2 курс / Нормальная физиология / Молекулярная_физиология_Пятин_В_Ф_,_Баишева_Г_М_и_др_

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК

химические подходы, которые заключаются в выделении каналов из мембран и исследовании выделенных молекул.

5.Фармакологические методы. Фармакологические методы связаны с использованием природных и синтетических соединений, модулирующих работу ионных каналов.

6.Ультраструктурные методы.

а) Для определения локализации, плотности и распределения ионных каналов используются методы электронной микроскопии, иммуноцитохимии, методы флуоресцентной микроскопии, в том числе с использованием моноклональных антител.

б) Флуоресцентные методы широко применяются и для исследования изменений внутриклеточной концентрации кальция с использованием внутриклеточных кальциевых индикаторов (Van Der Kloot, Molgo, 1994).

7.Исследования ионных каналов с помощью потенциал-чувствительных красителей. Изменения МП и, следовательно, активность ионных каналов, можно регистрировать с помощью потенциал-чувствительных красителей, спектральные характеристики которых меняются в ответ на изменения потенциала.

8.Рентгенокристаллографический метод. Использование метода рентгенокристаллографии совместно с биохимическими, генетическими, электрофизиологическими методами позволило выявить принципы структуры и функционирования канальных белков. Позволяет оценить трехмерную структуру ионного канала.

Свойства ионных каналов

1.Селективность - избирательная повышенная проницаемость ИК для определённых ионов. Такая избирательность определяется селективным фильтром - самым узким местом канальной поры. Фильтр, кроме узких размеров, может иметь также локальный электрический заряд. Например, катионселективные каналы обычно имеют в области своего селективного фильтра отрицательно заряженные остатки аминокислот в составе белковой молекулы, которые притягивают положительные катионы и отталкивают отрицательные анионы, не пропуская их через пору (ПРИЛОЖЕ-

НИЕ 9).

2.Управляемая проницаемость - способность ИК открываться или закрываться при определённых управляющих воздействиях на канал.

3.Инактивация - способность ИК через некоторое время после своего открытия автоматически понижать свою проницаемость даже в том случае, когда открывший их активирующий фактор продолжает действовать

(ПРИЛОЖЕНИЕ 12).

ИОННЫЕ КАНАЛЫ

•Быстрая инактивация. У потенциал-активируемых каналов быстрая инактивация происходит с помощью специальной молекулярной «пробки-затычки», которая представляет собой аминокислотную (полипептидную) петлю с утолщением на конце в виде трёх аминокислот, которым и затыкается внутреннее устье канала со стороны цитоплазмы. Именно поэтому потенциал-зависимые ИК для натрия, обеспечивающиеразвитиепотенциаладействияидвижениенервного импульса, могут пропускать в клетку ионы натрия только в течение нескольких миллисекунд, а затем они автоматически закрываются своими молекулярными пробками, несмотря на то, что открывающая их деполяризация продолжает действовать. Другим механизмом инактивации ИК может служить модификация дополнительными субъединицами внутриклеточного устья канала.

•Медленная инактивация канала происходит за счёт процессов, противоположных процессам, обеспечившим его открытие, т.е. за счёт конформации канального белка.

4.Блокировка — способность ИК под действием веществ-блокаторов фиксировать какое-то одно своё состояние и не реагировать на обычные управляющие воздействия. В таком состоянии канал перестаёт давать ответы на управляющие воздействия. Блокировку вызывают веществаблокаторы, которые могут называться антагонистами, блокаторами или литиками. Антагонисты - вещества, препятствующие активирующему действию других веществ на ИК. Такие вещества способны хорошо связываться с рецепторным участком ИК, но не способны вызвать его ответную реакцию. Происходит блокада рецептора и вместе с ним блокада ИК. Агонисты-антагонисты - это вещества, которые обладают слабым стимулирующим влиянием на рецептор, но при этом блокируют действие естественных эндогенных управляющих веществ. Блокаторы - вещества, препятствующие работе ИК, например, взаимодействию медиатора с рецептором к нему и, следовательно, блокирующие его. Например, действие ацетилхолина блокируют холиноблокаторы; норадреналина с адреналином - адреноблокаторы; гистамина - гистаминоблокаторы и т. д. Многие блокаторы применяются в терапевтических целях как лекарственные пре- параты.Литики-вещества,препятствующиенетолькодействиюлиганда, но и передаче возбуждения в целом (ПРИЛОЖЕНИЕ 12).

5.Пластичность - способность ИК изменять свои свойства. Наиболее рас- пространённыймеханизм,обеспечивающийпластичность,-этофосфори- лирование аминокислот канальных белков с внутренней стороны мембраны ферментами-протеинкиназами. К канальным белкам присоединяются фосфорные остатки от АТФ или ГТФ, и канал меняет свои свойства, например, стабильно фиксируется или в закрытом, или в открытом состоянии.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК

Функции ИК

1)Управляемое перемещение ионов через мембрану.

