблиц стандартного распределения Фишера

k — обозначение степени свободы для статистического показателя п — число наблюдений

R — число градаций факторов в дисперсионном анализе S2 — дисперсия

Sx — среднее квадратическое отклонение Ss — ошибка среднего

S — функция эффективности (токсичности), вычисленная по пробитметоду

SED50 — среднее квадратическое отклонение ED50 SХED50 — стандартная ошибка ED50

х — значение показателя

xmin — минимальное значение показателя в выборке xmах — максимальное значение показателя в выборке χ2 — критерий хи-квадрат Пирсона

* — обозначение статистической значимости показателя или достоверности различий двух показателей при P≤0.05

Введение

Основными задачами экспериментальных исследований в фармакологии, токсикологии, радиологии и других биологических науках являются изучение механизма действия лекарственных препаратов, токсичных веществ, ионизирующих излучений, поиск эффективных антидотных и лекарственных средств. Необходимость сравнения определяемых в эксперименте показателей токсичности (эффективности) предполагает использование единой статистически обоснованной и удобной в практическом применении величины. На современном этапе токсикометрии повсеместно используются величины эффективных доз, вызывающих появление учитываемого признака (эффекта) в экспериментальной группе тест-объектов с заданной вероятностью Р (0.05, 0.16, 0.50, 0.84, 0.95 и т.д.). Такие дозы получили название эффективных доз

(ED5, ED16, ED50, ED84, ED95 и т.д.) или категорий эффективных доз. Общая зависимость вероятности появления эффекта от воздействия за-

данной дозы определяется как функция эффективности (токсичности) В качестве единого показателя для сравнения эффективности тестируемых препаратов принята среднеэффективная доза (ED50), определяемая из функции эффективности. Трудность заключается в нахождении статистически обоснованных расчетно-экспериментальных значений категорий эффективных доз, которые представляют собой случайные величины. Проблема вероятностной оценки токсического и других эффектов рассматривается как одна из важнейших в токсикометрии и других разделах биологии и широко разрабатывается, исходя из задач экспериментальной практики (Кабатов Ю.Ф., Славин М.Б., 1971; Балантер Б И., 1977; Саноцкий И.В., Авилова Г.Г., 1978; Авалиани С.Л. и соавт., 1987; Новиков СМ. и соавт., 1989; Дагаев В.Н. и соавт., 1994).

Функция эффективности имеет очень важное, а иногда принципиальное значение в фармакологии — при оценке эффективности лекарственных препаратов; в токсикологии и радиологии — при исследовании количественной токсичности ядов и поражающих

свойств ионизирующих излучений; в гигиене — при нормировании критических уровней вредных факторов и в других областях.

Построение функции эффективности является статистической задачей, способ решения которой предъявляет соответствующие требования к планированию эксперимента и виду получаемых исходных данных. Биологический эксперимент на завершающем этапе требует метрологически обоснованных точных статистических оценок результатов, учитывающих погрешности получения исходных данных и их влияние на

конечные показатели.

Наибольшее прикладное значение имеет направление, связанное с вопросами оценки показателей токсичности (среднеэффективных доз). Токсикометрия среднеэффективных доз охватывает широкую область применения в токсикологии, включающую решение задач гигиенического регламентирования производственных вредных факторов (Саноцкий И.В. и соавт., 1975; Штабский Б.М. и соавт., 1979, 1980,а,б; Шандала М.Г. и соавт., 1986; Богорад B.C., Антомонов М.Ю., 1990), прогнозирования опасности для человека (Красовский Г.Н., 1970; Заугольников С.Д. и соавт., 1978; Рыболовлев Ю.Р., 1984; Гончаров СИ. и

соавт., 1993; Oser R.L., 1981; Brown С.С, 1983; Mautz W.J., 1985), раз-

работки лекарственных препаратов и методов лечения (Прозоровский В.Б., 1993; Rong K.Т. et al., 1990), исследования патогенеза интоксика-

ции (Naidu К.А. etal., 1987).

