2 курс / Нормальная физиология / Физиология крови

течение более 24 ч). Таким же образом подготовьте пробу со стандартным раствором гемоглобина: 5 мл трансформирующего раствора и один капилляр стандартного раствора гемоглобина (120 г/л).

Далее производят измерение оптической плотности опытной и стан-

дартной проб на ФЭКе при длине волны 520–560нм (зеленый светофильтр)

в кювете толщиной 10мм. Предварительно выставляется ноль по трансформирующему раствору.

Поскольку содержание гемоглобина в стандартном растворе известно,

содержание гемоглобина в опытной пробе рассчитывают в соответствии с пропорцией

Dст. – 120 г/л;

Dоп. – Х г/л,

где Dст. – оптическая плотность стандартной пробы; Dоп. – оптическая плотность опытной пробы.

При использовании спектрофотометра определение оптической плот-

ности проводят при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10мм.

Содержание гемоглобина рассчитывают по формуле

Hb (г/л) = 367,7D,

где D– оптическая плотность раствора.

Рекомендации по оформлению протокола работы Полученные результаты занесите в тетрадь протоколов опытов,

оцените их и сделайте заключение, исходя из того, что нормальное содержание гемоглобина в крови (нормохромемия) человека – 120–140 г/л

для женщин, 130– 150 г/л для мужчин. Повышение содержания гемоглобина – гиперхромемия, снижение – олигохромемия. Снижение содержания гемоглобина обычно наблюдается при эритропении,

повышение – при эритроцитозе. Содержание гемоглобина после рождения составляет 210 г/л (180–240 г/л). Дальнейшая динамика этого показателя соответствует количественному изменению эритроцитов.

91

Работа № 5. Расчет среднего содержания гемоглобина в одном

эритроците и цветного показателя крови

Расчетные показатели среднего содержания гемоглобина в одном эритроците и цветного показателя крови – индексы красной крови – используются для выводов о насыщенности эритроцитов гемоглобином.

Расчет среднего содержания гемоглобина в одном эритроците производится делением количества гемоглобина (г/л) на число эритроцитов (кл/л).

В норме содержание гемоглобина в одном эритроците колеблется между 27 и 33,3 пг (пг = 10–12 г).

Число 33 пг в одном эритроците принято за цветной показатель, ЦП,

равный 1. Расчет цветного показателя (ЦП) крови производится из соотношения гемоглобина в норме и гемоглобина испытуемого и содержания гемоглобина в норме и гемоглобина испытуемого:

Число эритроцитов в норме(кл/л) / Число эритроцитов испытуемого кл/л)

Содержание НЬ в норме (г/л) / Содержание НЬ испытуемого (г/л)

Рекомендации по оформлению протокола работы Полученные результаты занесите в тетрадь протоколов опытов,

сделайте вывод, исходя из того, что в норме цветной показатель крови колеблется от 0,86 до 1,1 (нормохромия). В случае если он ниже 0,86, то налицо гипо-хромия, а если выше 1,1, то налицо гиперхромия.

Сделайте общие выводы о кислородной емкости крови.

92

ФИЗИОЛОГИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ

Повышение защитной функции крови при мышечной работе выражается в увеличении числа лейкоцитов (миогенный лейкоцитоз). При небольших нагрузках это увеличение незначительно и происходит в связи с ростом числа лимфоцитов. При больших нагрузках миогенный лейкоцитоз может быть выраженным, с явным увеличением числа молодых форм – палочкоядерных и юных лейкоцитов (как следствие раздражения костного мозга.)

Оборудование: спирт, йод, вата, стерильный скарификатор, капилляры Сали, раствор цитрата натрия, 3–5-процентный раствор уксусной кислоты с добавлением метиленового синего, камера Горяева, покровное стекло, пипетка на объем 1 мл, обезжиренные предметные стекла (обезжиривание стекол производят смесью Никифорова), краска Романовского-Гимза, фосфатный буфер (рН = 7,4), этиловый спирт.

Работа № 6. Определение количества лейкоцитов в крови

Определение количества лейкоцитов, как и эритроцитов, осуществля-

ется в камере Горяева. Разведение крови производят в 20 раз 3–5-

процентной уксусной кислотой. При этом эритроциты разрушаются и не мешают счету.

Ход работы Пипеткой отмерьте 0,4 мл разводящего раствора (3–5-процентного

раствора уксусной кислоты), подкрашенного метиленовым синим, и перенесите в чистую пробирку.

