3 курс / Патологическая физиология / Основные_механизмы_повреждения_клеток

внутриклеточное содержание ионов Са2+ и Н+. Кальций является кофактором большинства внутриклеточных и мембранных (за исключением лизосомальных) ферментов (липаз, фосфолипаз, протеаз, эндонуклеаз). Поэтому при повреждении происходит избыточная активация ферментов и повреждение мембран клетки. Фосфолипазы А1 и А2 лизосом термостабильны и не активируются ионами кальция, однако их действие оптимально при низких рН (4,0 и 6,5). Поэтому при внутриклеточном ацидозе активируются фосфолипазы мембран лизосом, мембраны повреждаются, гидролазы выходят из лизосом в цитоплазму и обусловливают аутолиз клетки. Это происходит на стадии перехода обратимых изменений в необратимые или даже уже после гибели клетки. Нарушение метаболизма адениловых нуклеотидов и дефицит энергии, вызывая дефосфорилирование мембран, нарушают их структуру и облегчают взаимодействие фосфолипаз с фосфолипидами мембран. Нарушение биосинтеза фосфолипидов, интенсификация ПОЛ и преобладание процессов аккумуляции продуктов фосфолиполиза (СЖК) повреждают клеточные мембраны, изменяют качественный и количественный состав мембранных фосфолипидов, вызывают делипидизацию мембран, что резко нарушает физико-химические свойства липидного бислоя мембран и прямо повреждает функции липидзависимых белков (рецепторов, ферментов, вторичных мессенджеров).

3.4.3. Повреждение мембраны амфифильными соединениями и детергентами

По своей форме молекулы фосфолипидов похожи на сплющенный цилиндр, ¼ которого по длине приходится на гидрофильную полярную головку (холин, глицерин), а ¾ – на гидрофобные цепи жирных кислот. Продукты гидролиза фосфолипидов и триацилглицеринов (СЖК, их недоокисленные метаболиты, КоА и карнитинпроизводные) являются водо-

растворимыми амфифильными соединениями, которые тоже имеют в своей структуре гидрофильную (полярную функциональную группу типа СООН или ион небольшого размера) и гидрофобную (длинную неразветвленную углеводородную цепь) части. Однако форма их молекулы напоминает конус, поскольку размер их гидрофильной части в плоскости мембраны превышает размер гидрофобной части. Это объясняется окислением жирных кислот фосфолипидов при активации ПОЛ или отщеплением от фосфолипидов под действием фосфолипаз продуктов гидролиза, например, арахидоновой кислоты.

21

В низких концентрациях амфифильные соединения существуют в водных растворах как мономеры, которые способны встраиваться в гидрофобный слой мембраны, что ведет к стабилизации мембран, уменьшению их проницаемости, изменению функции мембранных липидзависимых белков. Мономеры (ацилкарнитин и лизофосфолипиды) обусловливают изгиб и разрыв мембран с удалением Са2+ из связи с фосфолипидами. В высокой концентрации амфифильные соединения оказывают повреждающее действие, формируя в водной среде сферические мицеллы (рис. 3),

Рис. 3. Образование мицелл при активации перекисного окисления липидов и фосфолиполиза.

которые внедряются в мембрану, выталкивая ионы Са2+, отдельные фосфолипиды и белки из мембраны. Повышается проницаемость мембраны, нарушаются функции белков (Na+/K+-АТФазы, Ca2+-АТФазы и АТФ/АДФтранслоказы). Несколько мицелл могут формировать пору, внутренняя часть которой образована гидрофильными головками. Повышается неселективная проницаемость ЦПМ и мембран органелл для электролитов и воды, утрачиваются барьерные свойства мембран.

Детергенты – это поверхностно активные вещества, амфифильные соединения, способные связываться с мембранным белком гидрофобными связями, одновременно взаимодействуя полярными группами с водой. Свойствами детергентов обладают додецилсульфат натрия, тритон Х-100, желчные кислоты и их соли, твин-20, твин-80, лизофосфолипиды, лецитин, соли жирных кислот, мочевина. Молекулы детергента разрыхляют мембрану, расщепляют комплексы между белками и липидами, разрывают связи между белками. При высокой концентрации детергентов они образуют смешанные мицеллы детергента с липидами и комплексы, включающие белки, липиды и детергенты, которые обладают высокой степе-

22

нью гидрофильности и вызывают повышение неселективной проницаемости мембран для ионов и воды.