Токсикометрия — одно из наиболее динамично развивающихся направлений общей (теоретической) токсикологии (Голиков С.Н., Софронов Г.А., 1994; Румянцев Г.И., Новиков СМ., 1994). Наряду с традиционным определением токсикометрии как раздела токсикологии, посвященного изучению количественных закономерностей токсического эффекта (Саноцкий И.В., 1970; Голубев А.А. и соавт., 1973; Сапунов В.Б., 1985; Измеров Н.Ф. и соавт., 1986; Копанев В.А. и соавт., 1988; Фрумин Г.Т., 1989), в последние два десятилетия сформировались новые направления токсикометрии, такие как объемная токсикометрия (Сперанский СВ., 1977), клиническая токсикометрия критических состояний организма (Дагаев В.Н., 1992), токсикометрия количественных показателей токсичности - среднеэффективных доз (Прозоровский В.Б. и соавт., 1978, 1980, 1983, 1991, 1992; Пастушенко Т.В. и соавт., 1985; Коршун М.Н., 1992; Finney D.J., 1979, 1985).

Методы определения среднеэффективных доз развивались и совершенствовались параллельно с развитием математической статистики и теории вероятностей. Открытие Гауссом закона нормального распределения послужило основой для разработки пробит-анализа, который в разных модификациях (Беленький М.Л., 1963; Лившиц П.З., 1966; Про-

зоровский В Б. и соавт., 1978, 1980, 1992; Сперанский СВ., 1985; Miller L.S. et al., 1944; Litchfield J.T. et al., 1949; Finney D.J., 1979, 1985; Weil C.S., 1983 и др.) используется до настоящего времени в качестве основного (традиционного) метода определения среднеэффективных доз.

В токсикологии особенно важное значение отводится именно методам определения среднеэффективных доз, так как они являются теми решающими факторами, от которых зависит способ планирования экс-

периментов, порядок формирования и объем исходных данных, а в конечном итоге качество, эффективность и достоверность искомых показателей токсичности. По этим признакам проблему токсикометрической оценки показателей токсичности можно рассматривать как фундаментальную проблему общей (теоретической) токсикологии, имеющей прикладное значение для других разделов биологии и медицины. Вместе с тем отметим, что определение показателей токсичности рассматривается как частный случай оценки эффективности воздействия на тестобъекты самых разнообразных факторов (радиационного, термического, бактериального и т.д.). Поэтому указанные методы токсикометрии нашли широкое применение и в других научных областях.

В дальнейшем, изложение материала мы будем строить на примерах показателей токсичности веществ, принимая во внимание тот факт, что приводимые положения в полной мере можно интерпретировать и для других разделов экспериментальной науки.

Существенные недостатки традиционных методов определения среднеэффективных доз состоят в том, что для своего адекватного применения они выдвигают ряд граничных условий к планированию и выполнению токсикологического эксперимента, как в отношении градаций испытываемых доз, так и в отношении числа тест-объектов в экспериментальных группах. В токсикологической практике часто возникают ситуации, при которых предварительное планирование эксперимента технически невозможно, например, в тех случаях, когда количество токсиканта устанавливается после отравления, что весьма характерно для клинической токсикологии и часто встречается при выполнении специальных задач токсикологического эксперимента. В подобных ситуациях сформировать однородные экспериментальные группы тестобъектов невозможно. Поэтому применение традиционных методов оценки количественных показателей токсичности бывает либо экономически неоправданным, либо статистически некорректным.

Кроме сказанного необходимо отметить, что для корректного применения методов пробит-анализа необходимым условием является нормальность распределения функции эффективности (Беленький М.Л., 1963; Miller L.S. et al., 1944; Litchfield J.T. et al., 1949; Finney D.J., 1979, 1985). Однако, в традиционных методах определения среднеэффективных доз критерии оценки нормальности функции эффективности отсутствуют, что ставит под сомнение универсальность этих методов для любой экспериментальной ситуации. Проблема нормальности выборок рассматривается в качестве одной из важнейших при формировании регламентационных оценок и критериев (Шитиков В.К. и соавт., 1985;

Хвастунов P.M., 1989; Ковалев А.Ф., 1993).

Следует обратить внимание на еще один важный и принципиальный аспект токсикометрии. Потребности практики обуславливают необходимость одновременного определения как полного перечня категорий эффективных доз от ED1 до ED99, так и вида самой функции эффективности. Категории эффективных доз необходимы для проведения сравнительных и регламентационных оценок токсичности веществ, а вид (или распределение) функции эффективности является отражением механизмов реализации токсичности (эффективности) испытуемых препаратов. Эту проблему, в целом, можно решить двумя способами. Первый (традиционный) способ предполагает начальное построение функции эффективности по исходным экспериментальным данным и вычисление на ее основе категорий эффективных доз. При таком подходе неотъемлемым условием является нормальность распределения функции эффективности, так как в противном случае вычисление категорий эффективных доз, включая ED50, невозможно, согласно законам математической статистики. На таком принципе основаны все существующие методы расчета среднеэффективных доз (Литчфилда-Вилкоксона, Финни, Прозоровского, Фрумина и другие).