2)Регуляция водного обмена клетки: объём и тургор.

3)Регуляция pH: закисление и защелачивание.

4)Регуляция ионного обмена (обмен солей): изменение внутриклеточного ионного состава и концентрации.

5)Создание и изменение мембранных потенциалов: потенциал покоя; в возбудимых клетках - локальные потенциалы, потенциал действия.

6)Проведение возбуждения в возбудимых клетках: обеспечение движения нервных импульсов.

7)Трансдукция в сенсорных рецепторах: преобразование раздражения (стимула) в возбуждение.

8)Управление активностью клетки: за счёт обеспечения потоков вторичного мессенджера - Са2+.

Функциональные состояния ИК

1.Открытое. Канал открыт и через него происходит перемещение ионов.

2.Закрытое. Канал закрыт, ионы не способны проходить через него.

3.Активированное. Канал может выполнять свои функции, т.е. открываться и закрываться под действием его регуляторов (управляющих веществ или электрических потенциалов).

4.Инактивированное. Канал не может выполнять свои функции, т.е. открываться и закрываться, он «фиксируется» в каком-то одном состоянии.

5.Блокированное. Канал перекрыт, инактивирован веществом-антагонистом (блокатором), занявшем место управляющего вещества.

6.Модулированное (фосфорилированное).Канализменяетсвоиобычныесвой- стваподдействиемфосфорилирования-присоединенияккакому-тоегоучаст- ку фосфатного остатка.

Классификация ИК

1.Селективные и неселективные. Селективные ионные каналы: Na+, К+, Cl-, Ca2+. Селективность определяется соотношением:

•размер поры/размер иона и его гидратной оболочки;

•заряд иона/заряд канала.

2.Управляемые (воротные) и неуправляемые (каналы утечки, каналы покоя). Неуправляемые каналы открываются в покое без внешних факторов. Управляемые каналы в покое закрыты, открываются при определенном воздействии. Основа открытия и закрытия ворот – изменение конформации белка.

3.По способу управления воротные ионные каналы делятся на:

ИОННЫЕ КАНАЛЫ

1)Потенциал-зависимые. Канал открывается и закрывается при изменении заряда мембраны (мембранного потенциала), в структуре канала есть сенсор напряжения.

2)Лиганд-зависимые. Открываются при присоединении сигнальной молекулы (лиганда). Могут активироваться снаружи (гормоны, медиаторы) и изнутри (вторичные посредники). Содержат рецептор, обладающий высоким сродством к лиганду.

3)Механочувствительные. Открываются или закрываются в ответ на растяжение мембраны. Характерны для цитоплазматической мембраны гладких миоцитов.

2.2.1. NA+-КАНАЛЫ, ИХ СВОЙСТВА И ПРИНЦИП РАБОТЫ

Эти каналы обнаружены практически во всех возбудимых и многих невозбудимыхклетках. В возбудимых клетках потенциал-активируемыеNa+-каналы участвуют в формировании потенциала действия (ПД) и обеспечивают достаточно высокую скорость распространения ПД по мембране. Самая высокая плотность Na+-каналов определяется в перехватах Ранвье миелинизированных нервных волокон и в области аксональных холмиков нервных клеток, более низкая - в мембранах сомы нервной клетки, нервных окончаний, мышечных и эндокринных клеток. В пресинаптических структурах Na+-каналы, участвуя в формировании ПД, регулируют количество входящих ионов Са2+ и, соответственно, количество освобождаемых квантов медиатора, а также синхронизируют секрецию медиатора во времени.

В последние годы для Na+-каналов была разработана новая стандартная классификация, основанная на сходстве между аминокислотными последовательностями каналов. В этой классификации индивидуальный канал представлен в виде химического символа, который показывает главный проходящий ион (Na) с главным физиологическим регулятором канала (потенциалом - «voltage gate channels»), и это записывается вместе как NaV. Число после этих символов показывает генное подсемейство (в настоящее время это только NaV1.), а число, следующее за точкой, показывает специфическую канальную изоформу (например, NaV1.1). Это последнее число было предложено для того, чтобы показать порядок, в котором был идентифицирован каждый ген.

Свойства Na+-каналов:

1)Воротный механизм Na+-каналов характеризуется 4 процессами: активация при деполяризации, инактивация при длительной деполяризации, деактивация после реполяризации и реактивация канала при его выходе из инактивированного состояния.

2)Na+-каналы закрыты при нормальных значениях МП покоя и открываются на очень короткое время (1 мс и менее) при деполяризации.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК

3)Na+-каналы принимают участие в создании определенной внутриклеточной концентрации ионов Na+, которая влияет на внутриклеточную концентрацию ионов Са2+ и К + через работу Na+/Ca2+ -обменника и Na+/К+ - обменника.