К образованию каналов в мембране способны полиеновые антибиотики, грамицидин A, аламетицин, амфотерицин, моназомицин. Молекулы этих соединений могут встраиваться в мембрану и образовывать водные поры. Внешняя часть молекул в поре гидрофобна, а внутрь канала обращены хорошо поляризуемые группы. Длина молекулы позволяет пронизать мембрану насквозь. Находясь в мембране молекула грамицидина А сворачивается в спиралевидную структуру, стабилизированную гидрофобными связями, и формирует полый цилиндр длиной около 3 нм и диаметром поры около 0,5-0,8 нм. Одиночные каналы образуются при ассоциации двух мономеров и распадаются при диссоциации димера грамицидина. Аламетицин – пептидный антибиотик, способен образовывать водную пору переменного диаметра путем агрегации нескольких молекул. Амфотерицин В формирует такие каналы в клеточной мембране, через которые выходят внутриклеточные компоненты во внеклеточное пространство, например, адениловые нуклеотиды. Некоторые антибиотики повышают селективную проницаемость и обладают свойствами ионофоров. Молекула валиномицина представляет собой почти плоское кольцо, по диаметру соответствующее размерам не гидратированного K+. При связывании валиномицина с ионами калия образуются комплексы, способные перемещаться через липидно-белковые слои мембраны. Антибиотик грамицидин может переносить ионы калия и натрия. Иономицин образует комплекс с Ca2+ в соотношении 1:1 и обменивает их на Н+.

Холестерин входит в состав всех мембран эукариотических клеток животного происхождения кроме внутренней мембраны митохондрий. В ЦПМ холестерин регулирует жесткость липидного бислоя, изменяя относительное количество молекул фосфолипидов. Холестерин специфически взаимодействует с мембранными и цитоплазматическими белками: регулирует активность ионных каналов, рецепторов, основных сигнальных каскадов клетки (взаимодействие нескольких мембранных белков, передачу сигналов в клеточное ядро). При недостатке или избытке холестерина функции этих белковых структур нарушаются.

3.4.4. Растяжение и микроскопические разрывы мембран при гипергидратации клеток и их органелл

23

Барьерная функция является одной из наиболее важных функций клеточных мембран, благодаря ей происходит разграничение содержимого цитоплазмы и внеклеточной жидкости, содержимого органелл и цитоплазмы. Одним из основных отличий живой клетки от неживой является неравновесное состояние живой клетки с окружающей средой. Как известно, содержание электролитов Na+, K+, Cl-, H+, Ca2+, Mg2+ во внеклеточной жидкости, цитоплазме и внутриклеточных органеллах в физиологических условиях существенно различается. В частности, в здоровых клетках содержание ионов Ca2+ и Na+ существенно меньше, а содержание ионов K+ и белков больше, чем во внеклеточной жидкости. На поверхности мембран возникает электрохимический градиент (диффузионный потенциал), происходит постоянная пассивная диффузия ионов по градиенту концентрации внутрь клетки и из неё, из цитоплазмы в органеллы и обратно в цитоплазму через мембранные поры и гидрофильные белковые каналы. Ионная асимметрия зависит от функционального состояния клетки. Например, повышение содержания ионов Ca2+ в цитоплазме мышечной клетки с 10-7 до 10-5 М вызывает сокращение, а снижение его до исходного уровня – расслабление мышцы. Ионной асимметрии во всех клетках организма способствуют особенности строения клеточных мембран. Гидрофобный слой липидов клеточных мембран характеризуется исходно низкой проницаемостью для водорастворимых веществ. В мембранах клетки функционируют системы ионных насосов – АТФ-зависимого транспорта против градиента концентрации с помощью транспортных ферментов (Na+/K+- АТФаза, Ca2+-АТФаза, H+-АТФаза и др.), Na+/Ca2+- и H+/Ca2+- ионообменных механизмов. Существуют липопротеиновые и другие комплексы, обладающие сродством к электролитам и выполняющие роль внутриклеточных депо.

При действии различных повреждающих факторов повышается неселективная проницаемость ЦПМ и внутриклеточных мембран для электролитов и воды, нарушаются системы пассивного и активного транспорта электролитов. Снижение активности Na+/K+-АТФазы приводит к увеличению внутриклеточного содержания ионов Na+ и утечке ионов K+. Стехиометрия Na+/K+-АТФазы в оптимальных условиях 3/2/1 (при гидролизе одной молекулы АТФ из клетки выводится три иона Na+ и поступает в клетку два иона K+). Уменьшение содержания калия в клетке ведет к уменьшению этого отношения до 1/1/1, снижается мембранный потенциал и увеличивается внутриклеточное содержание натрия. Гидратное число иона K+

24

равно 10,5, а иона Na+ – 16,6 молекул воды на ион, т.е. Na+ характеризуются большей гидрофильностью по сравнению с K+, поэтому увеличение внутриклеточного содержания Na+ приводит к гидратации клетки. Увеличение концентрации внутриклеточного Ca2+, связанное со снижением активности Са2+-АТФазы и Na+/Ca2+-ионообменного механизма, приводит к открытию высокоселективных Са2+-зависимых калиевых каналов и увеличению скорости утечки K+ из клетки, что сопровождается дальнейшим развитием гидратации клетки. Гипергидратация клетки может вызвать избыточное растяжение ЦПМ и внутриклеточных мембран с последующим их повреждением (осмотическая гибель клетки).

