5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / Культуральные_методы_диагностики_туберкулеза

жижения, деконтаминации и концентрации. Наилучшие результаты обеспечивает обработка 2–3% раствором NaOH с NALC, которую рекомендуется проводить в ламинарном шкафу с соблюдением стерильности по следующей схеме:

к образцу (примерно 5 мл), который находится в пластиковой градуированной пробирке на 50 мл, добавить равный объем NALC-NaOH или препарата

MycoPrep;

плотно закрыв крышку, смешать содержимое пробирки встряхиванием или с помощью вортекса, стремясь достигнуть полного разжижения, и оставить на 15 минут при комнатной температуре для деконтаминации;

добавить фосфатный буфер до отметки «50 мл» и смешать встряхиванием (после добавления фосфатного буфера рН исследуемого материала соответствует 6,8);

центрифугировать образец в течение 15–20 минут при 3000 g;

удалить надосадочную жидкость;

добавить к осадку 0,5–2,0 мл новой порции фосфатного буфера, затем его ресуспендировать и использовать для инокуляции в пробирку MGIT.

2.1.2. Посев диагностического материала в пробирки MGIT

ИнокуляцияосадкаобработанногоматериалавиндикаторныепробиркиMGITпроводится с помощью стерильной пипетки или одноразового шприца с иголкой (что не рекомендуется из-за возможности случайного укола) в условиях стерильности:

снять откручивающуюся крышку с пробирки MGIT;

добавить содержимое флакона с обогатительной добавкой OADC (15 мл) во флакон с лиофилизированными антибиотиками PANTA;

перенести 0,8 мл смеси PANTA /OADC в пробирку MGIT;

внести 0,5 мл осадка диагностического материала в пробирку MGIT и параллельно произвести посев 0,2–0,5 мл материала на плотную среду Левенштейна– Йенсена или Финна-II;

убедившись, что пробка пробирки плотно закручена, произвести загрузку пробирки в прибор ВАСТЕС 960 в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Особые замечания

Если следовать данному протоколу, то одного флакона смеси PANTA/OADC бу­ дет достаточно для обогащения 18 пробирок MGIT, а одного дополнительного на­ бора (6 флаконов) – для обогащения 108 пробирок, что немного больше, чем содер­ жится в одной упаковке (в коробке 100 пробирок MGIT). Таким образом, при офор­ млении заказа на каждую фирменную упаковку пробирок необходимо выписать 1 обогатительный набор.

При высоком содержании микроорганизмов-контаминантов в исследуемом мате­ риале концентрацию противомикробных препаратов можно несколько увеличить, для этого лиофилизированную смесь PANTA следует развести в 10,0 мл раствора

OADC.

2.1.3. Инкубация пробирок в системе

1.Открыть один из ящиков прибора ВАСТЕС MGIT 960 и нажать появившуюся на экране кнопку «tube enter» («Загрузка пробирки»). При этом загорается лампа сканера для считывания штрих-кода с пробирки.

200 Культуральные методы диагностики туберкулеза

2.Считать сканером штрих-код пробирки с инокулятом и установить ее в гнездо, рекомендуемое прибором.

3.Следует ежедневно проверять показания прибора на предмет появления положительных и отрицательных результатов.

4.О ПОЛОЖИТЕЛЬНОМ результате (рост микобактерий) свидетельствует красный сигнал положительного индикатора на соответствующем ящике и значок на дисплее прибора.

5.При появлении информации о положительном результате необходимо открыть указанный ящик, нажать появившуюся на экране кнопку «positive», извлечь соответствующую пробирку из гнезда (вместо красной индикации, указывавшей непосредственно на место «положительной» пробирки, появляется зеленая, указывающая на освободившееся гнездо) и отсканировать штрих-код.

6.Пробирки, рост микобактерий в которых не зафиксирован прибором в течение 42 дней, оцениваются системой как отрицательные. Об ОТРИЦАТЕЛЬНОМ результате (отсутствие роста микобактерий) свидетельствует зеленый сигнал отрицательного индикатора на соответствующем ящике и значок на дисплее прибора.

7.При появлении информации об отрицательном результате необходимо открыть указанный ящик, нажать появившуюся на экране кнопку «negative», извлечь указанную пробирку из гнезда и просканировать ее штрих-код.