К решению проблемы «доза-эффект» теоретически возможен и другой (противоположный) подход, принцип которого заключается

в первоначальном определении по исходным экспериментальным данным категорий эффективных доз. Затем по найденным категориям эффективных доз устанавливается вид и распределение функции эффективности. Такой подход изначально исключает необходимость нормального распределения функции эффективности и позволяет выборочно определять заданные категории эффективных доз. С его использованием появляется возможность построения функции эффективности веществ, обладающих парадоксальными эффектами. Для токсикологической практики подобная постановка проблемы несомненно является оптимальной. Но для ее реализации необходима разработка специальных методов математического анализа зависимости «доза-эффект». Отметим, что до настоящего времени проблема определения категорий эффективных доз и построения функции эффективности в такой постановке еще не формулировалась.

Принимая во внимание приведенные доводы, становится совершенно ясно, что современная методология токсикологического эксперимента и токсикометрии требует разработки таких моделей оценки показателей токсичности, которые бы не предъявляли каких-либо граничных условий к планированию и выполнению токсикологического эксперимента,

позволяли бы использовать для нахождения конечных оценок результаты независимых единичных испытаний и основывались на законах современной метрологии, математической статистики и теории вероятностей. Разработка новых токсикометрических моделей оценки токсичности должна быть направлена на максимально возможное уменьшение числа токсикологических испытаний на живых тест-объектах при сохранении заданной надежности конечных показателей токсичности, т. е. на оптимизацию токсикологического эксперимента и сокращение материальных затрат. Для успешного решения этой проблемы проводится объемные всестороннее изучение видовых патогенетических механизмов, разработки токсикометрических моделей диагностики тяжести интоксикации, токсикокинетических и токсико-динамических моделей токсикологической оценки на животных (Голиков С.Н., 1981; Аничков СВ., 1982; Голиков С.Н. и соавт., 1986; Bloom E.F., 1988; Bentley P., 1990; Russell R.W.,1991; Clement J.G., 1994 и др.). Так, например, только в Швейцарии в 1987 для определения LD50 было использовано 1.3 миллиона лабораторных животных (Zbinden G., 1990). Это побуждало исследователей искать пути сокращения выборок тест-объектов для оценки эффективных доз (Прозоровский В.Б. и соавт., 1978, 1980, 1983; Спе-

ранский СВ., 1986; Фрумин Г.Т., 1991; Majda A., 1976; Lorke D., 1983; Noordwijk J.. 1988; Pillai K.S. et al., 1990; Glowa J.R., 1991).

В отдельную проблему формируется направление, связанное с построением общей функции эффективности двух и более веществ, обладающих по отношению друг к другу синергизмом или антагонизмом. Некоторыми авторами (Маненко А.К., 1982, Маненко А.К., Иванова О.П., 1988) предпринимались попытки решения этой проблемы. Но, следует признать, что предложенные методы не являются оптимальными для решения практических задач.

Все это побудило авторов данной книги направить усилия на решение проблемы построения функции эффективности и вычисления категорий эффективных доз статистически обоснованными и экономичными методами В книге приведены в историческом и сравнительном плане известные авторам методы расчета средне-эффективных доз и дан их анализ с позиций современных представлений математической статистики.

1. Эффективная доза, как статистический показатель. Категории эффективных доз (понятия, определения, термины)

В данной главе будут рассмотрены основные понятия, определения и термины, касающиеся проблемы построения функции эффективности и вычисления категорий эффективных доз. Необходимость строгой определенности в терминах требуется по той причине, что в ходе исторического появления и совершенствования разных методов формировались разные авторские термины, обозначающие одни и те же понятия. Например, функция эффективности определялась разными авторами как «кривая летальности», «характеристическая кривая», «кривая дозаэффект» и т.д.

При изложении материала мы придерживались терминологии и понятий, принятых в математической статистике, допуская некоторые комментарии и сравнения с историческими названиями показателей.

1.1. Статистическое и биологическое содержание понятия «эффективная доза»

Под термином «эффективная доза» в общем смысле следует понимать количественное выражение исследуемого фактора (дозы), который вызывает в группе тест-объектов результативный признак (эффект) с заданной вероятностью его появления. В отношении термина «эффект» в литературе прослеживается много неопределенностей, что приводит к путанице в отдельных понятиях и формулировках. Часто наблюдается несоответствие в применении термина «эффект» в отношении количественной и качественной оценок результатов воздействия исследуемых факторов.