3.4.5. Повреждающее действие иммунных комплексов и макромолекул на клеточные мембраны

Комплементом называют систему самособирающихся сывороточных белков с каскадным ферментативным действием. Комплемент является частью иммунной системы и защищает организм от бактерий и других возбудителей болезни, В норме белки комплемента присутствуют в сыворотке, биологических секретах, тканевой жидкости в форме неактивных предшественников. Взаимодействие их с иммунными комплексами, эндотоксинами, липополисахаридами, микроорганизмами вызывает последовательную активацию этих белков – каскад протеолитических реакций и

Рис. 4. Формирование мембраноатакующего литического комплекса (по Я. Кольман,

К.–Г. Рём, 2011).

25

сборку компонентов. Механизм активации комплемента эволюционно запрограммирован и не зависит от причины и места активации – это типовой механизм повреждения клеточных мембран.

Активация системы комплемента приводит к формированию в ЦПМ поры (рис. 4) из компонентов комплемента (большой мембраноатакующий литический комплекс – C5b6789), через пору в клетку проникают ионы и вода, что вызывает осмотическую гибель клетки. Водорастворимые фраменты C3a и C5a вызывают дегрануляцию тучных клеток и освобождение гистамина; активацию и хемотаксис нейтрофилов и других эффекторных клеток; повышение проницаемости сосудистых стенок; развитие воспаления. Фрагменты C3b и C4b (опсонины) встраиваются в ЦПМ, усиливают фагоцитоз и экзоцитоз гранул нейтрофилов. Нарушение структуры мембраны способствует погружению высокомолекулярных иммунных комплексов вглубь клетки, необратимому повреждению ЦПМ и клетки.

3.5. Нарушение механизмов энергетического обеспечения клетки

Развитие энергодефицита характерно для любого повреждения клетки, поскольку нарушается гомеостаз, активность ферментов, целостность ЦПМ и мембран МХ и ЭР. Причем развитие дефицита энергии является важным фактором повреждения мембран: нарушается работа АТФзависимых ионных насосов, происходит дефосфорилирование мембранных белков и ослабление пластических процессов по замене поврежденных структурных компонентов мембран. Основой функциональной и структурной полноценности любой клетки является сохранность систем синтеза богатых энергией соединений в клетке, систем их транспорта к месту потребления и систем, обеспечивающих потребление энергии. Энергия необходима для биосинтеза основных компонентов клеток, для поддержания трансмембранного градиента концентраций ионов, для реализации двигательной и многих других функций клеток. Адениловые нуклеотиды (макроэргические соединения), из которых главная роль принадлежит АТФ, являются универсальными поставщиками энергии в клетках млекопитающих. В процессе гидролиза АТФ отдает фосфатную или пирофосфатную группу. При этом выделяется химическая энергия, трансформирующаяся в тепловую, механическую и другие виды энергии, необходимые для жизнедеятельности клетки. Другими источниками энергии могут быть АДФ, АМФ, креатинфосфат и другие фосфорилированные соединения. Энергия может быть депонирована в клетке и в виде субстратов

26

(глюкоза, гликоген, СЖК и др.). Все эти продукты способны трансформироваться в энергию АТФ. Дыхательная АТФ, образующаяся во внутренней мембране митохондрий путем окислительного фосфорилирования продуктов распада углеводов, жиров и белков, является наиболее эффективной формой аккумуляции энергии.