2.1.4. Оценка результатов культивирования на автоматизированной системе

Положительный результат, свидетельствующий о росте культуры в индикаторной пробирке, регистрируется с 4-го дня после инокуляции, положительный сигнал в 1–3-е сутки может быть расценен как микробная контаминация образца. Для подтверждения роста микобактерий, а также идентификации МБТ в позитивной пробирке проводятся следующие процедуры.

Удалив позитивную или негативную пробирку из прибора, следует визуально оценить прозрачность бульонной среды для определения возможного роста микобактерий. Обычно рост культуры МБТ проявляется в виде характерных придонно расположенных хлопьев, которые при незначительном встряхивании поднимаются и распространяются по всей среде, при этом жидкая среда сохраняет прозрачность. Помутнение среды в позитивной пробирке свидетельствует о возможной контаминации посторонней флорой.

Приготовить мазок по методу Циля–Нильсена для выявления кислотоустойчивых микобактерий.

Произвести субкультивирование на плотной яичной среде для подтверждения роста типичных колоний микобактерий.

Произвести субкультивирование на среде Левенштейна–Йенсена, содержащей 1000 мкг/мл салицилата натрия или 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты, для дифференциации МБТ и нетуберкулезных микобактерий.

При необходимости, для того чтобы убедиться в отсутствии контаминации позитивной емкости посторонней микробной флорой, следует приготовить мазки с окраской по Граму и произвести пересев содержимого пробирки на чашку с кровяным агаром. Наличие роста на чашке в результате инкубации в течение 24 часов при 37 °С свидетельствует о микробной контаминации материала.

Для большего ускорения выдачи ответа в клинику возможно проведение идентификации культуры, выросшей в пробирке с использованием ПЦР-техноло- гии, например Hain-теста, который основан на амплификации генов 16S РНК микобактерий с последующей гибридизацией со специфическими зондами.

2.1.5. Порядок выдачи заключения

Положительный результат, свидетельствующий о получении культуры МБТ, выдается на 5–41-й день при следующих условиях:

положительный сигнал прибора + микроколонии в виде кос при бактериоскопии;

положительный сигнал прибора + кислотоустойчивые бактерии при бактерио­ скопии + характерный рост колоний на плотной среде + отсутствие роста на среде Левенштейна–Йенсена, содержащей 1000 мкг/мл салицилата натрия;

положительный сигнал прибора + отсутствие кислотоустойчивых бактерий и микроколоний контаминирующей микрофлоры при бактериоскопии + характерный рост колоний на плотной среде + отсутствие роста на среде Левенштей- на–Йенсена, содержащей 1000 мкг/мл салицилата натрия;

положительный сигнал прибора + кислотоустойчивые бактерии и микроколонии контаминирующей микрофлоры при бактериоскопии + характерный рост колоний микобактерий на плотной среде (при отсутствии контаминации в контрольном мазке с данной плотной среды) + отсутствие роста на среде Левенш- тейна–Йенсена, содержащей 1000 мкг/мл салицилата натрия;

положительный сигнал прибора + кислотоустойчивые бактерии или отсутствие кислотоустойчивых бактерий и микроколоний контаминирующей микрофлоры при бактериоскопии + положительный результат ПЦР с праймерами для МБТ из положительной процессорной емкости.

Гарантированный отрицательный результат роста МБТ на автоматизированных системах выдается на 42-й день после просмотра посева на плотной среде. При наличии признаков возможного роста МБТ на плотной среде (например, имеются хлопьевидные колонии в жидкой фазе над косяком) отрицательный ответ выдается по результатам роста микобактерий на плотной среде через 12 недель (84 дня).

2.1.6. Контроль качества

Контроль качества выполняется при получении каждой новой партии пробирок с использованием коллекционных штаммов микобактерий: M. tuberculosis ATCC 27294, M. kansasii ATCC 12478 и M. fortuitum ATCC 6841. Контроль качества возможно проводить с помощью других лабораторных штаммов. В частности, штамм M. tuberculosis Н37Rv (при посеве в пробирку MGIT 0,5 мл микробной взвеси, приготовленной по 0,5 стандарту McFarland и разведенной 1:100) дает рост, подтвержденный положительным сигналом ВАСТЕС 960, на 7–9-й день после внесения в прибор.