Структура Na+-канала включает α-субъединицу, при этом α-субъединица включает в себя 4 гомологичных домена (I-IV), каждый из которых имеет 6 трансмембранных спиралей (S1-6), а также β1-, β2-субъединицы. В функциональном отношении канал имеет устье, обращенное в сторону, откуда поступает ион (в данном случае внешняя сторона мембраны), селективный фильтр, оценивающий вид иона, активационные и инактивационные ворота, которые могут перекрывать канал для прохождения ионов, и, наконец, сенсор напряжения, управляющий работой канала.

Диаметр пор Na+-канала очень маленький. Он немногим больше диаметра ионов,которыепроходятчерезэтиканалы,чтопредотвращаетвходвнихбольшихполярныхорганическихмолекул.ДляпрохожденияионовNa+ черезканал они должны дегидратироваться.

Модельмолекулярнойорганизациипотенциал-управляемогоNa+-канала.

ИОННЫЕ КАНАЛЫ

стиц, образующих активационные ворота, больше, и это приводит к открытию канала, в результате через канал проходят ионы натрия.

Следующее за этим изменение трансмембранного потенциала приводит к закрытию инактивационных ворот. Это переводит канал из активированного состояния в инактивированное (ток ионов натрия блокируется).

Рис.8. Молекулярная модель Na+ - канала. Внеклеточные участки β1 - , β2 - субъединиц - участки гликозилирования; P - места фосфорилирования протеинкиназой А (кружки́) и протеинкиназой C (ромбы); h - инактивационная частица в петле инактивационных ворот. Сегмент S4 - предполагаемый сенсор напряжения.

Принцип работы Na+-канала

Деполяризация мембраны вызывает конформацию канальной молекулы: одновременно смещаются с разной скоростью и в разных направлениях акти-

вационные (m) и инактивационные (h) ворота: активационные ворота стре-

мятся открыть канал, а - инактивационные - закрыть. Скорость смещения ча-

Рис. 9. Схема работы потенциал-управляемого Na+-канала.

А - функциональные области ионного канала: селективный фильтр, пора, ворота и сенсор напряжения.

Б - модель работы потенциал-управляемого Na+-канала, имеющего активационные m-ворота и инактивационные h-ворота. В состоянии покоя канал закрыт (закрыты активационные ворота, открыты инактивационные). При активации канал открыт (открыты и m-, и h- ворота). При достижении максимального потенциала канал инактивируется (инактивационные h-ворота закрыты).

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК

Фармакология Na+-каналов

Ряд биологических токсинов модифицируют свойства Na+-каналов. По участкам связывания и механизмам блокирующего действия все токсины можно разделить на несколько групп.

I.Токсины первой группы блокируют ионную проводимость Na+-канала. К ним относится алкалоид тетродотоксин, хорошо известный токсин, обна-

руженный в рыбе фуга (иглобрюх, скалозуб - Tetraodontidae).

II.Данная группа токсинов вызывает постоянную активацию Na+-каналов. К ним относят липидорастворимые токсины вератридин, батрахотоксин, аконитин и грайянотоксин. Постоянная активация Na+-каналов при действии данных веществ объясняется двумя эффектами: сдвигом потенци-

ал-зависимости активации к более отрицательным значениям МП и блокированием быстрой инактивации.

III.Токсины данной группы, связываясь с внеклеточной стороной канала, блокируют или замедляют инактивацию Na+-каналов, предотвращая переход из открытого в инактивированное состояние. Это токсины скорпи-

она, выделенные из яда североафриканских видов Androctonus, Buthus и Leiurus.

IV. Данные токсины смещают потенциал-зависимость активации Na+-канала

к более отрицательным значениям МП, не влияя на инактивацию.

V.Токсины указанной группы вызывают повторную нейрональную активность, изменяют потенциал-зависимость и блокируют инактивацию Na+- каналов.

VI. К токсинам, связывающимся с участком 6, относят пиретроидные инсектициды, которые являются сильными возбуждающими нейротоксинами. Они вызывают гипервозбуждение и паралич животных.

2.2.2.СА2+- КАНАЛЫ, ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ. КАЛЬЦИЕВЫЕ ТОКИ

Ca2+ - каналы обеспечивают поступление ионов Са2+ в цитоплазму клетки и таким образом реализуют многочисленные функции: участвуют в электрогенезе, поддержании определенной внутриклеточной концентрации ионов Са2+, инициациисекрециимедиаторовигормонов,формированиикратковременных и долговременных форм синаптической пластичности в ЦНС, регуляции экспрессии генов, мышечном сокращении и т.д.