Однако путь дыхательного синтеза АТФ наиболее чувствителен к дефициту кислорода и прогрессивно снижается вплоть до прекращения при полной ишемии органов. Основными причинами нарушения процессов окислительного фосфорилирования помимо падения рО2 в ткани являются снижение уровня субстратов окисления, способности ткани к экстракции их из крови, рост восстановленности дыхательной цепи и увеличение соотношений НАДН/НАД и НАДФН/НАДФ, вторично развивающееся повреждение структуры мембран МХ и снижение активности их ферментов. На дефицит кислорода и АТФ клетка реагирует такими компенсаторными реакциями, как уменьшение потребления энергии и мобилизация энергии из внутриклеточных запасов. Ограничение потребления энергии осуществляется за счет уменьшения функциональной активности клетки, ограничения транспорта ионов и химических процессов синтеза. Мобилизация внутриклеточных запасов энергии осуществляется путем использования креатинфосфата, гликогена, глюкозы, триацилглицеринов. Активацию гликолиза можно рассматривать как один из механизмов компенсации. Усиление гликолиза обусловлено снятием ингибирующего влияния АТФ, активирующим воздействием продуктов распада АТФ, локальным выделением катехоламинов, образованием цАМФ, увеличением в цитоплазме ионов Са2+. Регулятором усиления гликолиза является снижение содержания креатинфосфата, вызывающее повышение содержания АДФ, АМФ и рост активности фосфофруктозы. Однако даже в период максимальной активности гликолиз удовлетворяет потребности основного обмена лишь на одну-две трети и приводит к накоплению молочной кислоты. Известно, что при полном окислении одной молекулы глюкозы образуется 38 молекул АТФ, а при гликолитическом расщеплении – всего лишь две молекулы АТФ (при гидролизе 1 моля АТФ выделяется 40 кДж энергии). Следовательно, этот механизм несовершенен и не способен устранить дефицит макроэргических соединений в клетках. Постепенное ослабление гликолиза связано со снижением активности полиферментных систем гликолиза (фосфофруктокиназы, фосфоглюкомутазы, гексокиназы), что обусловлено субстратным торможением конечными

27

продуктами распада, накоплением НАДН, НАДФН, ацидозом и истощением запасов субстратов гликолиза (глюкозы, гликогена). При снижении содержания АТФ до 1-2% от исходного уровня гликолиз полностью прекращается.

Падение внутриклеточного парциального напряжения О2 ниже критического уровня (примерно 1-2 мм Hg) ограничивает аэробные процессы образования энергии: окислительное образование ацетил-КоА из жирных кислот, пирувата и аминокислот; метаболизм ацетильных групп в цикле трикарбоновых кислот; транспорт электронов к О2, сопряженный с фосфорилированием. Прямым следствием этого является резкое снижение уровня АТФ, увеличение содержания АДФ, накопление в цитоплазме НАДН, так как при выключении дыхательной цепи возникает избыток НАДН внутри митохондрий, который тормозит работу челночных механизмов и цитоплазматический НАДН теряет возможность передавать Н+ в дыхательную цепь митохондрий. В цитоплазме НАДН может окисляться, восстанавливая пируват до лактата, именно этот процесс инициируется при недостатке О2. Следствием его является избыточное образование в тканях молочной кислоты. Не только гипоксия, но и любая другая причина, вызывающая подавление функции челночных механизмов, ведет к избыточной продукции молочной кислоты. Нарушение метаболизма углеводов, жиров и белков сопровождается накоплением недоокисленных продуктов, оказывающих повреждающее действие на мембраны:

–СЖК, ацилкарнитина и ацил-КоА, которые, внедряясь в липидный компонент мембран, повреждают мембраны и ферменты, в том числе участвующие в синтезе АТФ, транспорте АТФ от места продукции к эффекторным структурам клеток и утилизации энергии АТФ. Ацил-КоА подавляет транспорт адениннуклеотидов в МХ и активность ацил-КоА-синтетазы. СЖК ингибируют Na+/K+-АТФазу. Ацилкарнитин ингибирует Na+/K+- АТФазу и Са2+-АТФазу саркоплазматического ретикулума;

–токсичных средне- и низкомолекулярных продуктов деградации белков;

–продуктов катаболизма адениловых нуклеотидов (АДФ и АМФ), которые, связываясь с Fe2+, усиливают его прооксидантную роль и активируют ПОЛ. При повреждении ЦПМ эти соединения и ферменты вымываются из клетки, что затрудняет ресинтез АТФ и способствует дефициту энергии; - лактат, пируват, продукты гидролиза АТФ, СЖК и их производные, НАДН, НАДФН, ФАДН обусловливают внутриклеточный ацидоз. Накопление НАДН и НАДФН ведет к прекращению переноса электронов по ды-

28

хательной цепи МХ, снижая термостабильность и устойчивость мембран МХ к литическому действию фосфолипаз и протеаз и способствуя «утечке» электронов и образованию АФК.