2.1.7. Контаминация при использовании системы MGIT и ее предупреждение

Приемлемым для обогащенной жидкой среды считается уровень контаминации, достигающий 5–8% от общего числа посевов. При повышении уровня контаминации более 10% необходимо срочное выявление ее причин и принятие мер по их устранению.

202 Культуральные методы диагностики туберкулеза

При получении положительного результата прибора ВАСТЕС 960 (с 4-го по 42-й день) необходимо убедиться, что в жидкой среде положительной пробирки не содержится контаминирующих микроорганизмов. Если в результате микроскопии по Ц-Н обнаружены микобактерии, а при посеве на кровяной агар контаминация материала в пробирке подтверждена, то при необходимости возможно произвести повторную деконтаминацию и попытаться выделить чистую культуру микобактерий. С этой целью:

перенести все контаминированное содержимое из позитивной пробирки MGIT в стерильную пробирку на 50,0 мл;

добавить равный объем стерильного 4% раствора NaOH и провести обработку по методу Petroff или 3% раствором серной кислоты;

произвести посев на плотную яичную среду.

В качестве мер борьбы с контаминацией посевов, осуществляемых с помощью автоматизированных систем, могут быть рекомендованы следующие мероприятия:

увеличение концентрации щелочи при первичной обработке материала (не более чем до 1,5% после соединения с образцом);

увеличение времени обработки мокроты раствором NALC-NaOH до 25 минут;

увеличение концентрации PANTA, что достигается путем уменьшения количества жидкой добавки OADC, которую используют для растворения лиофилизированной PANTA (более концентрированный раствор PANTA можно получить при растворении PANTA 10 мл (вместо 15 мл) OADC, при этом перед инокуляцией в пробирку МGIT добавляют обычный объем – 0,8 мл раствора PANTA/ OADC).

Изменения параметров обработки мокроты рекомендуется производить в указанном порядке. Следует помнить, что при избыточном увеличении концентрации PANTA может наблюдаться подавление роста некоторых видов микобактерий (но не M. tuberculosis). Не следует изменять сразу несколько параметров одновременно.

Если контаминация одним и тем же видом (видами) микроорганизмов наблюдается часто, то ее причина, скорее всего, кроется в недостаточной чистоте реактивов или отсутствии стерильности реагентов и посуды.

Общим правилом является аликвотирование растворов небольшими объемами. Каждый раз используется, таким образом, свежий раствор, оставшийся объем раствора не сохраняется.

Важным фактором борьбы с контаминацией является сокращение времени хранения мокроты, чем предупреждается ее заселение посторонней флорой. При необходимости хранить мокроту следует в холодильнике при 4°С.

В процессе деконтаминации мокроты раствором NALC-NaOH важно несколько раз перевернуть пробирку, чтобы действию раствора подверглись все участки внутренней стенки пробирки, особенно в ее верхней части.

2.2. Определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с помощью системы ВАСТЕС MGIT 960

Система ВАСТЕС MGIT 960 AST позволяет определять ЛЧ микобактерий к низким и высоким концентрациям препаратов, аналогично методикам исследования на плотных средах. Набор из индикаторных пробирок контроля роста (без препарата) и содержащих противотуберкулезный препарат размещается на специальном носи-

теле со штрих-кодом, благодаря которому прибор осуществляет непрерывный мониторинг внесенной в пробирку культуры. Результаты интерпретируются автоматически, исходя из учета размножения микобактерий в пробирке без препарата, т. е. в момент позитивности контроля роста, на 4–13-й день после инокуляции культуры.

Набор MGIT 960 SIRE Kit включает 4 флакона с основными противотуберкулезными препаратами и 8 флаконов с обогащающей жидкостью. Критические (низкие) концентрации препаратов достигаются в питательном бульоне после разведения. Для этого в каждый флакон с лиофилизированным препаратом добавляют 4 мл стерильной дистиллированной или деионизированной воды, а затем 100 мкл переносят из него в пробирку MGIT с бульоном. Другие наборы дают возможность проводить тестирование в присутствии высоких концентраций противотуберкулезных препаратов. Для получения высокой концентрации лекарства, в соответствии с инструкцией, в каждый флакон, содержащий лиофилизированный препарат, необходимо добавить 2 мл стерильной дистиллированной или деионизированной воды.

