6 курс / Судебная медицина / Судебно_медицинская_экспертиза_отравлений_антихолинэстеразными_веществами

использованием специфических ингибиторов холинэстеразы дают полное право считать, что метод Келле явля­ ется строго специфичным способом определения локали­ зации холинэстеразы.

Для гистохимического исследования активности холин­

Ра с т в о р Б: 2,5 г кристаллический сернокислой меди; 100 мл дистиллированной воды.

Ра с т в о р В: 7,5 мг ацетилтиохолиниодида; 0,4 мл дистиллиро­ ванной воды; 0,1 мл раствора Б.

Образующийся при этом осадок йодистой меди отделяется при центрифугировании.

П р о п и с и и н к у б а ц и о н н о й с м е с и с а ц е т и л т и о - х о л и н и о д и д о м :

0,2 мл раствора А;

0,1 мл раствора Б;

4,3 мл дистиллированной воды.

Смесь выдерживается несколько минут в термостате при темпе­ ратуре 37°, прибавляется фильтрат раствора В и затем фильтруется.

П р о п и с и и н к у б а ц и о н н о й с м е с и с б у т и р и л т и о - х о л и н б р о м и д о м :

6 мг бутирилтиохолинбромида;

0,2 мл раствора А;

0,1 мл раствора Б;

4,7 мл дистиллированной воды. Раствор подвергается фильтрованию.

Растворы ацетилтиохолиниодида, бутирилтиохолинбромида и раствор В готовятся перед их употреблением на бидистиллированной воде.

Мышей забивали декапитацией. Вырезали кусочки исследуемой ткани небольших размеров (до 1 X 1 см при толщине до 0,5 см) и тотчас же на замораживающем ми­ кротоме приготовляли срезы толщиной до 40—60 \i (для мышечной ткани) или до 10—20 ц. (для головного моз­ га). Б. Ромейс (1953), справедливо отмечая, что обыч­ ным замораживающим микротомом получить хорошие срезы из свежих нефиксированных препаратов удается

лишь с трудом, рекомендует употреблять нож глубокого охлаждения. Мы достигали глубокого охлаждения ножа, насаживая на него охлаждающую коробку с сухим льдом. Можно пользоваться микротомом на полупро­ водниках.

Срезы с ножа непосредственно переносятся в инку­ бационную смесь с ацетилтиохолиниодидом (для опреде­ ления истинной холинэстеразы) или в инкубационную смесь с бутирилтиохолинбромидом (для определения ложной холинэстеразы). Контрольные срезы перед погру­ жением в растворы субстратов предварительно помеща­ ют на 30 минут в раствор прозерина (1-10~3), что приводит к полной инактивации фермента, так как прозерин является сильнейшим ингибитором холин­ эстеразы.

Далее срезы помещают в термостат при температуре 37° для инкубации холинэстеразы. Время инкубации оп­ ределяется в зависимости от степени активности фермен­ та (мы варьировали от 20 минут до 2—3 часов). В тех случаях, когда необходимо было провести сравнительную оценку степени активности фермента, период инкубации был строго одинаков. Практически можно проводить ин­ кубацию в течение 1 часа — время, достаточное для хо­ рошего выявления фермента.

После инкубации срезы хорошо ополаскивают в 2— 3 порциях бидистиллированной воды (для освобождения их от остатков субстрата) и наклеивают на предметные стекла, после чего обрабатывают 10% раствором серни­ стого натрия в течение 1 минуты. Далее срезы тщательно промывают в нескольких порциях бидистиллированной воды (для освобождения от раствора сернистого натрия во избежание артефакта), обезвоживают спиртами вос­ ходящей крепости (50°, 70°, 85°, 96°, абсолютный спирт и спирт-эфир), просветляют карбол-ксилолом и 3 пор­ циями ксилола и заключают в канадский бальзам.

Приготовленные по описанному методу препараты дают возможность наблюдать локализацию холинэстера­ зы лишь в поверхностных слоях ткани. Для увеличения проницаемости клеточных оболочек мы воспользовались способом, предложенным В. В. Португаловым и В. А. Яковлевым (1951, 1953): кусочки исследуемой тка­ ни предварительно выдерживают в ацетоне в течение 3—24 часов при температуре около —60° (в сосуде Дюа-

50

pa с сухим льдом), затем тщательно отмывают от аце­ тона. Далее приготовляют срезы, которые подвергают последующей обработке, как было описано выше.

Темно-коричневые участки соответствуют местам ло­ кализации истинной холинэстеразы, причем интенсив­ ность окраски пропорциональна активности фермента. При обработке бутирилтиохолинбромидом ткань окра­ шивается диффузно в бледно-желтый цвет. Это говорит о том, что ложная холинэстераза распределяется в тка­ нях также диффузно.

Бутирилтиохолинбромид выявляет локализацию толь­ ко ложной холинэстеразы. Поэтому, если он сплошь ок­ рашивает всю ткань в бледно-желтый цвет, не оставляя неокрашенных участков, соответствующих локализации истинной холинэстеразы, то из этого вытекает, что в ме­ стах локализации истинной холинэстеразы имеется и ложный фермент (Я- С. Смусин, 1957).

Локализация истинной холинэстеразы в поперечнопо­ лосатой мускулатуре соответствует распределению шванновских элементов, сопровождающих аксон в зоне орган­ ного синапса, т. е. в моторной бляшке (рис. 9). Сарко­ плазма мышечного волокна в участках, непосредственно прилегающих к моторной бляшке, имеет очень слабую окраску. Места же контакта нерва с мышцей уже при малом увеличении микроскопа легко обнаруживаются по интенсивной окраске (рис. 10, 11). Большое увеличе­ ние микроскопа (рис. 12) дает возможность выявить ряд деталей (в особенности в тех препаратах, где кусочки были предварительно обработаны ацетоном): видны да­ же нервные окончания, доходящие до мышечных воло­ кон (рис. 13). На поперечных срезах (рис. 14, 15) мышеч­ ного волокна также видно, что вещество моторной бляш­ ки, плотно прилегая к мышечному волокну, оказывается отделенным от него тончайшей мембраной, что соответ­ ствует данным В. В. Португалова (1955) и данным уль­ траструктурных электронномикроскопических исследова­ ний (Э. М. Плисецкая, 1961).

Помимо моторных бляшек, истинная холинэстераза содержится также в ядрах мышечных волокон. Предва­ рительная обработка срезов прозерином полностью угне­ тает активность истинной холинэстеразы (рис. 16).

В мышечной ткани ложная холинэстераза распреде­ ляется диффузно.