2 курс / Нормальная физиология / Методические_рекомендации_по_курсу_экспериментальной_физиологии

конечности. Обратите внимание на пропорциональность между интенсивностью стимула и интенсивностью ответной реакции.

Рефлекс отдергивания хвоста.

Поместите крысу в индивидуальную клетку так, чтобы хвост свободно лежал на поверхности стола.

С помощью лупы сфокусируйте солнечные лучи на коже средней трети хвоста. Отметьте время начала действия до ответной реакции в виде сгибания хвоста. Запишите в протокол результаты и сделайте вывод.

Примечание. При постоянных параметрах стимула латентный период реакции используется для измерения болевого порога.

РАБОТА 2. Оценка деятельности продолговатого мозга

Цель работы

Овладеть методами оценки рефлекторной деятельности продолговатого мозга.

Методика работы

Реакция вздрагивания.

Поместите крысу на площадку для наблюдения и подождите, пока она не перестанет двигаться.

Подайте сильный звуковой раздражитель громко, хлопнув ладонями. Опишите в протоколе реакцию крысы и сделайте вывод.

Примечание. При производстве теста обратите внимание на разгибание задних и передних конечностей, выгибание спины, прижатие ушей и закрытие глаз.

Роговичнып рефлекс.

Фиксируйте крысу одной рукой на столе.

Сверните в жгут кусочек ваты и осторожно прикоснитесь к роговице глаза. Опишите в протоколе ответную реакцию век и ее длительность. Сделайте вывод.

Качание головой.

Возьмите животное за кожу пояснично-крестцовой области. Поверните тело животного сначала влево, а затем вправо. Наклоните вниз, а затем вверх, Сделайте вывод.

РАБОТА 3. Оценка деятельности моста (варолиева моста) и среднего мозга

Цель работы

Освоить методику исследования функции моста и среднего мозга.

Методика работы

Рефлекс переворачивания.

Положите крысу на спину на стол и отметьте ответную реакцию. Положите крысу на спину, а голову фиксируйте рукой. Опишите ответную

реакцию.

Возьмите крысу, поднимите на высоту около 40 см и бросьте вверх лапами на мягкую поверхность. Занесите в протокол характер приземления животного.

Сделайте общий вывод по всем трем тестам.

Зрачковый рефлекс.

Возьмите крысу и зафиксируйте ее в руке. С помощью лупы отметьте диаметр зрачка.

Направьте свет от ручного фонаря на другой глаз. Отметьте изменение диаметра зрачка исследуемого глаза. Запишите изменения в протокол. Сделайте вывод.

РАБОТА 4. Оценка функционального состояния коры головного мозга

Цель работы

Освоить неврологические тесты функционального состояния коры головного мозга.

Методика работы

Реакция постановки лапки на опору.

Поднимите крысу и передвигайте горизонтально так, чтобы тыльная сторона передних конечностей коснулась края стола. Животное ответит постановкой передней лапы на поверхность стола.

Поднимите крысу так, чтобы при опускании она коснулась подбородком края стола. Животное ответит постановкой обеих передних лап на стол рядом с подбородком.

Держите крысу на краю стола и сдвиньте одну переднюю или заднюю лапу так, чтобы она свешивалась с края стола. Лапа немедленно должна подтянуться на поверхность стола.

Держите крысу за хвост и опустите вниз, пока вибриссы не коснуться края стола. Крыса поднимает голову и подвигает лапы к столу.

Держите крысу за хвост и опускайте вниз, но так, чтобы вибриссы не касались края стола и могли использоваться только зрительные рецепторы. Животное попытается схватиться за край стола, как только окажется в пределах досягаемости.

Тест для исследовании равновесия.

Поместите крысу на деревянный брусок диаметром 2 см и длиной 30 см, закрепленный на высоте 50 см над полом. Животное должно просидеть на бруске более 3 минут.

Запишите в протокол результаты и сделайте соответствующие выводы. Примечание. Для более глубокого закрепления данного материала, используя учебники по анатомии и физиологии человека, опишите и зарисуйте рефлекторные дуги для каждого из рефлексов.