Различают Са2+- каналы плазматической мембраны и внутриклеточных органелл. Са2+- каналы плазматической мембраны обеспечивают поступление в цитоплазму внеклеточного кальция, Са2+- каналы внутриклеточных органелл - кальция, запасенного во внутриклеточных структурах, например, в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) (в мышце – в саркоплазматическом ретикулуме (СПР)). На мембранах ЭПР и СПР описаны два основных типа лиганд-активируемых Са2+- каналов: инозитолтрифосфатные и рианодиновые. Принцип физиологической регуляции работы Са2+- канала - потенциал-

ИОННЫЕ КАНАЛЫ

управляемые (voltage gated calcium channels) каналы. Потенциал-управляемые Са2+- каналы позволяют ионам Са2+ входить в клетки, когда мембрана деполяризована. Са2+- каналы были обнаружены практически во всех клетках.

Модель молекулярной организации Са2+ - канала

Са2+- каналы представляют собой комплекс белков, образованный из четырех или пяти определенных субъединиц (α1-субъединицы и вспомогательных α2-, δ-, β- и γ-субъединиц), кодирующихся большим семейством генов. Субъединица α1 формирует проводящую пору, она содержит сенсор напряжения и аппарат ворот канала. Петля между трансмембранными сегментами S5 и S6 в каждом домене определяет селективность и проводимость канала. Селективный фильтр Са2+- канала должен узнать ион Са2+ на входе в канал.

Вспомогательные α2-, δ- и β-субъединицы способствуют транспорту ионов Са2+ через пору, образованную α1-субъединицей, и модулируют потенциал-за- висимую кинетику канала, α2 и δ субъединицы связаны дисульфидными мостиками и являются единым комплексом. Внутриклеточная β-субъединица и трансмембранный комплекс α2-δ-субъединиц являются компонентами большинства типов Са2+- каналов. β-субъединица играет роль в транспорте ионов через канал, в электромеханическом сопряжении в мышечных волокнах скелетных мышц. Наличие субъединицы γ было обнаружено в Са2+- каналах скелетных мышц, в кардиомиоцитах и нейронах головного мозга. Несмотря на то, что эти добавочные субъединицы модулируют свойства ионного канала, фармакологические и электрофизиологические особенности Са2+- каналов в основном связаны с существованием α1-субъединиц.

А

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК

Б

Рис. 10. Модель потенциал-управляемого Сa2+-канала. А – молекулярная модель, Б – физи-

ологическая модель. (пояснения в тексте)

Кальциевые токи

L-тип (от «long-lasting» - долго длящийся) Са2+-токов требует сильной деполяризации для активации, он долго длится и блокируется органическими антагонистами L-типа Са2+-каналов, включая нифедипин, верапамил, этанол, конотоксин.Са2+-токиL-типаявляютсяглавнымивмышцах,включаямиокард, и эндокринных клетках, где они инициируют сокращение и секрецию.

N-тип (от «neither long nor transient» - ни L, ниT), P/Q-тип и R-тип кальци-

евыхтоковтакжетребуютсильнойдеполяризациидляактивации.Ониотносительно нечувствительны к антагонистам L-типа Са2+-каналов, но блокируются специфическими токсинами из ядов улитки или паука. Эти токи в основном выражены в нейронах, где они инициируют нейротрансмиссию для большинства быстрых синапсов и также опосредуют вход Са2+ в клеточные тела и дендриты.

T-тип (от «transient» - преходящий) Са2+-токов активируется слабой деполяризацией, и эти токи мимолетные (преходящие). Они нечувствительны к органическим антагонистам и токсинам змей и пауков, которые используются для определения N- и P/Q Са2+-токов. Са2+-токи T-типа выражены в большом спектре клеточных типов, где они вовлечены в развитие потенциала действия и важны в клетках и тканях, обладающих ритмической активностью.

ИОННЫЕ КАНАЛЫ

Внутриклеточные Са2+- каналы

ЦитоплазматическаяконцентрациясвободныхионовCa2+ малаизначительное количество Ca2+ находится во внутриклеточных структурах. Запасенный в них Ca2+ может высвобождаться в ответ на адекватные стимулы через Са2+- каналы.

Вразличных клетках описано большое количество структур, которые утилизируют внутриклеточный кальций, главными из которых являются гладкий ЭПР. На мембране гладкого ЭПР нервных клеток описаны два основных типа лиганд-активируемыхСа2+-каналов:рианодиновые(Ри)иинозитолтрифосфат- ные (ИФ3).

Впоследние годы появляется все больше информации о существовании других разновидностей внутриклеточных Са2+-каналов, избирательно активируемых внутриклеточными метаболитами (НАД+, НАДФ+, циклическая АДФрибоза и др.).

Са2+-каналы рианодиновых рецепторов (ПРИЛОЖЕНИЕ 11)

Рианодин является алкалоидом, позволившим выделить данный тип рецепторов. Внутриклеточные Са2+-каналы Ри-рецепторов активируются ионами Са2+ и вызывают освобождение кальция из гладкого ЭПР и СПР в нервных клетках, скелетной, гладкой и сердечной мышцах. Внутриклеточные Ca2+- каналы обеспечивают длительное поддержание высокой внутриклеточной концентрации ионов Са2+, обеспечивают сокращение мышц и возникновение Са2+-волн.

