11
Научная новизна. Впервые проведено изучение частоты встречаемости однонуклеотидных полиморфизмов, коррелирующих с риском развития рака молочной железы у больных и условно здоровых женщин казахской популяции.
Впервые определены однонуклеотидные полиморфизмы, ассоциированные с неблагоприятным течением рака молочной железы в казахской популяции.
Впервые разработана персонализированная оценка риска развития и прогноза течения рака молочной железы в казахской популяции на основании изучения ОНП.
Впервые представлены рекомендации основанные на результатах исследования, для формирования групп риска по развитию и неблагоприятному течению РМЖ в казахской популяции с помощью определения ОНП.
Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость приведенного исследования заключается в том, что его положения, выводы и результаты, вносят существенный вклад в научное представление о роли маркеров, позволяющих прогнозировать риск развития РМЖ. А также установить, существуют ли патологические и прогностические различия между агрессивностью течения РМЖ у носителей мутантных генов и индивидов, не являющихся носителями этих мутаций.
Теоретически значимым является изучение частоты встречаемости однонуклеотидных полиморфизмов в группе больных раком молочной железы и условно здоровых женщин казахской популяции. Значительным вкладом в раздел онкологии, посвящённый эффективности лечения, представляется изучение однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с неблагоприятным течением рака молочной железы в казахской популяции.
Практическая значимость диссертации состоит в разработке рекомендаций по формированию групп повышенного риска развития и неблагоприятного течения злокачественных новообразований молочной железы в казахской популяции на основании изучения замен ОНП. Примененные в ходе исследования тест-системы по определению ОНП, позволяют сформировать группы высокого риска развития рака молочной железы, что обеспечивает
12
проведение более активных стратегий скрининга и вторичной профилактики у данной группы населения и более раннему выявлению ЗНО молочной железы.
Кроме того, результаты изучения однонуклеотидных оснований у больных раком молочной железы позволяют определить группы неблагоприятного течения заболевания для проведения лечения и активной третичной профилактики.
Внедрение результатов исследования. Основные результаты исследования внедрены и активно используются в Республиканском государственном предприятии «Больница Медицинского центра Управления делами Президента Республики Казахстан» на праве хозяйственного ведения, в
Государственном коммунальном предприятии на праве хозяйственного ведения
«Многопрофильный медицинский центр» акимата города Астана, в
Международном онкологическом центре томотерапии «UMIT», а так же в медицинском центре некоммерческого акционерного общества «Западно-
Казахстанского медицинского университета имени Марата Оспанова».
Методология и методы исследования. Исследование является проспективным, сравнительным, диагностическим исследованием.
Проведено сравнительное изучение замены оснований однонуклеотидных полиморфизмов в казахской популяции в период с 01.01.2017 г. по 31.12.2019 г. в 2 группах: первая группа, исследуемые: 200 исследуемых – пациентки с морфологически подтвержденным диагнозом рак молочной железы казахской популяции; вторая группа, контроля: 216 – условно здоровые женщины казахской популяции.
В работе использованы следующие методы: аналитический, метод прямой экспериментальной проверки, метод систематизации и корректировки полученных данных.
Аналитический метод включал в себя анализ баз данных для определения ОНП коррелирующих с риском развития, прогнозом и течением рака молочной железы, анализ частоты встречаемости однонуклеотидных полиморфизмов в различных этнических популяциях.
13
Метод экспериментальной проверки включал в себя изучение частоты однонуклеотидных полиморфизмов в группе больных раком молочной железы и условно здоровых женщин казахской популяции, их корреляцию с молекулярно-
генетическим типом опухоли, течением заболевания, анамнезом жизни.
Лабораторный этап молекулярно-генетического исследования проведен на оборудовании «Quant Studio 12R Flex Real-Time PCR System» с использованием реагентов: TaqMan® OpenArray® Genotyping Plate, Custom Format 128;
OpenArray® 384-well Sample Plates; OpenArray® Loader Tips; TaqMan® OpenArray® Genotyping Master Mix.
Положения, выносимые на защиту:
1.Для женщин казахской популяции с наличием следующих однонуклеотидных полиморфизмов: rs4646, rs1065852, rs4244285, rs67376798, rs6504950, rs2229774, rs1800056, rs16942, rs4987047 риск развития рака молочной значительно выше, чем в общей популяции, что требует более пристального скрининга и диспансерного наблюдения.