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Батуев А.С, Никитина И.П., Журавлев В.Л., Соколова Н.Н. Малый практикум по физиологии человека и животных. СПб: Изд-во С.- Петербургского ун-та, 2001. 348 с.

Большой практикум по физиологии человека и животных: Учеб. пособие для вузов /И.П.Баскова, Г.С.Ипполитова, П.А.Келарева и др.; под ред. Б.А.Кудяшова. М: Высш. шк., 1984. 407 с.

Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высш. шк., 1991. 399 с.

Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А., Западнюк Б.В. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. Киев, 1983.

Ноздрачев А.Д., Баженов Ю.И. и др. Начала физиологии: Учебник для вузов/ Под ред. акад. А.Д. Ноздрачева, СПб., 2001. 385 с.

Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы: лабораторные животные/ Под ред. акад. А.Д. Ноздрачева. СПб.: Изд-во «Лань», 2001. 464 с.

Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л., Гнетов А.В. Исследование функций головного мозга: некоторые современные методы. Учебн. Пособие. Л.:Изд-воЛГУ, 1987. 160 с.

Руководство к практическим занятиям по физиологии человека и животных: Учеб. пособие / Под. Ред. И.П. Ашмарина, А.А.Каменского, Г.С.Суховой. - 2-е изд., перераб и доп.-М.: Изд-во МГУ, 2004. - 256 с.

Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О., Оникиенко Ф.А. Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте. М.: «Медицина», 1978. 176 с.

Фифкова Е., Маршала Дж. Стереотаксические атласы кошки, кролика и крысы./В кн.: Буреш Я., Петрань М., Захар И. Электрофизиологические методы исследования. М., 1962, с. 384-426.

Экспериментальная физиология: Практикум по физиологии / Пер. с англ. Каменской М.А.. М.: Мир, 1974. 350 с.

ПРАВИЛА ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

(Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755)

1.Настоящие Правила регламентируют все виды использования экспериментальных животных в медико-биологической практике: для научного эксперимента, в целях обеспечения учебного процесса, биологического тестирования, в ходе изготовления вирусных, бактерийных и других препаратов.

2.Правила имеют целью:

-повышение качества научных и других видов работ с животными;

-обеспечение принципов гуманного обращения с животными;

-упорядочение системы планирования и отчетности в области организации экспериментальной работы и совершенствовании лабораторного животноводства.

3.Право на использование животных имеют научно-исследовательские, лечебные и учебные учреждения, санэпидстанции и учреждения по производству бактерийных, вирусных и других препаратов.

4.Учреждения могут проводить работу с животными в том случае, если они имеют:

виварий (экспериментально-биологическую клинику), оборудованный согласно Санитарным правилам от 06.04.73 № 1045-73;

экспериментальную лабораторию, оборудованную согласно требованиям (приложение № 1);

штат сотрудников, обеспечивающий уход за животными и выполняющий требования гуманного обращения с ними (приложения №№ 2, 3, 4).

5.К работе с экспериментальными животными допускаются лица, имеющие высшее медицинское, ветеринарное, зоотехническое, фармацевтическое или биологическое образование, разрешение на право использования животных и несущие ответственность за соблюдение Правил.

6.Лица, имеющие среднее медицинское, ветеринарное, или зоотехническое образование (а в учебных учреждениях и студенты) и знакомые с настоящими Правилами, допускаются к проведению несложных и неболезненных процедур на животных, без получения персонального разрешения, но под контролем ответственного лица и под его ответственность, за исключением персонала предприятий по производству бактерийных и вирусных препаратов.

7.За подготовку экспериментатора к работе с животными и за соблюдение Правил использования животных в целом несет ответственность руководитель кафедры

(отдела, лаборатории, кабинета), в которых работает лицо, допущенное к эксперименту на животных.

8.При представлении в печать данных о результатах исследований, выполненных с использованием экспериментальных животных, учреждения и отдельные лица обязаны указывать сведения об использовании животных (вид, количество, тип применявшегося обезболивания и т. д.).