Ри-рецепторы в симпатических нервных окончаниях и в клетках Пуркинье мозжечка могут участвовать в освобождении медиатора. В нервно-мышечном соединении рианодин усиливает кальций-зависимое освобождение медиатора. В сердце освобождение Са2+ из внутриклеточных депо инициируется Са2+- входомчерезбыстроактивируемыеСа2+-каналыТ-типаиподдерживаетсяСа2+- каналами L-типа во время фазы плато ПД. Кальций активирует Ри-рецепторы 2-типа, экспрессируемые в сердечной и гладкой мышцах. В скелетной мышце освобождение кальция опосредуется Ри-рецепторами, которые локализованы в мембране СПР вблизи Т-трубочек и контактируют с потенциал-активируе- мыми Са2+-каналами L-типа (ДГП-рецепторами) с помощью доменов, выступающих в цитозоль. Деполяризация тубулярной мембраны вызывает конформационные изменения рецептора, что ведет к активации Ри-рецепторов. Этот сигнал, передающийся между Т-тубулярной системой и саркоплазматической мембраной, опосредует связь «возбуждение-сокращение» в мышце.

Каналы рецептора инозитолтрифосфата (ИФ3-рецепторы)

ИФ3 относится к вторичным посредникам, образующимся при активации фосфолипазы С гормонами и нейромедиаторами, расщепляющей фосфатидилинозитолдифосфат мембраны. ИФ3 стимулирует высвобождение кальция из ЭПР путем активации ИФ3-рецепторов, что обеспечивает запуск целого ряда внутриклеточных Са2+-зависимых процессов.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК

2.2.3.K+- КАНАЛЫ, ИХ РАЗНОВИДНОСТИ

ИМЕХАНИЗМЫ ИОННОЙ СЕЛЕКТИВНОСТИ

К+ - каналы составляют наиболее представительный и гетерогенный класс ионных каналов относительно кинетических свойств, регуляции, фармакологии и структуры.

К+-каналы возбудимых клеток участвуют в образовании мембранного потенциала покоя (МПП), обеспечивают реполяризацию мембраны во время потенциала действия (ПД), формируют следовую гиперполяризацию, модулируют повторную активность, играют роль в регуляции секреции медиатора из нервных окончаний, принимают участие в механизмах обучения и памяти.

К+-каналы регулируются мембранным потенциалом, G-белками и внутриклеточными вторичными посредниками, являются мишенью действия фармакологических агентов.

Классификация К+ - каналов:

1)потенциалуправляемые К+ - каналы (KV);

2)Ca2+- активируемые К+ - каналы (KCa);

3)K+ - каналы аномального выпрямления с током входящего направле-

ния (inward rectifier K+-channels) (Kir), в том числе G-белок управляе-

мые К-каналы (GIRK-каналы);

4)K+ - каналы с двумя петлями в домене (two-PK+ - channels, К2Р);

5)АТФ-зависимый К+ - канал;

6)К+ - канал утечки.

β-субъединицами. Субъединицы α формируют тетрамер, чтобы образовать функциональный канал, проводящий ионы K+.

сенсор напряжения белка. Длинные N- и C-терминальные петли контролируют инактивацию каналов и белок-белковое взаимодействие. Б - ассоциация четырех субъединиц в КV-канал.

ИОННЫЕ КАНАЛЫ

Принцип работы потенциал-управляемых К+- каналов (KV )

КV-каналы открыты при деполяризации мембраны, что способствует выхо- дуионовК+изклетки.ОднаиззадачКV-каналовзаключаетсявтом,чтобыпре- кратить деполяризацию, вызванную активацией потенциал-зависимого входа катионов. Любые увеличения КV-канальной активности будут приводить к болееэффективномуокончаниюдеполяризации(обычноукорачиваяилинивелируя ПД). Эта функциональная способность КV-каналов также лежит в основе формирования пачечной активности, что обуславливает роль КV-каналов в кодировании информации в нервной системе.

Разновидности потенциал-управляемых К+-каналов (KV )

1.К+-каналы задержанного выпрямления (Кdr-каналы «delayed rectifier K+- channels»). Эти каналы преобладают в большинстве возбудимых клеток, активируютсяпридеполяризацииинеинактивируются,либоинактивируются очень медленно (от сотен миллисекунд до нескольких секунд).

2.Быстрые К+-каналы (КА-каналы «Fast transient K+-channels»). Быстрые транзиторные К+-каналы выходящего тока представляют собой каналы,

активируемыенизкимпотенциалом.КА-каналыактивируютсяиинактиви- руются быстро, функционируют в подпороговых для генерации ПД областях, открываются кратковременно в ответ на небольшую деполяризацию

при условии предварительной гиперполяризации мембраны. КА-каналы преобладают в сенсорных нейронах, которые разряжаются с частотой, отражающей интенсивность стимула.