Остановимся на этом вопросе детальнее. В переводе с английского «effect» дословно означает «результат, следствие, действие». В «Толковом словаре русского языка» под редакцией Б.М.Волина и Д.И.Ушакова (1935-40 гг.) слово «результат» определяется как «конечный итог, следствие, завершающее собой какое-нибудь действие, явление».

Таким образом, термины «эффект», «результат» обозначают сформировавшееся, завершенное событие, точно установленное качественное следствие процесса или состояния. Поэтому понятие «эффект» применимо только к качественному (альтернативному) выражению ответа со стороны тест-объекта на воздействие исследуемого фактора. Дозы исследуемого фактора, вызывающие с заданной вероятностью появление качественного (альтернативного) признака, можно обоснованно определить как «эффективные дозы», а зависимость между дозой и веро-

ятностью эффекта — как зависимость «доза-эффект». Термины-синонимы «ответ», «отклик», «реакция» не определяют

сформировавшийся результат, а потому не могут применяться для характеристики качественных признаков. Дозы исследуемого фактора, которые способны вызвать у тест-объектов учитываемые признаки, выражаемые в количественной (градированной) форме, мы предлагаем называть «реактивными дозами», а соответствующую зависимость — «до- за-реакция».

Поясним применение приведенной терминологии на следующем практическом примере.

При экспериментальном исследовании кардиотоксического действия антихолинэстеразного яда на белых крысах была установлена зависимость частоты сокращений сердца в минуту (ЧСС) от дозы, изображенная на рис. 1.1.

Предварительно было экспериментально установлено, что в данных условиях эксперимента исходные значения ЧСС в группе белых крыс из 279 объектов составили 495(416±575) сокращений в минуту при Р=0.01 (критерий односторонний). Данный диапазон значений ЧСС и был принят в качестве биологической нормы. Приведенный диапазон значений ЧСС имеет статистическое определение как «толерантный интервал», смысл которого будет подробно определен в следующем разделе.

Из рисунка 1.1 видно, что в исследованном диапазоне доз зависимость «доза-реакция» может быть выражена количественно при помо-

щи методов регрессионного анализа. Дозы, вызвавшие у животных статистически значимую реакцию уменьшения ЧСС, можно рассматривать как кардиотоксические «реактивные дозы» (дозы, большие D]), а дозы, не вызвавшие данной реакции — как «нереактивные дозы» (заштрихованная зона на рисунке). В некотором диапазоне доз (D^D,») явно определяется регрессионная зависимость между испытанными дозами и ЧСС (реакцией со стороны животных).

Типичный пример подобной постановки эксперимента приведен в работе Я.И.Хаджай (1965), и, как следует из названия работы («О графическом способе определения эффективной дозы и ее доверительных границ при учете реакций в градированной форме»), автором допущено явное несоответствие в понятиях «реакция» и «эффективная доза».

Если в качестве критерия кардиотоксического эффекта исследуемого вещества у белых крыс принять снижение ЧСС ниже 416 сокращений в минуту (левая граница толерантного интервала биологической нормы при Р=0.01), то после воздействия некоторой

дозы яда на однородную группу животных, у одних животных ЧСС может быть ниже принятого значения, а у других ЧСС не достигнет заданной критической отметки. И по этому признаку экспериментальные животные будут разделены на две подгруппы. В таком случае представится возможность определить вероятность появления в экспериментальной группе животных учитываемого признака (эффекта) после воздействия испытанной дозы яда. При испытании нескольких доз яда на разных группах животных можно методами математической статистики построить функцию эффективности исследуемого токсичного вещества в отношении кардиотоксического эффекта, учитываемого по критерию снижения ЧСС у белых крыс ниже 416 сокращений в минуту. Такая функция отражает вероятность появления эффекта у тест-объектов в зависимости от количества (дозы) исследуемого фактора (токсичного вещества) и носит название функции эффективности. Пример функции эффективности приведен на рис. 1.2. Из этой функции возможно определение полного перечня категорий эффективных доз испытанного вещества от ED1) до ED99 при условии, если она соответствует закону нормального распределения.