9.Все процедуры на животном, которые могут вызвать у него боль или иного рода мучительное состояние, проводятся при достаточном обезболивании (под местной анестезией или наркозом), кроме случаев использования животных для получения биологических препаратов, их контроля в иммунологических исследованиях (Приложение № 3). Опыты с применением миорелаксантов, которые не являются обезболивающими средствами, во всех случаях проводятся при полном обезболивании.

10.Запрещается использование животного для болезненных процедур более чем один раз, кроме животных, используемых для контроля биологических препаратов, в их

производстве, животных-доноров и при изучении схем иммунизации.

При необходимости повторных опытов такого рода вопрос должен обсуждаться на ученом совете института и проведение эксперимента – санкционировано решением Комиссии по экспериментальной работе (союзной или республиканской).

11.При проведении экспериментов и других процедур в условиях повышенного риска нанесения животному болезненных раздражений (травма в затруднительных условиях наблюдения за клинической картиной состояния животного, обездвижение животного, выполнение процедур на животных малоопытными лицами, (например, студентами) строго обязательно присутствие лица, ответственного за исполнение животного и контроль с его стороны за сохранением адекватного обезболивания.

12.В послеоперационном периоде животное должно получать квалифицированный уход и адекватное обезболивание.

13.Животное, которое осталось после эксперимента или другой процедуры искалеченным или нежизнеспособным должно быть своевременно умерщвлено с соблюдением всех требований гуманности.

14.Эвтаназия, т.е. гуманное умерщвление животного, производится ответственным лицом или под его непосредственным наблюдением при соблюдении всех требований гуманности, в соответствии с требованиями (приложение № 4).

15.Уборка трупа животного может производиться только после того, как смерть будет констатирована лицом, ответственным за работу с животным.

16.Ответственность за нарушение Правил проведения работ с использованием животных несут руководители учреждений, где проводятся эксперименты, и лица, специально выделенные для проведения этой работы.

17.Нарушение Правил гуманного обращения с животными и проведение экспериментов в условиях, ставящих под сомнение научную достоверность полученных данных, может повлечь за собой в установленном порядке применения к виновным лицам мер дисциплинарного воздействия, а также запрещения научных публикаций, защиты

диссертационных работ и запрещения дальнейшего использования экспериментальных животных в научных и учебных целях.

Приложение № 1

ОБОРУДОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Обязательными условиями организации экспериментальной лаборатории являются следующие:

1.Наличие специального помещения для проведения экспериментов, где поддерживается нормальная температура, имеется адекватное освещение и вентиляция. Помещение должно быть изолировано от сильных шумов.

2.В помещении для проведения экспериментов (лаборатории) должен находиться запирающийся шкаф для хранения медикаментов, инструментария и документации.

Лаборатория должна иметь:

инструменты: иглы, шприцы для инъекций – в соответствии с размерами животных, термометр и т.д.;

набор медикаментов – для обезболивания и умерщвления в обязательном порядке, – и прочие виды медикаментов, в зависимости от характера проводимых экспериментов;

вспомогательные принадлежности для доставки животного (поводки, носилки, ящики и пр.), для фиксации животного (мягкие повязки, намордники (снимаются после дачи наркоза) и пр.

3. В случаях, когда эксперимент требует обезболивания животного, экспериментальная лаборатория должна иметь дополнительный минимум необходимого оборудования:

стол для фиксации животного,

осветительное устройство,

наркозно-дыхательная аппаратура,

хирургический инструмент (скальпели, иглы – в соответствии с размерами животного) и пр.,

медикаменты для премедикаций, обезболивания животного в ходе операции, обезболивания животного в послеоперационном периоде.

Приложение № 2

УХОД ЗА ЖИВОТНЫМИ В ВИВАРИИ

(экспериментально-биологической клинике)

1.Условия содержания животного в виварии должны обеспечивать для него нормальный биологический фон.

