4 курс / Общая токсикология (доп.) / salnikova_e_v_i_dr_toksikologicheskaya_himiya

Количественное определение барбитуратов, изолированных из биологического материала, проводят методом спектрофотометрии.

Барбитураты обладают специфической абсорбцией в ультрафиолетовой области спектра, при pH 10 и 13 и отсутствии таковой при pH 2. Максимум поглощения – 240 нм (при pH 10), 260нм (при pH 13) (рисунок 5.12).

Предварительно необходимо определить наличие определенного барбитурата методом ТСХ. Приготовление стандартного раствора барбитуратов.

Точную навеску барбитурата (50 мг) помещают в мерную колбу на

1000 мл и растворяют ее в 100 мл фосфатного буфера (pH 7,4) при осторожном перемешивании, затем объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой. Концентрация барбитурата составляет 50 мкг/мл.

Построение калибровочного графика. В ряд мерных колб на 50 мл вносят соответственно 2, 5, 10, 15, 20 мл стандартного раствора барбитурата и доводят до метки боратным буфером (pH 10,0). Измеряют оптическую плотность растворов при λ = 240 нм в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя

1 см. Раствором сравнения служит боратный буфер. По средним значениям из 3

определений строят калибровочный график.

Количественное определение барбитуратов, изолированных из биологического материала, проводят следующим образом. 5 мл хлороформного извлечения из кислого раствора помещают в делительную воронку и экстрагируют 3 порциями боратного буфера (15, 10 и 10 мл).

Объединенные водные извлечения собирают в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки боратным буфером. Измеряют оптическую плотность полученного раствора при λ = 240 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя

1 см по сравнению с боратным буфером.

По калибровочному графику находят содержание данного барбитурата и рассчитывают концентрацию его в исходном биологическом материале по формуле

m = C ∙ 50,

где m – масса барбитуратов в пробе, мкг;

202

С – содержание барбитуратов по калибровочному графику, мкг/мл.

Рисунок – 5.12 Спектры поглощения барбитуратов в зависимости от pH

раствора

По полученным данным, делают вывод о количественном содержании барбитуратов в пробе.

5.9 Лабораторная работа. Экспертное исследование плодовых тел

грибов, содержащих псилоцин и псилоцибин

Экспертное исследование плодовых тел грибов, содержащих псилоцин и псилоцибин является в настоящее время актуальной задачей в связи с широким распространением данного наркотического средства на территории Российской Федерации [31, 32].

Исследование методом качественных цветных реакций

В ходе исследования несколько мг высушенных измельченных грибов заливают метанолом в соотношении «проба (г) - экстрагент (мл)» 1:10,

помещают в ультразвуковую баню на 1 час. После отстаивания и охлаждения несколько капель полученного экстракта наносят на предметное стекло и

203

упаривают при 50 °С досуха. К полученному сухому остатку прибавляют

несколько капель:

-реактива Эрлиха, через 15 минут появляется серо-фиолетовое окрашивание;

-реактива Фреде, через 3 минуты наблюдается серо-коричневое окрашивание.

Исследование методом тонкослойной хроматографии

3 или 10 мкл полученного ранее экстракта наносят на хроматографическую пластину. Хроматографию проводят в системе растворителей: н-бутанол -

ледяная уксусная кислота - вода (2:1:1). После окончания хроматографирования пластину сушат при комнатной температуре до удаления растворителей, затем проявляют хроматографические зоны по гашению флуоресценции при 254 нм проявлением реактивами Эрлиха и Фреде.

Для хроматографирования использовали пластины с немодифицированным слоем силикагеля. Значения Rf на этих пластинах, а также окраска зон приведены в таблице 5.2.

Таблица 5.2 - Значения Rf исследуемых соединений в системе н-бутанол -

ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 2:1:1

204

6Пестициды

6.1Общая характеристика

Пестициды являются единственным загрязнителем, который сознательно вносится человеком в окружающую среду. Пестициды (ядохимикаты)

представляют собой химические препараты для защиты сельскохозяйственной продукции и кормов, для уничтожения паразитов у животных, для борьбы с переносчиками опасных заболеваний и т.п.

Применение пестицидов за последние 20 лет увеличилось в 2,5 раза, число различных пестицидов возросло и в настоящее время составляет более 1000

типов. В развитых странах применение пестицидов достигает до 2 кг на 1 га или около 1,5 кг на душу населения. Пестициды распространяются на большие пространства, весьма удалённые от мест их применения. Кроме того,

ядохимикаты легко мигрируют из почвы в растения и оказываются в овощах,

картофеле, фруктах, попадают через корма и воду в фауну. Даже в тканях белых медведей Заполярья обнаружены различные высокотоксичные пестициды.

Пестициды, которые могут отрицательно воздействовать на здоровье человека, можно разделить на следующие группы:

хлорсодержащие инсектициды;

органические эфиры фосфорной кислоты и карбаматы;

гербициды и фунгициды;

пестициды, используемые для борьбы с паразитами животных.

Свойственная человеку вера в сказку дает ему надежду на чудо, что яды убивают только “вредные” организмы, а для человека они безопасны.

Пестициды поступают в организм человека следующим образом:

Непосредственно с фруктами и овощами, если продукты не моются перед

едой.