Для определения чувствительности микобактерий к пиразинамиду в качестве контроля используют специальные пробирки MGIT с рН = 5,9. В набор BACTEC MGIT 960 PZA входят 2 флакона с лиофилизированным пиразинамидом и 6 флаконов питательной добавки. Перед использованием во флакон BACTEC MGIT 960 PZA, содержащий лиофилизированный препарат, следует добавить 2,5 мл дистиллированной/ деионизированной воды, чтобы получить раствор, содержащий 8000 мкг/мл PZA. Затем 100 мкл полученного раствора переносят в пробирку MGIT (рН =5,9) для достижения критической концентрации PZA в бульоне. Длительность тестирования составляет 4–20 дней.

Ниже приводятся финальные концентрации противотуберкулезных препаратов первого ряда, чувствительность к которым может определяться с помощью прибора ВАСТЕС 960.

Т а б л и ц а 1

Конечные концентрации противотуберкулезных препаратов (мкг/мл)

в наборах BACTEC MGIT 960 AST

2.2.1. Приготовление микобактериальной взвеси из изолята с плотной среды

Для этой процедуры могут быть использованы стерильные одноразовые пробирки со стеклянными бусами и завинчивающейся крышкой, разводить культуру следует бульоном 7Н9:

приготовить взвесь, соответствующую по мутности стандарту 1,0 McFarland;

встряхивать пробирку в течение 2–3 мин, чтобы разбить крупные частицы, затем дать отстояться содержимому в течение 20 мин;

204 Культуральные методы диагностики туберкулеза

осторожно, без взбалтывания, перенести супернатант в чистую пробирку и оставить на 15 мин для дальнейшего осаждения крупных частиц;

перенести супернатант в третью стерильную пробирку и довести добавлением бульона до мутности, соответствующей стандарту 0,5 McFarland;

развести 1 мл полученной взвеси в 4 мл физраствора (1:5), получив, таким образом, исходную взвесь тестируемой культуры, и использовать ее для инокуляции в индикаторные пробирки.

2.2.2. Приготовление микобактериальной взвеси из позитивной пробирки MGIT

Позитивные пробирки могут быть использованы для этой процедуры в течение 5 дней после разгрузки прибора, после этого срока материал необходимо субкультивировать на новой пробирке MGIT. В первый и второй день положительная бульонная культура используется для определения ЛЧ без предварительного разведения, на третий, четвертый и пятый дни позитивности необходимо развести 1 мл бульонной культуры в 4 мл физраствора (1:5).

2.2.3. Процедура инокуляции для определения ЛЧ с использованием набора ВАСТЕС

MGIT 960 AST SIRE Kit

Процедура включает следующие операции:

подписать для каждой тестируемой культуры 5 пробирок MGIT, расположенных на одном носителе с пятью гнездами; первая пробирка слева должна быть предназначена для контроля роста, а последующие – для внесения стрептомицина, изониазида, рифампицина и этамбутола соответственно;

добавить в каждую пробирку по 0,8 мл питательной добавки MGIT AST supplement;

добавить 100 мкл ранее приготовленного во флаконах раствора каждого из препаратов в соответствующую пробирку;

внести 0,5 мл исходной взвеси микробной культуры, предварительно разведен­ ной 1:100, в пробирку для контроля роста (без препарата);

внести 0,5 мл исходной взвеси микробной культуры в каждую пробирку, содержащую противотуберкулезный препарат;

плотно закрыть крышки пробирок и перемешать содержимое переворачиванием каждой пробирки по нескольку раз;

поместить в прибор ВАСТЕС 960 пять пробирок на носителе со штрих-кодом в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

2.2.4. Процедура инокуляции для определения чувствительности к PZA с использованием набора ВАСТЕС MGIT 960 PZA

Процедура имеет некоторые особенности:

подписать для каждой тестируемой культуры 2 пробирки MGIT (рН=5,9), расположенных на одном носителе с двумя гнездами; первая пробирка слева должна быть предназначена для контроля роста, а вторая – для внесения пиразинамида;

добавить в каждую пробирку по 0,8 мл питательной добавки MGIT PZA supplement;

добавить 100 мкл ранее приготовленного во флаконе раствора пиразинамида во вторую пробирку;

внести 0,5 мл исходной взвеси микробной культуры, предварительно разведен­ ной 1:10, в пробирку для контроля роста (без препарата);

внести 0,5 мл исходной взвеси микробной культуры в пробирку, содержащую пиразинамид;

плотно закрыть крышки пробирок и перемешать содержимое переворачиванием каждой пробирки по нескольку раз;

поместить в прибор ВАСТЕС 960 две пробирки на носителе со штрих-кодом в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Особые замечания

При внесении в ВАСТЕС 960 комплекта пробирок на носителе необходимо убе­ диться, что пробирка для контроля роста (без препарата) находится в крайней левой позиции. Убедившись в том, что пробирки установлены на держателе в нуж­ ном порядке и крышки пробирок плотно закрыты, их следует поместить в ящик ВАСТЕС MGIT 960 в гнезда, указанные прибором.