3.Медленно активирующиеся К+-каналы (КS-каналы). Задержанныевыпрям-

ляющие К+-токи с очень медленной кинетикой активации (slow) были впервыеописанывволокнахПуркиньесердца.Медленноактивирующий-

ся KS-канал также был обнаружен в изолированных нервных окончаниях гипофиза.

Ca2+-активируемые K+-каналы (KCa)

КСа-каналы управляются не только потенциалом, но и внутриклеточной концентрацией ионов Са. КСа-токи обнаружены практически во всех нервных клетках. На функцию КСа-каналов оказывает влияние целый ряд токсинов: токсины скорпиона — харибдотоксин и ибериотоксин, апамин и бреветоксин-В.

КСа-токи классифицируются по скорости: на быстрые (активируются в течение миллисекунд, участвуют в реполяризации ПД) и медленные (активируются с задержкой в несколько десятков миллисекунд, вносят вклад в следовую гиперполяризацию ПД); по проводимости: КСа-каналы большой проводимости - BK-каналы (проводимость более 200 пСм) и малой проводимости - SKканалы (проводимость менее 100 пСм).

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК

Группы Kir. К+-каналы аномального выпрямления с током входящего направления, G-белок управляемые К+-каналы, АТФ-зависимые К+-каналы

К+-каналы аномального выпрямления называются так потому, что входящийтокпроходитчерезнихсбольшейлегкостью,чемвыходящий,поэтомуих назвали каналами входящего выпрямления (inward rectifier). Эти каналы преобладают в большинстве возбудимых клеток, активируются при деполяризации и либо не инактивируются, либо инактивируются медленно (от сотен миллисекунд до нескольких секунд). Они играют важную физиологическую роль в функции многих органов, включая мозг, сердце, почки, эндокринные клетки, слуховые клетки и клетки сетчатки.

Рис. 12. Молекулярная организация Kir - канала. А - одна субъединица Кir-

канала представляет собой α-спираль с двумя трансмембранными сегментами (S5 и S6), расположенными в цитоплазме N- и C-терминалями, и короткую Р-петлю, формирующую пору. Б - ассоциация четырех субъединиц в Кir-канал.

Семейство Кir-каналов включает G-белок-активируемые каналы (GIRK- каналы), опосредующие эффект ацетилхолина в пейсмекерах сердца, классические каналы входящего выпрямления в скелетных и сердечной мышце и нейронах, а также АТФ-зависимые К+-каналы (см. ниже).

G-белок управляемые К+-каналы (GIRK-каналы).

Некоторые каналы входящего выпрямления управляются G-белками (GIRK1,2,4). Нейрональные GIRK-каналы вовлекаются в регуляцию возбудимости нейрона и могут вносить вклад в создание МПП.

АТФ-зависимые К+-каналы (КАТФ-каналы).

К+-каналы,нечувствительныекМППиуправляемыецитозольнойАТФ,на- зываются КАТФ-каналами. Они были обнаружены в β-клетках поджелудочной железы, где играют ключевую роль в секреции инсулина, в кардиомиоцитах, скелетных и гладкомышечных клетках и некоторых нейронах. КАТФ-каналы обнаружены в адренергических нервных окончаниях крысы, ГАМК-ергических нервных окончаниях черной субстанции среднего мозга (substantia nigra) крысы и холинергических двигательных нервных окончаниях мыши.

ИОННЫЕ КАНАЛЫ

K+- каналы с двумя петлями в домене (two-Ppotassium channels - К2Р). Канал утечки.

Базовая утечка ионов K+ через специализированные пути представляет собой эффективно регулируемый механизм контроля возбудимости клеток. Пути утечки ионов K+, активные в покое, стабилизируют мембранный потенциал нижепорогагенерациивзрывной(пачечной)активностииускоряютреполяризацию. При физиологических условиях (высокая концентрация ионов K+ внутри и низкая снаружи) K2P проводит более значительный ток из клетки, чем внутрь клетки. K2Р-каналы находятся под контролем множества химических и физических стимулов, включая напряжение кислорода, pH, липиды, механические растяжения, нейротрансмиттеры и рецепторы, связанные с G-белком. Каналы также могут быть молекулярными мишенями для некоторых летучих и местных анестетиков. Регуляция K2Р-каналов связана с изменениями в их свойствах, например, вероятности открытия каналов.

НеобычнаячертаK2Р-каналов-организацияихсубъединицы:каждаяимеет две Pпетли и четыре S сегмента.

Рис. 13. Молекулярная организация K2Р-канала. А - одна субъединица К2Р-канала представляет собой α-спираль с четырьмя трансмембранными сегментами, расположенными в цитоплазме N- и C-терминалями, и двумя Р-петлями, формирующими пору. Б - ассоциация двух субъединиц в К2Р-канал. В - объемное изображение К2Р-канала.