Итак, основными причинами нарушения синтеза АТФ являются дефицит О2 и субстратов метаболизма, рост восстановленности дыхательной цепи и увеличение соотношений НАДH/НАД, НАДФH/НАДФ, нарушение структуры мембран МХ и снижение активности их ферментов, избыточная аккумуляция в МХ ионов Са2+, повреждение ЭР, истощение запасов кофакторов и субстратов гликолиза, снижение активности полиферментных систем гликолиза, снижение содержания АТФ до 1-2% от исходного уровня.

При повреждении клетки нарушение систем транспорта АТФ

часто опережает нарушение систем ее образования. Это вызывает разобщение мест синтеза и потребления АТФ и обусловливает возникновение необратимых повреждений клетки на фоне довольно высокого уровня АТФ. Транспорт дыхательной АТФ из МХ к местам ее использования осуществляется главным образом ферментом АТФ-АДФ-транслоказой и креатинкиназной ферментной системой, являющейся универсальной системой для клеток организма. АТФ-АДФ-транслоказа переносит АТФ в обмен на АДФ через внутреннюю мембрану МХ, на наружной поверхности которой АТФ вступает в реакцию с креатином, катализируемую изоферментом креатинкиназой. Образуется креатинфосфат, который путем диффузии через наружную мембрану митохондрий попадает в цитоплазму

ивблизи мест потребления вступает в реакцию с АДФ, вновь образуя АТФ

иосвобождая креатин, возвращающийся в МХ. Образование АТФ из креатинфосфата катализируется специфическими изоферментами, обеспечивающими строго направленный транспорт дыхательной АТФ и её дифференцированное потребление. Существует и цитоплазматическая креатинкиназа, которая регулирует активность гликолиза в условиях недостатка

О2 и обеспечивает направленный транспорт гликолитической АТФ к местам локализации Na+/K+-АТФазы в ЦПМ, Са2+-АТФазы в мембранах саркоплазматического ретикулума и АТФазы миозина в миофибриллах. Установлено, что при ишемии и гипоксии снижение содержания креатинфосфата происходит значительно раньше, чем АТФ. Это обусловлено быстрым расходованием креатинфосфата на образование АТФ и быстрым прекращением дальнейшего транспорта креатинфосфата из МХ к местам его потребления из-за низкой устойчивости АТФ-АДФ-транслоказы к де-

29

фициту О2. В миокарде снижение активности АТФ-АДФ-транслоказы на 80% наблюдается уже через 15 минут от начала ишемии. При повреждении клетки подавляется активность и ферментов креатинкиназной системы, они выходят через поврежденные мембраны МХ и ЦПМ во внеклеточную жидкость и кровь. Снижается и содержание креатина (повышенное потребление, нарушение или отсутствие доставки из крови, вымывание в кровь), исполняющего челночную роль в транспорте энергии. Существенным фактором снижения активности ферментов креатинкиназной системы является нарушение ее энергозависимой связи с мембраной.

Установлено прогрессирующее снижение активности АТФазы эффекторных структур поврежденной клетки. В частности, снижается активность АТФазы миозина – фермента, участвующего в обеспечении процесса сокращения миофибрилл за счет гидролиза АТФ. Даже то малое количество АТФ, которое имеется в кардиомиоцитах, не может утилизироваться полностью. Подавляется активность Na+/K+-АТФазы сарколеммы, АТФазы митохондрий, Mg2+-АТФазы и Ca2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума. При повреждении нарушается целостность ЦПМ и мембран органелл и связь их с ферментами, снижается активность процессов биосинтеза. Показано, что активность систем потребления энергии во время ишемии всегда снижается позже, а в постишемическом периоде восстанавливается быстрее, чем активность систем, продуцирующих АТФ. Это приводит к раннему снижению запаса депонированных адениловых нуклеотидов в клетке при дефиците О2 и позднему восстановлению или не восстановлению вообще этого депо в постишемическом периоде.

Итак, при повреждении нарушаются процессы энергетического обеспечения клеток на уровне продукции АТФ, транспорта и утилизации его энергии. Дефицит энергии в клетке обусловливает интенсификацию ПОЛ, внутриклеточный ацидоз, нарушение работы АТФ-зависимых ионных насосов, угнетение процессов биосинтеза и дефосфорилирование мембранных белков. Дефосфорилирование мембранных белков нарушает структуру и функции мембран за счет изменения заряда и конформационных свойств белков; белок-липидные взаимоотношения; вызывает локальное обнажение фосфолипидов, что повышает их чувствительность к действию фосфолипаз C и А2; закрывает каналы пассивного транспорта Са2+ в клетку, что снижает сосудистую моторику и тонус сосуда.

3.6. Реперфузионное повреждение клетки

30