Забор крови производите в соответствии с правилами, описанными выше («Физиология красной крови», лабораторная работа № 1). Кровь забирайте в капилляр Сали, наполняя его самотеком до метки (0,02).

93

Кончик капилляра вытрите и перенесите кровь в пробирку с разводящим раствором. Получается разведение 1:20.

Подсчет количества лейкоцитов производите в пяти больших квадратах камеры Горяева ( «Физиология красной крови», лабораторная работа № 1).

Расчет количества лейкоцитов Х в 1 мкл крови осуществляется с уче-

том разведения, объема камеры и числа подсчитанных квадратов:

Nх4000х200 Х

80

Полученное количество лейкоцитов обычно выражают в количестве на 1л крови (результат умножается на 106).

Рекомендации по оформлению протокола работы Результаты занесите в тетрадь протоколов опытов. Сделайте выводы,

исходя из того, что в норме у взрослого человека содержание лейкоцитов в крови составляет 4-9-109кл/л, при мышечной работе - 18-109кл/л.

Увеличение количества лейкоцитов в крови называется лейкоцитозом, а уменьшение - лейкопенией. Снижение количества лейкоцитов в крови всегда имеет патологический характер. Повышение количества лейкоцитов в крови может быть физиологическим, то есть возникать у здоровых людей (лейкоцитоз пищевой, миогенный, при беременности), и патологическим. Число лейкоцитов в периферической крови в первые 5 дней жизни составляет 18-20-109кл/л, в двухнедельном возрасте снижается до 9-12- 109кл/л, а в последующие периоды онтогенеза не отличается от уровня у взрослых.

Работа № 7. Изучение морфологии лейкоцитов

Исследование морфологии лейкоцитов производят микроскопированием мазков крови, окрашенных по Романовскому. Принцип метода окраски мазков состоит в избирательном поглощении

94

веществами клетки трех красящих веществ – азура, метиленового синего и эозина. Азур имеет амфотерно-основную реакцию, метиленовая синька – щелочную, эозин – кислую.

Задание 1. Приготовление мазков крови

Ход работы Каплю крови поместите на край чистого обезжиренного предметного

стекла и сделайте мазок с помощью другого предметного стекла со шлифо-

ванным краем. Вторым предметным стеклом со шлифованным краем при-

коснитесь к капле крови и, как только капля, коснувшись подвижного стекла, разойдется по линии соприкосновения стекол, верхним стеклом,

держа его под углом 45° (рис. 6), проведите по первому стеклу в направлении от капли, чтобы получился мазок. Мазок должен быть достаточно тонким, чтобы клетки крови расположились в один слой; в то же время следует избегать чрезмерного надавливания (для избежания деформации лейкоцитов). Приготовленные мазки высушивают на воздухе,

а затем фиксируют и окрашивают с использованием нескольких способов.

Рис. 6. Приготовление мазка крови

95

Задание 2. Фиксация и окраска мазков

Ход работы Есть два способа фиксации и окраски мазка.

Способ 1. Свежеприготовленный, высушенный на воздухе мазок за-

фиксируйте метиловым или этиловым спиртом. Для этого мазок поместите горизонтально в ванночку на подставки и капайте спирт так, чтобы он полностью покрывал мазок крови. Подождите несколько минут до испарения спирта.

Окраску фиксированных мазков производите свежеприготовленным водным раствором краски Романовского-Гимза. Для этого на 1 мл воды до-

бавьте одну каплю краски (~40мкл). Для получения хорошей окраски значение рН воды должно составлять ~6,8–6,9. Поэтому желательно использовать вместо воды фосфатный буфер с рН – 6,8–6,9. На один мазок потребуется 2–3 мл водного раствора краски.

Окрашивание производите нанесением водного раствора краски каплями на горизонтально расположенный на подставках в ванночке мазок

(до полного покрытия мазка). Красьте в течение 15–20 мин, после чего смойте краску холодной водопроводной водой и высушите мазок на воздухе.

Способ 2 (ускоренный). При окраске мазка ускоренным способом мазок не фиксируется предварительно. Свежеприготовленный,

высушенный на воздухе мазок поместите горизонтально в ванночку на подставки и наносите неразведенную краску Романовского – Гимза каплями, чтобы она полностью покрывала мазок крови, при этом капли считайте. Подождите 2 мин и после этого нанесите столько же капель дистиллированной воды. Смешайте воду с краской аккуратным покачиванием мазка и красьте 10 минут. После этого краску смойте холодной водопроводной водой и высушите мазок на воздухе.