Таким образом, понятие «эффект» связано с альтернативной формой представления учитываемого признака. Эффективные дозы определяют вероятность появления эффекта в исследованной выборке тестобъектов, что лежит в основе названия соответствующих категорий эф-

фективных доз (ED5, ED16, ED50, ED84, ED95 и т.д.). Согласно терминологии теории вероятностей категории эффективных доз представляют

собой непрерывные величины, определяемые в каждой точке числовой прямой в пределах заданного диапазона.

В одних случаях результативный признак имеет только альтернативную форму регистрации, а в других — только градированную. В том случае если необходимо определить эффективные дозы для показателей, регистрируемых только в градированной форме, можно произвести перевод признака из градированной формы в альтернативную путем задания некоторых критериальных условий, как это было показано в приведенном выше примере (рис. 1.1 и 1.2). Данный прием часто называют «синтезом дозовой системы» (Максимов Г.К., Синицын А.Н., 1983; Богданов А.А., Шлендов В.Д., 1994). Однако следует помнить, что в таких случаях происходит потеря и искажение информации, которая статистически не определяется. Но, несмотря на этот недостаток, приведение показателей к альтернативной форме позволяет расширить статистический анализ исследуемого явления. Как достоинства, так и недостатки применения альтернативной формы учета признака проявляются только при решении конкретных экспериментальных задач, и в большей степени зависят от качества выполнения эксперимента, чем от

применения методов статистического анализа.

В качестве результативных признаков могут регистрироваться самые разнообразные эффекты. Например, если результат воздействия на животных токсичного препарата в разных дозах оценивается по появлению летальных исходов, то доза, вызывающая данный эффект с заданной вероятностью, называется летальной дозой. Доза, вызывающая появление летального эффекта с вероятностью 0.5 называется среднелетальной дозой (LD50). Среднеэффективная доза имеет особое значение, так как именно она совместно с показателем вариабельности используется для статистического сравнения функций эффективности разных исследуемых веществ.

Главная проблема состоит в построении функции эффективности и вычислении на ее основе категорий эффективных доз. Решение этой проблемы составляет задачу математической статистики, от способа решения которой зависит планирование токсикологического эксперимента и вид представления исходных данных.

1.2. Функция эффективности и категории эффективных доз

Функция эффективности является функцией случайной величины X, которая представляет собой дозу исследуемого фактора, определяющую вероятность появления эффекта Поэтому характеристиками функции эффективности являются среднее значение дозы и дисперсия. Вид распределения функции эффективности имеет принципиальное значение для ее статистического построения, последующего анализа и сравнения категорий эффективных доз. Важность этого вопроса вытекает из того факта, что все существующие методы определения среднеэффективных доз основаны на предположении о нормальном распределении функции эффективности. Для последующего анализа принципов построения функции эффективности и расчета категорий эффективных доз, положенных в основу существующих (традиционных) методов, необходимо рассмотреть некоторые статистические понятия в их взаимосвязи с биологической сущностью проблемы «доза-эффект».

Дисперсия среднеэффективной дозы складывается из двух составляющих. Первая — биологическая составляющая дисперсии обусловлена биологической сущностью изучаемого явления. Вклад в биологическую составляющую дисперсии вносят индивидуальная чувствительность тест-объектов к воздействию изучаемого фактора, которая определяется особенностями протекания биохимических процессов в живом организме, колебаниями уровней гормонов и ферментов и т.д. Вторая — экспериментальная составляющая дисперсии обусловлена

погрешностями эксперимента, включающими погрешности лабораторных анализов и измерений, ошибки в количественном определении доз, воздействовавших на тест-объекты и т.д.

Проблема оценки биологической вариабельности в целом и суммарной дисперсии среднеэффективной дозы в частности продолжает оставаться наименее разработанной. В отдельных исследованиях предпринимались попытки количественной оценки погрешности определения среднеэффективной дозы (Коршун М.Н., Брайченко Л.М., 1983; Трахтенберг И.М. и соавт., 1984). Так, И.М.Трахтерберг и соавт. (1984), проанализировав ряд причин, приводящих к погрешностям определения величин среднеэффективных доз химических веществ при пероральном введении мышам, установили, что даже при соблюдении всех метрологических требований общепринятых стандартов основной вклад в общую погрешность среднеэффективной дозы вносят погрешности измерения объемов рабочих растворов и введения их тест-объектам, которые в количественном измерении составляют от 5 до 25% от общей погрешности среднеэффективной дозы. Кроме того, существенный вклад в общую дисперсию среднеэффективной дозы вносят колебания массы тела мелких лабораторных животных. Так, по нашим данным естественные колебания массы тела белых крыс, связанные с приемом пищи и дефекацией, могут достигать 10 и более процентов.