2.Наличие однонуклеотидных полиморфизмов: rs2740574, rs13389423, rs616488, rs1143684, rs3803662, rs6678914 в геноме женщин казахской популяции
сустановленным диагнозом рак молочной железы свидетельствует о неблагоприятном течении заболевания и требует более тщательного планирования специального лечения.
3.Проведение молекулярно-генетического исследование может быть выполнено для женщин казахской популяции сокращенной (44 маркера) панелью маркеров без ущерба эффективности. Что значительно удешевит исследование, а,
следовательно, сделает его более доступным.
4.Сформированные группы повышенного генетического риска развития
инеблагоприятного течения рака молочной железы в казахской позволяют персонифицировать скрининг и лечение данной категории пациенток, и должны быть учтены при планировании ранней диагностики и специальной терапии.
Степень достоверности результатов.
Степень достоверности определяется достаточным объемом научного
14
исследования (416 пациенток), полученными положительными результатами ранней диагностики и специального лечения, подтвержденными аналитическими методами и методами статистической обработки данных, которые показали статистически значимую достоверность.
Материалы, основные положения и выводы диссертационной работы доложены и обсуждены на: XI съезде онкологов и радиологов СНГ и Евразии
(Казань, 2020); VI международном онкологическом форуме «Белые ночи 2020». (С-Петербург, 2020); XIX Международном конкурсе научно-исследовательских работ PTSCIENCE (Москва, 2020); III международном Форуме онкологии и радиологии (Москва, 2020); IX Евразийском радиологическом форуме (Астана,
Казахстан, 2021); VIII Съезде онкологов и радиологов Казахстана с международным участием (Туркестан, Казахстан, 2021); научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения злокачественных новообразовании» (Астана, Казахстан,
2021), XIII съезде онкологов и радиологов СНГ и Евразии (Астана, Казахстан, 2022); IV Конгрессе онкологов и радиологов Республики Узбекистан (Нукус,
Узбекистан, 2022), научно-практической конференции с международным участием «Перспективы и опыт внедрения инновационных технологии в онкологии» (Астана, Казахстан, 2022); совместном межкафедральном заседании кафедр хирургии, акушерства и гинекологии, неотложной и симуляционной медицины, хирургических болезней последипломного образования Института фундаментальной медицины и биологии ФГБАОУ ВО «Казанский
(Приволжский) федеральный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации (Казань, 2022, 2023).
Личный вклад. Автором определены цель и задачи комплексного научного исследования, осуществлен подробный анализ специальной современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме,
разработан алгоритм по формированию групп повышенного генетического риска развития и неблагоприятного течения рака молочной железы в казахской популяции.
15
Автором лично выполнен отбор пациентов. Организованы клинико-
лабораторные, рентгенологические и другие инструментальные методы диагностики, молекулярно-генетические и гистологические исследования. На основании полученных результатов проведен подробный анализ с последующей статистической обработкой данных, сформулированы обоснованные выводы и разработаны практические рекомендации.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Работа соответствует паспорту специальности 3.1.6 - онкология, лучевая терапия в частности пункту 2 (Исследования на молекулярном, клеточном и органном уровнях этиологии и патогенеза злокачественных опухолей, основанные на современных достижениях ряда естественных наук (генетики, молекулярной биологии, морфологии, иммунологии, биохимии, биофизики и др.), пункту 3
(Разработка и совершенствование программ скрининга и ранней диагностики онкологических заболеваний).
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 14
печатных работ, из них 2 – в журналах, рекомендованных перечнем ВАК при Министерстве науки и высшего образования Российской Федерации, 2 - в
журналах, входящих в систему международного цитирования Scopus, получены 1
патент на изобретение и 1 патент на полезную модель (Республика Казахстан).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзор литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций,
перспектив дальнейшей разработки темы, списка сокращений. Работа иллюстрирована 93 рисунками и 67 таблицами. Библиографический указатель включает 43 отечественных и 149 зарубежных источников.
