2 курс / Нормальная физиология / ВИРТУАЛЬНЫЙ_ПРАКТИКУМ_ПО_НОРМАЛЬНОЙ_ФИЗИОЛОГИИ

15.Теперь нажмите кнопку «Очистить», на весовой площадке, чтобы удалить бумагу для взвешивания и матку.

16.Зарегистрируйте полученные результаты и ответьте на поставленные вопросы в своем отчете.

Насколько вес матки у контрольной крысы отличается от веса матки в эксперименте? ___________________________________

Какое заключение можно сделать о влиянии введения эстрогена на экспериментальное животное? __________________________

Каким может быть эффект, если ввести тестостерон, вместо эстрогена? Объясните ответ. _____________________________

Теоретическая часть

Инсулин и диабеты

Инсулин продуцируется β-клетками эндокринной части поджелудочной железы. Он является жизненно важным для регуляции уровня глюкозы в крови, так как дает возможность клеткам тела абсорбировать глюкозу из кровеносного русла. Глюкоза из крови попадет в клетки (обычно печени и мышц), где ее избыток используется для формирования гликогена (животный крахмал). Подсчитано, что 75% глюкозы, потребленной с пищей, хранится именно таким образом. Организм поддерживает определенный уровень глюкозы в крови, тем самым сохраняя клетки нервной системы, питание которых может осуществляться только глюкозой.

Когда уровень глюкозы в крови падает ниже определенного уровня, α-клетки поджелудочной железы начинают продуцировать глюкагон. Миссия этого гормона заключается в том, чтобы разрушить сохраняемый гликоген до глюкозы, освобождая ее в кровь.

Когда инсулин не продуцируется поджелудочной железой, развивается сахарный диабет I типа. Когда инсулин продуцируется поджелудочной железой, но организм утрачивает ответ к нему, развивается сахарный диабет II типа. В любом случае глюкоза остается в кровеносном русле, так как клетки тела неспособны захватывать ее. Избыток глюкозы в крови фильтруется почками. Хотя в повторный захват фильтрованной глюкозы вовлекается конечное число рецепторов почечных клеток, определенный избыток глюкозы не будет повторно абсорбироваться

91

https://t.me/medicina_free

(реабсорбироваться) в организм и будет выводиться в мочу. Недостаток инсулина для транспорта глюкозы влияет на мышцы, а результатом является изменение белкового метаболизма мышечных клеток. При этом свободные аминокислоты могут формировать глюкозу в печени. Это приводит к отрицательному азотистому балансу организма из-за белкового истощения и опустошения тканей, а с этим связаны слабая резистентность к инфекциям.

В следующем эксперименте Вы должны изучить эффекты введения инсулина при диабете I типа. Эксперимент состоит из двух частей. В первой части Вы будите получать стандартные кривые глюкозы. Во второй части Вы будите сравнивать уровни глюкозы нормальной крысы с уровнем глюкозы крысы с диабетом, а затем сравнивать их после введения каждой крысе инсулина.

Практическая часть

Работа № 6. Получение стандартной кривой глюкозы

Для начала выберите раздел «Инсулин и диабет – часть I» из меню «Эксперимент» (рис. 21). Выберите «balloons on» из меню «Помощь» для того, чтобы определить и просмотреть необходимое оборудование на экране. С правой стороны открывшегося экрана находится спектрофотометр, являющийся одним из наиболее широко используемых приборов в биологии. Он необходим для измерения количества разных по длине световых волн, абсорбируемых и пропускаемых через пигментные растворы. Внутри спектрофотометра находится источник белого света, который подразделяется на разные длины волн (или цвета) а помощью призмы. Пользователь должен выбрать длину волны (цвет волны). Световая волна определенного цвета пропускается через кювету, содержащую тестируемый образец (для этого эксперимента световой источник спектрофотометра должен быть установлен на длину волны = 450 нм). Затем свет, пропускаемый через тестируемый образец, проходит к фотоэлектрическому элементу, который конвертирует световую энергию в электрический ток, измеряемый прибором. Световую волну можно измерить также до того, как проба будет помещена в световой поток, а количество света, абсорбированного раствором (называется оптической плотностью), можно затем измерить. Используя любой из

92

https://t.me/medicina_free

этих методов изменения в световом прохождении или световой абсорбции, можно измерить количество исследуемой субстанции в тестируемой пробе.