Количественные значения отдельных составляющих дисперсии среднеэффективной дозы определить практически невозможно. Важно статистическими методами оценивать величину общей дисперсии и анализировать ее влияние на достоверность конечного результата. До настоящего времени подобных методов не разработано. Существующие методы вычисления среднеэффективных доз позволяют определить величины погрешностей, обусловленные статистическими вычислениями, и не учитывают совокупного влияния всех видов погрешностей на искомый показатель.

В научной литературе не прекращаются дискуссии, связанные с проблемой оценки нормальности функции эффективности. Особое внимание исследователей к данной проблеме обусловлено, в основном, двумя причинами. Во-первых, если нормальность функции эффективности исследуемого фактора в каждом конкретном эксперименте не доказана, то вычисление среднеэффективной дозы и вероятностных интервалов может быть расценено как статистически некорректная процедура, так как существующие методы расчета среднеэффективной дозы основаны на предположении о нормальном или логарифмически нормальном распределении функции эффективности. Во-вторых, классические методы

оценки соответствия распределения случайной величины нормальному закону непригодны для оценки нормальности распределения функции эффективности по следующей причине.

Функция эффективности в отличие от классической функции нормального распределения случайной величины имеет иной способ статистического построения. Так, функция нормального распределения любой случайной величины X строится по результатам отдельных наблюдений Х1, Х2 , ... ., Хn путем формирования диапазонов и определения частот появления в них исследуемого признака. Она может быть выражена как в интегральном, так и в дифференциальном виде. Существующие критерии согласия для оценки нормальности распределения применимы только для случайной величины, выборочные значения которой найдены по результатам независимых случайных испытаний (Конюховский В.В., 1970).

Любая случайная величина X, имеющая нормальное распределение, задается параметрами а (среднее значение) и σ2 (дисперсия) с плотностью распределения:

(1.1)

Оценки параметров а и σ2 могут быть вычислены по экспериментальным значениям случайной величины Х1, Х2 , ... ., Хn с использованием известных формул (Венецкий И.Г., Венецкая В.И., 1979).

Функция же эффективности сразу строится в интегральном виде по результатам экспериментального определения частот появления признака в однородных группах и косвенного определения соответствующих этим частотам категорий эффективных доз. Поэтому непосредственно по исходным экспериментальным данным вычислить значения данных параметров при помощи существующих методов расчета среднеэффективной дозы не представляется возможным. Уточним, что в роли случайной величины X в данном случае выступают испытанные дозы, вызывающие у тест-объектов изучаемый признак, например, летальные исходы и т.д. Параметр а соответствует величине среднеэффективной дозы (ED50). Естественно, наблюдать в эксперименте выборочные значения случайной величины X применительно к рассматриваемой ситуации невозможно. Поэтому расчет параметров формулы 1.1 проводится косвенными методами, которые основываются на следующих положениях.

В токсикологии и фармакологии экспериментально установлено, что зависимость «доза-эффект», для многих известных ядов и лекарствен-

ных препаратов, определенная на разных видах животных, выражается S-образной кривой, напоминающей по форме кривую интегральной функции нормального распределения (Беленький М.Л., 1963; Фрумин Г.Т., 1991). Поэтому и было предложено аппроксимировать кривую «доза-эффект» интегральной функцией нормального распределения. Исходя из данного положения принимается, что среднеэффективная доза соответствует среднему значению параметра нормальной функции эффективности, т.е. является косвенной оценкой параметра а функции нормального распределения случайной величины. Частоты эффектов при этом отражают значения квантилей нормального распределения. Так, квантиль или частота эффекта 0.1587 соответствует приблизительно категории дозы ED16, а 0.8413 — ED84. При этом отклонения указанных категорий эффективных доз от среднеэффективной дозы в абсолютных единицах расценивается как среднее квадратическое отклонение SED50 или одна сигма и вычисляется по формуле:

(1.2)

Рассмотрим детальнее статистический смысл величины SED50. В литературе часто эту величину, выраженную через логарифмически нормальное распределение, после возведения в степень по основанию логарифма некорректно называют «функцией токсичности». Статистическая некорректность данного выражения вытекает из того факта, что среднее квадратическое отклонение не является какой-либо функцией, а представляет собой статистический показатель равный по значению квадратному корню из оценки дисперсии σ2 (Лакин Г.Ф., 1980; Львовский Е.Н., 1982; Герасимович А.И., 1983). Так как среднее квадратическое отклонение определяет форму или вид функции эффективности, то, по нашему мнению, было бы вполне корректно дать величине SED50 название показателя эффективности, или для частного случая — показателя токсичности. В этом смысле показатель эффективности и будет показывать вид функции эффективности или интенсивность нарастания вероятности появления эффекта при увеличении испытываемых доз.