В случае, если пестициды, применяемые для обработки сельскохозяйственных культур, смываются в водоемы, озера, реки и подземные

206

6.2 Химико-токсикологический анализ биологических объектов на

пестициды

Изолирование пестицидов из биологических материалов наиболее часто осуществляется экстракцией различными органическими растворителями:

пентан, н-гексан, гептан, петролейный эфир, эфир, хлороформ,

четыреххлористый углерод и др. Единого универсального метода изолирования пестицидов для различных объектов, так же как и общей схемы очистки полученных экстрактов, в настоящее время не существует.

Предложены общие схемы изолирования и очистки хлорорганических пестицидов при исследовании пищевых продуктов и при определении фосфорорганических пестицидов в биологических объектах, но они не получили широкого применения в химико-токсикологическом анализе.

Практически рекомендуются методы изолирования пестицидов для каждого объекта исследования (воздух, пищевые продукты растительного происхождения, почва, кровь, моча, мясо, сливочное масло и т. д. и т. п.) и

пестицида.

Методы очистки пестицидов, выделенных из биологических объектов,

также чрезвычайно разнообразны. Имеет место очистка перегонкой с водяным паром, экстракцией, кристаллизацией, окислением — восстановлением и т. п. В

настоящее время все шире и шире применяются в целях очистки и разделения хроматографические методы, в частности хроматография в тонких слоях и газовая хроматография.

Качественный анализ и количественное определение пестицидов не всегда проводятся по нативному веществу. В большинстве случаев органическое вещество, обладающее пестицидными свойствами, подвергается превращениям в другие, более простые вещества, которые и обнаруживаются или определяются химико-токсикологическим анализом.

208

Для определения пестицидов по нативному соединению наиболее широкое применение получили хроматографические и биохимические методы анализа [49].

Количество пестицидов органической природы очень велико. Особенно большое токсикологическое значение в настоящее время приобрели пестициды,

относящиеся к галогенопроизводным, фенолам, производным карбаминовой кислоты, простым и сложным эфирам фосфорной кислоты,

элементоорганическим соединениям [52].

6.3 Лабораторная работа. Обнаружение фосфорорганических пестицидов

Биологический материал в количестве 15 г измельчают, помещают в колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, заливают трехкратным количеством

(40 мл) смеси ацетона, этанола, воды (в соотношении 2:2:1), перемешивают,

подкисляют кристаллической щавелевой кислотой до рН 4,5 по универсальному индикатору (около 0,5 г щавелевой кислоты) и однократно настаивают при комнатной температуре 4 часа при периодическом взбалтывании через 15 или

20 минут или 2 часа при непрерывном перемешивании.

После настаивания надосадочную жидкость отфильтровывают через бумажный фильтр в фарфоровую чашку и упаривают на водяной бане вдвое.

Остаток переносят в делительную воронку, добавляют 15 мл хлороформа, 30 мл

25 % раствора хлорида натрия, содержимое воронки встряхивают 5 мин. После отстаивания хлороформный слой сливают в колбу емкостью 100 мл, а

оставшуюся в делительной воронке жидкость еще дважды экстрагируют,

добавляя по 10 мл хлороформа. Объединенные хлороформные извлечения обесцвечивают активированным углем и фильтруют через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия в сухую фарфоровую чашку, упаривают до объема

2 мл и исследуют.

На стартовую линию хроматографической пластинки наносят в виде точек исследуемое хлороформное извлечение и растворы метчиков в хлороформе

209

(о,о-диметил-о(2,2-дихлорвинил) фосфат (ДДВФ), хлорофоса, метафоса,

карбофоса). Пластинку хроматографируют в системе растворителей гексан:

ацетон (2:1). Условия хроматографирования и значения Rf (таблица 6.1). После подъема растворителя на 10 см пластинку вынимают из камеры, высушивают при комнатной температуре до полного испарения растворителей и ФОС проявляют соответствующими реактивами [53].

Проявление серосодержащих ФОС (карбофос, метафос).

I способ. Пластинку опрыскивают 0,5 % раствором хлорида палладия в 1 %

растворе хлористоводородной кислоты. Карбофос проявляется без нагревания в виде пятен желтого цвета. При нагревании пластинки в течение 10 минут в сушильном шкафу при 100 °С появляется коричневато-желтое пятно метафоса.

II способ. Пластинку обрабатывают раствором бромфенолового синего,

содержащим нитрат серебра. Появляются лиловые (сиреневые) пятна на синем фоне. Затем пластинку нагревают 20 минут в термостате при 60 °С и после охлаждения для обесцвечивания фона опрыскивают 10 % раствором уксусной кислоты. Карбофос и метафос проявляются в виде пятен лилового цвета.

Проявление метафоса. Пластинку обрабатывают 5 % спиртовым раствором гидроксида натрия, нагревают 10 минут в термостате при 100 °С. Появляются пятна лимонно-желтого цвета.

Проявление дихлофоса и хлорофоса.

I способ. Пластинку обрабатывают 1 % раствором резорцина в 5 %

растворе гидроксида натрия. Через 2 мин проявляется ДДВФ в виде пятна красно-розового цвета (оранжевого). Затем пластинку нагревают 5 мин в сушильном шкафу при 100 °С. При этом проявляется хлорофос в виде пятна красно-розового цвета (оранжевого).

II способ. Пластинку опрыскивают 1 % раствором о-толидина в ацетоне и облучают УФ-светом. Через 2–5 мин дихлофос и хлорофос проявляются в виде пятен голубовато-синего цвета.

210