16
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Современное представление о влиянии молекулярно-генетических механизмов на развитие и течение злокачественных новообразований
Рак молочной железы (РМЖ) - является самым распространенным видом рака у женщин, его заболеваемость и смертность продолжают расти во всем мире, что обусловлено агрессивностью течения и метастатической активностью,
и отражает его высокую социальную и экономическую значимость [34, 35, 65, 94]. Снижение смертности от РМЖ может быть достигнуто путем улучшения первичной, вторичной и третичной профилактики [26, 29, 30, 31, 32, 33].
Наиболее значимым в достижении этих результатов является определение молекулярных маркеров злокачественной трансформации для ранней диагностики и своевременного лечения злокачественных новообразований молочной железы [11, 12, 13, 14, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 129, 139, 141].
Патогенез РМЖ рассматривается как результат многоступенчатых генетических мутаций в системе поддержания стабильности генома эпителиальных клеток молочной железы. Систематические исследования геномов онкологических больных обеспечили понимание молекулярной природы развития рака. Использование этой информации для разработки и применения в клинической практике является сложной задачей [1, 3, 6, 36, 37, 38, 184, 185, 186,
187, 188].
Сточки зрения генетики, риск возникновения злокачественных новообразований определяется как интенсивностью воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, так и степенью наследственной предрасположенности к развитию опухолей. Даже «классические» виды индуцированного рака обусловлены генетически [2, 15, 16, 17, 18, 27, 28, 33, 42, 43].
Ссередины 90-х годов девятнадцатого века, исследования в области клеточной биологии, биохимии и молекулярной биологии предоставили
информацию о процессах, позволяющих клеткам делиться, расти,
17
дифференцироваться и выполнять свои основные функции. На сегодняшний день патогенез РМЖ рассматривается как результат многоступенчатых генетических мутаций в системе поддержания стабильности генома эпителиальных клеток молочной железы. Система эта представлена множеством динамично взаимодействующих белковых комплексов и систем, способных не только распознавать и устранять повреждения ДНК, но и осуществлять эпигенетическую регуляцию экспрессии различных генов, в том числе ответственных за все метаболические события в жизнедеятельности маммоцитов [39, 40, 41, 44, 45,
115, 191, 192].
К числу РМЖ-ассоциированных генов относят уже известные BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN, CHEK2, ATM и PALB2 [87]. Наиболее широко изучены гены BRCA1 и BRCA2. Дефекты генов BRCA характеризуются высокой пенетрантностью, что составляет 70,0% всех генетических мутаций РМЖ и рака яичников (РЯ [33]. Средний риск развития РМЖ при повреждении BRCA1 гена до 70 лет составляет 65,0%, BRCA2 – 45,0% [4]. Наблюдаются значительные вариации в распределении мутационных повреждений в этих генах в различных популяциях и географических зонах проживания [43]. В частности, делеция
BRCA2 6174delT является мутацией-основателя у евреев-ашкенази и встречается с частотой 8,0% у больных после 42 лет [152]. В США и Канаде мутация идентифицирована с частотой 1,2-16,4%, у славянок частота не превышает 1,0%
[28].
В работах ряда авторов доказано, что однонуклеотидные полиморфные варианты в генах микроРНК, генах-мишенях, а также в генах участников биосинтеза и процессинга малых РНК могут существенно влиять на регуляторную функцию микроРНК, что в свою очередь может привести к развитию патологических процессов [105, 140, 149, 164, 165, 177], хотя конкретный механизм их влияния на развитие онкологических заболеваний остается малоизученным.
Знание базовых механизмов клеточной биологии привело к практическим результатам в понимании развития злокачественных опухолей. Конкретные
18
молекулы и рецепторы участвующие в контроле клетки через клеточный цикл,
регулируют рост клеток. Понимание процессов нормального клеточного цикла и того, как эти процессы, протекают, предоставляют ключевую информацию о механизмах, которые запускают развитие злокачественных опухолей. Потеря контроля над клеточным циклом является одним из важнейших шагов в развитии опухолей.
Хотя злокачественные новообразования имеют больше 100 различных нозологических единиц, все опухолевые клетки имеют одну общую характеристику: они являются ненормальными клетками, в которых нарушаются процессы, регулирующие нормальное деление. То есть опухоль развивается из нормальных клеток, которые приобретают ненормальные свойства. Эти изменения часто являются результатом унаследованных мутаций или вызваны факторами окружающей среды, такими как ультрафиолетовое и гамма-излучение,
химические вещества, табачный дым и некоторые вирусы [146, 151, 155].