96

Окрашенный и высушенный мазок исследуйте под микроскопом с им-

мерсией. На мазок нанесите каплю иммерсионного масла, осторожно опустите объектив (х90) до соприкосновения с маслом, затем объектив приподнимите на 1 мм. При этом силы поверхностного натяжения удерживают масло в контакте с линзой. После этого настройте поле зрения, медленно опуская объектив до появления контуров клеток. Для окончательной фокусировки используйте микровинт.

В поле зрения (рис. 7) основную площадь занимают безъядерные эритроциты и от одного до нескольких лейкоцитов с ядрами. Лейкоциты крупнее эритроцитов по размерам; ядра окрашены в фиолетовый цвет.

Нейтрофилы имеют бледно-розовую цитоплазму с нейтрофильными гранулами, окрашивающимися в розово-фиолетовый цвет. Форма ядра нейтрофилов зависит от их зрелости. Палочкоядерные нейтрофилы,

являющиеся более молодыми клетками, имеют ядро в виде изогнутой палочки. У зрелых нейтрофилов ядро вследствие перекручивания разделено на ряд сегментов, связанных очень тонкими, иногда почти незаметными нитями. Это полиморфноядерные, или сегментоядерные,

нейтрофилы.

Рис.7. Морфологические особенности лейкоцитов крови: 1 – базофил;

2, 12 – эритроциты; 3 – эозинофил; 4, 7 – моноциты; 8, 9, 10 – лимфоциты;

97

5 – палочкоядерный нейтрофил; 6 – сегментоядерный нейтрофил; 11 –

тромбоциты

У эозинофилов и базофилов цитоплазма окрашена очень слабо.

Эозинофилы имеют ярко окрашенные красные гранулы, окрашивающиеся эозином. Ядро эозинофилов по структуре близко к ядру нейтрофилов:

более молодые клетки имеют палочковидное ядро, более зрелые – сегментированное. Однако сегментация ядра выражена меньше. Ввиду относительной малочисленности эозинофилов учет палочкоядерных и сегментоядерных форм в отдельности не производится.

Базофилы в цитоплазме содержат крупные темные фиолетовые или ультрамариновые гранулы, часто закрывающие отдельные участки ядра.

Ядро базофилов неправильной формы, окрашивается в фиолетово-розовый цвет.

Лимфоциты и моноциты, составляющие группу агранулоцитов, не со-

держат зернистости в цитоплазме. Клетки лимфоцитов округлые, с

круглым или овальным ядром, которое окружено или очень узким (малые лимфоциты), или более широким (средние и большие лимфоциты) пояском цитоплазмы. Цитоплазма лимфоцитов голубая. Часто она видна лишь с одной стороны от ядра (в виде серпа). В некоторых клетках и этот серп незаметен, и тогда малый лимфоцит имеет вид «голого ядра».

Моноциты крупнее лимфоцитов, большей частью круглой, иногда не-

правильной формы, с хорошо выраженной цитоплазмой. Цитоплазма моноцитов серо-голубая. Ядро сравнительно велико и имеет выступы и углубления. Обычно оно «бобовидной» формы. Интенсивность окраски ядра моноцитов слабее, чем лимфоцитов.

Двигаясь по мазку, исследуйте лейкоциты в каждом поле зрения. При этом рекомендуется пересекать мазок по схеме, представленной на рис. 8.

98

пересчет на абсолютное содержание клеток крови, исходя из подсчитанного количества всех лейкоцитов в крови. При отклонениях морфологического состава в абсолютных единицах от нормы (таблица)

делается вывод об абсолютном нейтрофилезе или нейтропении и т. д.

Таблица. Морфологический состав лейкоцитов крови в абсолютных единицах (лейкоцитарный профиль)

Сделайте общее заключение о защитной роли лейкоцитов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОЭ, ГРУППЫ КРОВИ ПО СИСТЕМЕ АВО, РЕЗУСФАКТОРА

Цель: ознакомиться с методиками определения скорости оседания эритроцитов, групп крови и резус-фактора.

Задачи:

1)определить скорость оседания эритроцитов (СОЭ);

2)определить группу крови по системе АВО;

3)определить резус-фактор.

Оборудование: спирт, йод, вата, стерильный скарификатор, прибор Панченкова, эмалированные пластинки с лунками, стеклянные

палочки, стандартные сыворотки для определения групп крови и резус-

фактора, 5-процентный раствор цитрата натрия.

Работа № 8. Определение СОЭ

Метод основан на определении высоты столба плазмы крови, стабили-

зированной цитратом натрия, над осевшими за 1 ч форменными

100