Перед загрузкой следует выбрать соответствующую конфигурацию для пяти SIRE-пробирок или двух PZA-пробирок.

2.2.5. Учет результатов

Система MGIT проводит автоматический мониторинг роста микобактерий и сообщает о завершении теста при накоплении определенного количества микроорганизмов в контрольной пробирке. При получении такого сообщения все пробирки, в которые был посеян данный материал, могут быть извлечены из прибора и отсканированы для получения окончательного результата исследования.

Учет результатов тестирования производится автоматически с 4-го по 13-й день для SIRE-комплекта из пяти пробирок или с 4-го по 20-й день для PZA-комплекта из двух пробирок, данные выдаются в распечатке после выгрузки пробирок из прибора. Результаты определения ЛЧ культуры МБ интерпретируются прибором путем сравнения с контрольной пробиркой, в которую микробную взвесь инокулировали в разведении 1:100 для SIRE-комплекта или в разведении 1:10 для PZA-комплекта. В отчете, помимо порядкового номера носителя и позиции пробирок, указывается дата постановки теста, длительность исследования, массивность роста изолята, оцененная в единицах роста GU (Growth Unit), а также названия и концентрации препаратов. Как только размер популяции в контрольной пробирке достигает 400 GU, прибор оценивает рост микроорганизмов в пробирках с препаратами и затем определяет их статус: R (Resistant) – устойчивый, S (Susceptible) – чувствительный, Х (Invalid) –

недействительный, C (Сontrol) – контроль роста.

2.2.6. Внутрилабораторный контроль качества

Контроль качества при работе на автоматизированной системе ВАСТЕС 960 осуществляется с каждой новой партией наборов для определения ЛЧ. С этой целью проводится постановка теста с использованием лекарственно-чувствительного (Н37Rv) и устойчивого к изониазиду штаммов микобактерий туберкулеза АТСС или из кол-

206 Культуральные методы диагностики туберкулеза

лекции Федерального центра контроля качества, а также заведомо чувствительного и изониазидорезистентного изолятов МБТ, выделенных от больных туберкулезом.

2.2.7. Порядок определения лекарственной чувствительности МБТ

Определение ЛЧ выполняется с использованием изолята микобактерий с плотной среды Левенштейна–Йенсена или Финна-II. Исследование проводят в два этапа.

1.Определение чувствительности выделенных культур микобактерий к препаратам первого ряда, включая пиразинамид, с помощью автоматизированной системы ВАСТЕС 960.

2.При выявлении устойчивости МБТ к изониазиду или рифампицину тестирование штамма методом абсолютных концентраций на среде Л-Й с целью проверки его чувствительности к высоким концентрациям препаратов первого ряда и препаратам второго ряда (тиоамиды, макролидные и аминогликозидные антибиотики, фторхинолоны и др.).

Первый этап может быть заменен применением гетеродуплексного анализа для определения гена рифампицинорезистентности или Real-time PCR при непосредственном использовании бульонной культуры из положительной индикаторной пробирки MGIT автоматизированной системы.

Приложение 6

Стандарты мутности

1. Соотношение стандартов мутности МакФарланда и ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича

Соотношение единиц мутности и предполагаемого количества клеток микроорганизмов, взвешенных в 1 мл жидкости, представлено в таблице 1.

Т а б л и ц а 1

2.Приготовление стандарта мутности по МакФарланду в условиях лаборатории

Вкачестве стандарта мутности МакФарланда применяется взвесь слабораствори-

мой в воде соли сульфата бария. Для ее приготовления используют следующие растворы: BaCl2 × 2H2O – 1% раствор, H2SO4 – 1% раствор.

Для получения взвеси необходимой мутности смешивают растворы хлорида бария и серной кислоты в определенных пропорциях (таблица 2).

208 Культуральные методы диагностики туберкулеза