Все данные свидетельствуют, что развитие большинства видов ЗНО не являются результатом одного события или фактора. Обычно требуется от четырех до семи факторов для трансформации нормальной клетки через ряд последовательных стадий от предраковых изменений до инвазивного рака.
Между стартовым событием и клиническим проявлением опухоли проходит несколько лет. Разработка молекулярно-биологических методов определения может помочь в диагностике потенциальных онкологических заболеваний на ранней стадии, задолго до клинического проявления опухолей [8, 9, 10, 150, 153, 154].
В клетках злокачественных опухолей контроль системы ответственной за чрезмерный рост клеток и инвазию в другие ткани отключены. Эти измененные клетки делятся и растут в присутствии сигналов, которые обычно ингибируют рост клеток; поэтому они больше не требуют специальных сигналов для индукции клеточного роста и деления. Поскольку эти клетки изменены, они приобретают новые характеристики и свойства, включая изменения в клеточной структуре, снижение клеточной адгезии и возможность продуцирования новых
19
белковых молекул и биологически активных веществ. Эти наследуемые изменения позволяют клетке и ее пулу осуществлять рост даже в присутствии нормальных клеток, которые обычно ингибируют рост соседних клеток. Такие изменения позволяют опухолевым клеткам распространяться и прорастать в соседние ткани.
Аномалии в опухолевых клетках обычно возникают в результате мутаций в белок-кодирующих генов, которые регулируют деление клеток. Со временем большинство генов становятся мутантными. Это происходит из-за того, что гены,
ответственные за выработку белков, восстанавливающих повреждение ДНК,
также мутируют. Вследствие этого в клетке запускается каскад мутаций, вызывая дальнейшую атипию в этой, и дочерних клетках [77, 86, 98, 157, 158, 159].
Часть этих мутировавших клеток погибает, но другие изменения дают атипичной клетке избирательное преимущество, которое позволяет ей делиться намного быстрее, чем клетки здоровой ткани. Усиленная пролиферативная активность характеризует большинство клеток злокачественных опухолей. Из 35 000 генов в человеческом геноме, часть связаны с развитием опухолей.
Нарушение функций в одном и том же гене, может быть связана с различными типами опухолей [103].
По типам изменений в генах их условно можно разделить на три группы:
Первая группа - протоонкогены, которые продуцируют белковые молекулы, обычно усиливающие пролиферативную активность или ингибируют апоптоз. Протоонкогены, подвергшиеся изменениям (мутациям), являются – онкогенами.
Вторая группа – так называемые опухолевые супрессоры, продуцирующие белки, обычно предотвращают деление клеток или вызывают их гибель.
Третья группа – гены восстановления ДНК, которые помогают предотвратить мутации, приводящие к развитию злокачественных опухолей.
Контролируемый рост клеток поддерживается балансом протоонкогенов,
которые ускоряют работу генов-супрессоров опухолей, замедляющих рост клеток. Онкогены приводят к мутациям, которые усиливают пролиферативную
20
активность и деление клеток, тогда как супрессоры опухолей, препятствуют нормальному ингибированию роста [89].
В нормальных клетках протоонкогены кодируют белки, которые посылают сигнал к ядру для стимулирования деления клеток. Эти сигнальные белки действуют через каскад или путь передачи сигналов (рис. 1).
Рисунок 1. - Каскад передачи сигналов в клетке [Learner.org, 2016]
Этот каскад включает в себя мембранный рецептор для сигнальной молекулы, промежуточные белки, которые несут сигнал через цитоплазму, и
факторы транскрипции в ядре, которые активируют гены деления клеток. На каждом этапе каскада один фактор или белок активирует следующий, однако некоторые факторы могут активировать более одного белка в клетке. Онкогены – измененные протоонкогены кодируют эти сигнальные молекулы. Онкогены непрерывно активируют сигнальный каскад, что приводит к увеличению производства факторов, стимулирующих рост. Например, MYC является протоонкогеном, который кодирует фактор транскрипции. Мутации в MYC
преобразовывают его в онкоген, связанный с 70,0% случаев развития рака [87].
РАН является другим онкогеном, который выполняет функцию «включено-
выключено» в каскаде сигналов. Мутации в РАН приводят к тому, что