Механизмы ионной селективности К+-каналов

Механизмы ионной селективности и проведения ионов через пору канала частично изучены. Когда ионы К+ проходят через селективный фильтр, они

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК

теряют связанные с ними молекулы воды и вместо воды начинают кооперироваться с восемью атомами кислорода карбоксильных групп скелета основной цепи молекулы белка. Меньшие по диаметру ионы Na+, вдобавок имеющие «более тесную рубашку» из молекул воды, не могут эффективно кооперироваться с атомами кислорода и поэтому проходят через K+- канал крайне редко.

Сенсор напряжения. Работа сенсора напряжения была изучена в основном на примере K+-канала. Как полагают в настоящее время, первые четыре сегмента (S1-S4) функционируют как сенсор напряжения, а последние два (S5S6) формируют проводящую пору. В области сенсора напряжения сегмент S4 имеет последовательность из четырех или более остатков аргинина или остатков лизина, причем каждый отделен двумя гидрофобными остатками, которые перемещаются в электрическом поле мембраны при изменении потенциала на мембране.Движениеэтихзаряженныхаминокислотныхостатковбылозарегистрировано экспериментально (так называемый воротный ток).

Модель «весла». После работ группы MacKinnon et al была представлена оригинальная «модель весла», построенная на основе идеи о погруженных в липид сегменте S2 и S1-S2-петли, по которой «весла» сенсора напряжения могут двигаться свободно относительно белкового «тела» канала, расположенного внутри мембраны. В настоящее время она опровергнута.

Гипотеза воротного движения зарядов (Cuello et al). Обычная модель voltage dependent gating устанавливает, что воротные заряды перемещаются через ядро белка трансляцией и/или вращением - ротацией S4-спиралей (сенсор напряжения), которые двигаются независимо от других белковых сегментов в пределах ворот поры, что приводит к открытию или закрытию ворот.

Рис. 14. Гипотеза воротного движения зарядов. Схематическая топологическая модель Cuello et al. в открытоинактивированном состоянии.

1 - топология, как это предложено Cuello et al.

2 - Обычная модель voltage dependent gating.

3 - Модель перемещения S4 в канале, приводящего к открытию или закрытию ворот.

34

ИОННЫЕ КАНАЛЫ

2.2.4. CL- - КАНАЛЫ, ИХ ВИДЫ

Ионы Сl- являются наиболее распространенными вне- и внутриклеточными анионами. Сl-каналы присутствуют в плазматической мембране большинства клеток, играя важную роль в регуляции клеточного объема, трансэпителиального транспорта, секреции секреторных желез, стабилизации МПП. В клетках животных концентрация Cl- в цитоплазме ниже, чем во внеклеточной среде, а равновесный хлорный потенциал находится вблизи МПП.

Виды хлорных каналов:

1)Лиганд-активируемые Сl--каналы: а. ГАМК-активируемые Сl--каналы. б. Глицин-активируемые Сl--каналы.

2)Кальций-активируемые Сl--каналы (СlСа-каналы).

3)Потенциал-активируемые Cl--каналы (ClC).

Лиганд-активируемые Сl-каналы

Лиганд-активируемые Сl--каналы относятся к большому семейству рецепторных канальных молекул. Эти каналы находятся преимущественно в нервной ткани и подразделяются на ГАМК- и глицин-активируемые. Функция всех лиганд-активируемых Cl--каналов похожа - они играют центральную роль в механизмах пре- и постсинаптического торможения.

ГАМК-активируемые Сl--каналы

ГАМК является основным тормозным медиатором в центральной нервной системе. Эффекты ГАМК реализуются через ГАМКА-, ГАМКВ- и ГАМКС–ре- цепторы, из которых ГАМКА и ГАМКС являются ионотропными, то есть формирующие ионный канал.

ГАМКА-рецептор характеризуется быстрой десенситизацией. Активность ГАМКА-каналов может модулироваться оксидом азота (NO), протеинкиназой АипротеинкиназойС.НаработуГАМКА-каналовмогутвлиятьнатуральныеи синтетическиесоединения,втомчислестероиды,барбитураты,этанол,общие анестетики, цинк, пестициды и нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты.

ГАМКС-рецептор характеризуется очень медленной десенситизацией. ГАМКС-каналы были обнаружены в пресинаптических нервных окончаниях сетчатки позвоночных, и по-видимому, участвуют в процессах обработки зрительной информации, модулируя секрецию медиатора в биполярных клетках, где регуляция работы ГАМКС-канала осуществляется при помощи протеинкиназы С через G-белок. Дофамин и активаторы аденилатциклазы селективно уменьшают токи через ГАМКС-каналы.

35

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК

Глицин-активируемые Сl--каналы

Глицин присутствует в ЦНС, являясь тормозным медиатором. Было показано, что глицин ингибирует освобождение медиатора в культуре гранулярных клетокмозжечка.Глицин-активируемыеСl--каналыбылиобнаруженывсинап- тонейросомах различных отделов мозга крысы. Селективным агонистом гли- цин-активируемых каналов является стрихнин.