Таким образом, квадрат показателя эффективности S2ED50 является косвенной оценкой параметра σ2 функции нормального распределения случайной величины. В этом и заключается принципиальное отличие функции эффективности от классической функции нормального распределения случайной величины.

При нормальном или логарифмически нормальном распределении функции эффективности появляется возможность определять вероятно-

стные интервалы колебаний исследуемой случайной величины. Этот вопрос имеет важное значение для понимания и статистического анализа результатов вычислений как среднеэффективной, так и других категорий эффективных доз при помощи статистических методов.

Рассмотрим понятие и статистический смысл доверительного интервала и толерантного интервала.

Пусть результаты наблюдений Х1, Х2 , ... ., Хn — независимые случайные величины с распределением Рθ, зависящим от неизвестного параметра θ (θ — действительное число или совокупность действительных чисел). Тогда при заданном γ (0 < γ < 1) интервал с границами:

такой, что для любого θ называется доверительным интервалом заданной надежности γ. Этот интервал (θ1, θ2) с вероятностью не меньшей у накрывает истинное значение параметра θ распределения Рθ. Если величина X имеет нормальное N (а, σ2) или логарифмически нормальное распределение и параметр σ2 известен, то доверительный интервал параметра а, т.е. среднеэффективной дозы ED50, с заданной степенью надежности (γ=1 – α) имеет границы:

(1.3)

где Z1-α/2 — квантиль стандартного нормального распределения заданного порядка (l-α/2), n — объем выборки. Так, при γ = 0.95 и α =

0.05; t0,975 = 1.96, а при γ =0.99 и α = 0.05; t0,995 = 2.58.

В случае, если σ2 неизвестно, то доверительный интервал для ED50 заданной надежности имеет границы:

(1.4)

где tf,1–α/2 - квантиль распределения Стьюдента при степени свободы

f=n-1. Так, при γ=0.95 и n=10 f0,975=2.26, при n=20 f0,975=2.О9, при n=100 f0,975=1.98, при n=500 f0,975=l,96. Для γ=0.99 квантили t-распределения Стьюдента примут значения соответственно 3.25, 2.86, 2.63 и 2.59.

Статистический смысл доверительного интервала среднеэффективной дозы продемонстрируем на следующем примере. Пусть по одному из известных методов (например, Литчфилда-Вилкоксона или Финни) по функции эффективности, имеющей нормальное распределение, вычислена среднеэффективная доза и ее доверительный интервал при γ = 0.90 (критерий двухсторонний), значение которого составило 10.0 (8.04-

12.0) мг/кг.

Это значит, что если распределение нормальное, то все значения среднеэффективной дозы с надежностью 0.9, находятся внутри указанного доверительного интервала. При использовании одностороннего критерия можно утверждать, что после воздействия лекарственного препарата в дозе 8.0 мг/кг результативный признак (эффект) проявится у половины тест-объектов не менее, чем в 5% случаев, при дозе 10.0 мг/кг — не менее чем в 50% случаев, а при дозе 12.0 мг/кг — не менее чем в 95% случаев.

Например, если экспериментально в одинаковых условиях определить 100 величин ED50, то в 90% случаев найденные значения величин будут находиться внутри указанного доверительного интервала, а по 5% значений выйдут, соответственно, за его левую и правую границы.

Биологический смысл среднеэффективной дозы состоит в том, что при ее воздействии на однородную группу тест-объектов вероятность появления эффекта у половины выборки не превысит 50%. Следовательно, среднеэффективная доза не является с точки зрения математической статистики детерминированной величиной и биологически воспроизводится только в 50% случаев. Поэтому при разработке критериальных оценок, связанных с вопросами надежности результатов, целесообразно пользоваться значениями правых границ доверительных интервалов среднеэффективной дозы, гарантирующих выбранную вероятность воспроизведения эффектов в группах тест-объектов. В приведенном примере при воздействии дозы 12.0 мг/кг частота появления эффекта в группе не менее 50% ожидается не менее чем в 95% случаев. Статистически это означает, что если, например, на 100 однородных групп тестобъектов воздействовала одинаковая доза равная по абсолютной величине значению правой границы доверительного интервала (12.0 мг/кг), то проявление эффекта не менее чем у 50% тест-объектов следует ожидать не менее чем в 95 группах.