2.Важнейшим условием этого является:

содержание животного в вентилируемом, освещенном, отапливаемом помещении;

обеспечение его водой для питья и нормальным питанием;

своевременная уборка помещения.

В виварии недопустимы громкие разговоры, шум.

3.Санитарно-гигиенические требования к помещению вивария изложены в соответствующих разделах Санитарных правил.

4.Кормление и водопой животных должны производиться в строгом соответствии с действующим приказом. (Приказ № 163 от 10 марта 1966 г. Министра

здравоохранения СССР).

На кормкухне вивария должны быть вывешены нормы кормления животных и выход продуктов (в том числе и вареных кормов) для животных всех видов, содержащихся в виварии, а также указание часов, в которые производится кормление и смена воды в поилках.

Выдача кормов должна производиться заведующим складом (фуражором) с веса. Каждый рабочий обязан расписываться в журнале за полученные им корма. Выдаваемые корма должны отвечать нормам по весу, ассортименту и качеству. Во всех клетках должны находиться постоянно неопрокидывающиеся поилки со свежей водой. Режим кормления в выходные и праздничные дни должен быть таким же, как в будни.

5. Размер клеток для экспериментальных животных (кроме обезьян) определен в соответствующем разделе Санитарных правил, но он должен обеспечивать животному свободное передвижение. Мелких обезьян (макаки и др.) следует содержать по одной в клетках с прижимным устройством размером не менее чем 1,5 x 1,5 x 1,5 м. Крупные обезьяны содержатся в комнатах-вольерах. Температура воздуха в помещении для обезьян должна быть не ниже +25 град. С. Собаки в хроническом эксперименте должны выводиться из клеток для выгула.

Приложение № 3

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ПРОЦЕДУР НА ЖИВОТНЫХ

I.Подготовка животного к эксперименту

1.В период введения в эксперимент животное должно адаптироваться к обстановке лаборатории и привыкнуть к экспериментатору.

2.При доставке в лабораторию крупных животных запрещается применение силовых или болезненных приемов. В случае агрессивных или истеричных животных можно сделать предварительную премедикацию с помощью безыгольных инъекторов с удлиненной насадкой.

3.Мелких животных (грызунов и пр.) следует брать осторожно, применять корнцанги только с резиновыми насадками, не сжимать животных сильно руками, что причиняет животным травмы и боль. (См. О.Н. Елизарова и соавт. Пособие по токсикологии для лаборантов. М., 1974). Запрещается оставлять животных в ожидании эксперимента больше, чем это необходимо для проведения премедикации.

5.Запрещается переносить мелких животных по холоду в неутепленных клетках.

II.Премедикация. Фиксация животного

1.Премедикация проводится ответственным за работу с животным лицом или под его наблюдением.

2.Если животное испугано или состояние наркоза наступает не сразу, экспериментатор должен ждать, пока животное не успокоится или не заснет.

3.Животное можно фиксировать только после того, как подействует наркоз.

4.При проведении процедур, которые требуют иммобилизации бодрствующих животных, разрешается привязывать животное к лабораторной доске только на непродолжительное время. Для иммобилизации животного на продолжительное время следует применять ящики-домики и щитки-ошейники.

5.После фиксации собак с них снимаются повязки-намордники.

6.Повязки на конечностях животного должны быть мягкими, не препятствовать кровообращению; животному не должна быть придана неудобная поза с вывернутыми конечностями.

7.При помещении бодрствующего животного в стереотаксический аппарат необходимо провести местное обезболивание участков головы, подвергающихся сдавлению.

III.Обезболивание

1.После дачи животному наркоза необходим постоянный контроль со стороны экспериментатора (или анестезиолога) за уровнем наркоза. При использовании

миорелаксантов рекомендуется систематическое выведение животного из состояния обездвижения для проверки уровня наркоза. При первых признаках ослабления наркоза он должен быть углублен. Запрещается применение средств, препятствующих контролю за уровнем наркоза: афонии, завязывания морды и т.д.