Сl-Са-каналы

Сl--каналы, активируемые внутриклеточным кальцием, обнаружены во многих клетках, включая эпителиальные, нервные, гладкомышечные, кардиальные, где участвуют в регуляции клеточного объема. В нейронах и мышечных клетках Сl-Са-каналы могут модулировать возбудимость за счет генерации следовых потенциалов. В обонятельных нейронах Сl-Са-каналы участвуют в трансдукции, так как активируются ионами Са2+, входящими через цГМФактивируемые каналы.

Потенциал-активируемые Cl-каналы (ClC)

Указанные каналы присутствуют в возбудимых (скелетная мускулатура) и эпителиальных клетках, в которых они, по-видимому, участвуют в трансэпителиальном транспорте. В зависимости от их распределения в тканях они выполняют ряд функций, например, стабилизации МПП, регуляции клеточного объема. Каналы обнаружены как в плазматической мембране, так и во внутриклеточных органеллах.

2.2.5.КАНАЛЫ СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ

Всинаптических везикулах нервных окончаний были идентифицированы несколько типов ионных каналов, большая часть которых являются неселективными. Некоторые каналы относятся к потенциал-активируемым или Са2+- активируемым. В частности, в мембране синаптических везикул обнаружены Сl--каналы низкой проводимости и неселективные каналы, проводящие ионы К+ и С1-, активирующиеся при изменении МПП и повышении Са2+.

2.2.6.ЛИГАНД-АКТИВИРУЕМЫЕ НЕСЕЛЕКТИВНЫЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ

К ним относятся: каналы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (N-ACh-рецепторов), каналы глутаматных рецепторов (NMDA-рецепторы, AMPA-рецепторы, рецепторы каината), каналы пуриновых рецепторов (Р-рецепторы), каналы серотониновых рецепторов (5-НТ-рецепторов) и др.

2.2.7.МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МЕХАНОСЕНСИТИВНЫХ КАНАЛОВ

Механосенситивность представляет собой универсальное свойство практическивсехклеток.Однако принцип передачи и преобразования механического

ИОННЫЕ КАНАЛЫ

стресса в ответную реакцию клетки до сих пор не ясен. Преобразование механического сигнала в клетке, по-видимому, должно реализовываться через:

•цитоскелет и его механохимические компоненты, такие как актин и тубулин;

•клеточные поверхностные протеины, такие как интегрины;

•механосенситивные (механоуправляемые, механочувствительные) ионные каналы (МСК).

А

Б

Рис.15. Варианты работы механосенситивных каналов.

А. для ионов проходим канал с маленьким отверстием.

Б. для ионов проходим канал с большим отверстием.

МСК отвечают на механический стресс мембраны изменением вероятности открытия канала, они реагируют на давление внутри клетки и открываются, если оно достигает опасного уровня. МСК регистрируют величину давления поизменениямсвойствцитоплазматическоймембраны.Когдамембранарастягиваетсяприбольшомвнутриклеточномдавлении,происходятконформационные изменения, открывающие каналы. У клетки есть несколько типов каналов с различными уровнями критического давления: MscS, или механочувствительный канал малой проводимости, а также MscL, или механочувствитель- ныйканалбольшойпроводимости-включаетсяприоченьтяжелыхситуациях, когда давление достигает величины, которая может «разорвать» клетку (образует пору большего размера: до 30 – 40 Å).

МСК существуют в слуховых клетках, механорецепторах, мышечных веретенах, сосудистом эндотелии и нейросенсорной ткани.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН КЛЕТОК

2.2.8.ВОДНЫЕ КАНАЛЫ (АКВАПОРИНЫ) – НЕИОННЫЕ КАНАЛЫ МЕМБРАНЫ

Аквапорины, или «водные каналы» - неионные каналы мембраны, избирательнопропускаютмолекулыводы,позволяяейпоступатьвклеткуипокидать ее, в то же время препятствуя току ионов и других растворимых веществ. Аквапорины совершенно непроницаемы для заряженных частиц, и это их свойство позволяет сохранять электрохимический мембранный потенциал. Ворота содержат высоко стабильные аргининовые и гистидиновые последовательности, а также две аспарагиновые последовательности, чьи боковые цепи образуют водородные связи с транспортируемой водой. Транспортируемая вода также образует водородные связи с карбониловыми группами главной цепи цистеновой последовательности. Расположение этих водородных связей и узкий диаметр поры в 0.28 нанометра предотвращает прохождение через канал протонов (например, H3O+) или других ионов.

В настоящее время описано 13 видов аквапоринов, которые обнаружены в хрусталике, канальцах и собирательных трубочках почек, легких, экзокринных железах (ПРИЛОЖЕНИЕ 13).

АКТУАЛЬНОСТЬ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

ИОННЫЕ КАНАЛЫ