Таким образом, доверительный интервал с заданной степенью надежности накрывает истинное значение параметра ED50.

Рассмотрим понятие толерантного интервала функции эффективности. Пусть F(x) — общая функция распределения независимых случайных величин Х1, Х2, ... , Хп. Рассмотрим интервал (Т1, Т2) с границами

Т1=Т1(Х1, Х2, … ,Хп) и Т2=Т2(Х1, Х2, … , Хп), зависящими от результатов наблюдений. Интервал (Т1, Т2) будет называться толерантным интерва-

лом, если он с заданной надежностью γ содержит, по крайней мере, долю Р (0 < Р < 1) распределения F(x), т.е.

(1.5)

Толерантный интервал имеет важное значение для расчета категорий эффективных доз по функции эффективности при ее нормальном распределении. Любая категория эффективной дозы отсекает слева на графике нормальной функции эффективности интервал от –∞ до значения этой дозы, отражающий соответствующую долю вероятности появления эффекта в выборке с заданной степенью надежности γ. Так, на рис. 1.3 показан график функции эффективности и толерантный интервал для категории эффективной дозы ED84 (заштрихованный участок).

Биологический смысл толерантного интервала состоит в том, что при воздействии на группу тест-объектов дозы вещества равной по значению ED84> доля тест-объектов, у которых проявился учитываемый признак, составит не менее 84%. Если учесть, что при вычислении данного интервала из формулы (1.5) значение функции нормального распределения при Ti= –∞ равно нулю, то значение любой категории эффективной дозы EDx, соответствующее значению Т2, можно вычислить по формуле:

(1.6)

где число k необходимо найти, причем такое, чтобы была обеспечена заданная надежность γ.

Н.В. Смирнов и И.В. Дунин-Барковский (1969) предлагают находить число k следующим образом:

(1.7)

где Zγ — квантиль порядка у стандартного нормального распределения. Но, так как для нахождения значений категорий эффективных доз используется интервал, ограниченный только с одной стороны, то обоснованным будет использование одностороннего критерия. Поэтому, вычисление значений к в данном случае следует проводить по формуле:

(1.8)

в которой значение Z1-р/2 заменено на Z1-р. Так, если n=100,

Р=0.957, γ = 0.99, то Z1-р = Z0/05 = 1.64, Zγ=2.33.

Тогда k = 1.966, LD95 = LD50 + 1.966SLD50. Биологически это означает, что при воздействии на тест-объекты дозы вещества, вызывающей

летальные эффекты, доля летальных исходов в группах тест-объекта составит не менее 95% в 99 случаях из 100.

Если n=100, Р=0.05> γ=0.99, то

Z1-р= Z0,95= –1.64, Zγ=2.33.

Тогда k = -1.966, LD5 = LD50 – 1.966SLD50. Это означает, что при воздействии на тест-объекты дозы вещества, вызывающей летальные эф-

фекты (LD5), доля летальных исходов в группах тест-объекта составит не менее 5% в 99 случаях из 100.

Таким образом, толерантный интервал отражает долю Р (0 < Р < 1) функции распределения F(x). Для нормальной функции эффективности правая граница толерантного интервала представляет собой определенную категорию эффективной дозы (EDb ED5, ED)6, ED50, ED84 и т.д.), которую можно вычислить по известной функции эффективности с заданной надежностью у. Любая категория эффективной дозы имеет собственный доверительный интервал, который определяет вероятность ее нахождения внутри границ этого интервала. Отметим, что толерантный интервал часто используется для определения вероятностных границ биологической нормы (Курляндский Б.А., Духовная А.И., 1977; Ковязин В.Г., 1978; Коршун М.Н., Кравченко А.Д., 1978; Ковалев А.Ф., 1993

идр.)

Кнастоящему времени многими авторами установлено, что функция эффективности часто не может быть аппроксимирована нормальным распределением по причине асимметрии ее левой и правой ветвей. Это обусловлено сложностью механизмов развития и проявления результативного признака (эффекта). Поэтому было предложено аппроксимировать функцию эффективности логарифмически нормальным распределением после логарифмического преобразования доз.

Функция эффективности может аппроксимироваться и другими из-