2.Все эксперименты с нанесением животному болезненных ощущений, включая эксперименты по изучению шока, должны проводиться с отключением сознания у животного. Допускается нанесение пороговой боли при изучении механизма боли и влияния на организм анальгетиков и анестетиков. Порог боли определяется индивидуально для каждого животного; критерием возникновения порогового болевого ощущения следует считать реакцию избегания: отдергивание конечности, перемену места, прыжок. Нанесение болевых раздражений, вызывающих голосовую и активную двигательную (оборонительную) реакции запрещается. Пороговые болевые раздражения наносятся в условиях свободного поведения животного. Наносимая пороговая боль должна быть непродолжительной. Развитие стрессовых состояний у животного в результате болевых раздражений и других мучительных состояний недопустимо.

3.При биологическом тестировании и производстве медико-биологических препаратов все процедуры проводятся в условиях щажения животного; болезненные процедуры при маркировке животных (отрезание ногтевых фаланг и др.), при взятии крови, при воздействии на слизистую глаза и т. д. должны проводиться под местной анестезией или другого рода обезболиванием.

4.Дозы и время введения препаратов должны фиксироваться в соответствующих документах (протокол эксперимента).

IV. Уход за животными в послеоперационном периоде

1.При доставке животного в клетку после операции должны использоваться удобные носилки, исключающие нанесение животному травм, сдвигания повязок. В случае применения миорелаксантов и искусственного дыхания животное должно оставаться в лаборатории до полного восстановления дыхания. Грызуны, получившие травмы, например, при взятии крови из хвоста, отсаживаются в отдельную клетку во избежание покусов.

2.Животное в хроническом опыте должно быть помещено в удобную клетку, облегчающую также условия наблюдения и ухода за животным. С момента появления у животного болей, оно должно получать седативные и обезболивающие препараты. Животное должно получать квалифицированный уход под контролем экспериментатора.

3.После особо сложных и ответственных операций рекомендуется первые сутки устанавливать круглосуточное дежурство около животного.

4.Состояние животного и назначения препаратов должны отмечаться в протоколе эксперимента.

Приложение № 4

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ЭВТАНАЗИИ

(УМЕРЩВЛЕНИЯ ЖИВОТНОГО)

1.Гуманным умерщвлением животного (эвтаназией) называется быстрое и безболезненное умерщвление животного, не сопровождающееся у него чувством тревоги и страха.

2.Животное должно получать адекватный уход (анестетики, питание, поение и т. п.) вплоть до самого момента его умерщвления.

3.Умерщвление животных не должно производиться в помещении, где содержатся животные, запрещается умерщвлять одних животных на глазах у других.

4.В острых опытах животное должно умерщвляться до прекращения действия наркоза. Во всех случаях животное должно умерщвляться своевременно – до наступления у него болезненных состояний.

5.Оптимальным и универсальным методом умерщвления животных является передозировка наркоза – введение анестетика в летальной дозе (дозировка для наркоза Х 3).

6.При соблюдении этих условий допустимо умерщвление животного другими методами:

мелких животных: мышей, крыс, лягушек, птиц и т.д. – путем декапитации;

кроликов – путем воздушной эмболии;

крупных животных: взрослых собак, свиней и пр. – с помощью пропускания электрического тока, при этом электроды вводятся в область продолговатого мозга и в область крестца.

7.При необходимости изучать ультраструктуру мозга применяются мгновенные методы эвтаназии (например, мгновенное замораживание при погружении животного в жидкий азот). Использование в этом случае электротока недопустимо.

Если предусматривается морфологический анализ тканей мозга с использованием светового микроскопа, то для эвтаназии должны применяться анестетики.

8.Допускается умерщвление животных, используемых в производственных целях, путем обескровливания. При этом может быть подобран метод обезболивания, отличный от фармакологического воздействия.

9.При проведении эксперимента с применением миорелаксантов допускается умерщвление животного путем отключения искусственного дыхания, но лишь в условиях сохранения адекватного наркоза.

10.Допускается умерщвление мелких животных с помощью ингаляционного наркоза без предварительного введения других видов анестетиков. Наиболее пригодным