Во II части Вы, используя спектрофотометр, будите определять, сколько глюкозы присутствует в образцах крови, взятой от двух крыс. Но, до того, как Вы будете делать это, Вы должны получить стандартную кривую глюкозы, чтобы иметь точки сравнения для результатов изменяющейся оптической плотности глюкозы (измеряется в мг/децилитр). Прежде всего, Вы должны приготовить тест-пробирки с известным содержанием глюкозы: 30 мг/децилитр, 60, 90, 120, и 150 соответственно.

Рис. 21. Экран работы «Получение стандартной кривой глюкозы»

Теперь на спектрофотометре надо определить показатели соответствующей оптической плотности для каждой концентрации глюкозы. Эта информация используется для выполнения работы «Сравнение уровней глюкозы до и после введения инсулина» (часть II).

93

https://t.me/medicina_free

На экране можно видеть три капельницы, прибор для промывания тест-пробирок, распределитель тест-пробирок (сверху прибора для промывания пробирок) и прибор с ячейками для тестпробирок, в котором пробы подготавливаются для анализа.

Ход работы:

1.Щелкните «мышкой» и переместите тест-пробирку из распределителя, (находится в верхней части прибора для промывания пробирок) в ячейку 1 инкубатора. Затем из распределителя

винкубатор перемещаются все остальные тест-пробирки, в соответствующие ячейки (всего 5 проб).

2.Теперь щелкните «мышкой» и удерживайте ее на колпачке капельницы с надписью: «Стандарт глюкоза». Переместите колпачок капельницы, поместив его над тест-пробиркой № 1. Освободите кнопку мышки, чтобы переместить раствор глюкозы

впробирку. Вы можете видеть, что одна капля раствора глюкоза перемещается (закапывается) в тест-пробирку, и колпачок капельницы автоматически возвращается к бутылочке со стандартом глюкозы.

3.Повторите этап 2 с оставшимися 4 тест-пробирками. Обратите внимание, что каждая последующая пробирка будет автоматически получать из дозатора одну дополнительную каплю стандарта глюкозы (например, пробирка № 2, будет получать 2 капли, пробирка № 3 будет получать 3 капли, пробирка № 4–4 капли и так далее).

4.Щелкните кнопкой мышки и удерживайте ее на колпачке капельницы с обозначением «Деионизированная вода». Переместите колпачок капельницы и установите его над пробиркой № 1. Освободите кнопку мышки, распределяя воду в пробирку. Обратите внимание, что 4 капли воды автоматически добавляются в первую пробирку.

5.Повторите этап 4 с пробирками 2, 3 и 4. Помните, что на этом этапе в каждую последующую пробирку надо добавлять на одну каплю воды меньше, чем в предыдущую пробу (например, в пробирку № 2 – три капли, в пробирку № 3 – две капли, в пробирку № 4 – одну каплю). В пробирку № 5 воды не добавляют.

6.Щелкните по кнопке «Смешать» на панели инкубатора, чтобы смешать содержимое пробирок.

94

https://t.me/medicina_free

7.Теперь щелкните по кнопке «Центрифугировать», при этом пробы опустятся в инкубатор и будут подвергнуты центрифугированию. Когда пробирки центрифугируются, они подвергаются вращению вокруг центральной оси на высокой скорости,

ивсе частицы внутри пробы, будут осаждаться на дне пробирки, образуя, так называемый, осадок.

8.Когда пробы вновь появятся на поверхности инкубатора, щелкните кнопкой «Удалить осадок». При этом пробы будут очищены от каких-либо осажденных при центрифугировании частиц.

9.Щелкните и удерживайте кнопку мышки на колпачке капельницы с этикеткой «Энзим – цветной реагент». Переместите колпачок капельницы в положение над отверстием пробы № 1. Когда Вы освободите мышку, то увидите, что 5 капель реагента будут добавлены в пробу, и что ограничитель вернется к капельнице.

10.Повторите этап 9 для оставшихся проб.

11.Теперь щелкните кнопкой «Инкубировать». Пробирки будут опущены в инкубатор, в это время содержимое пробирок подвергается полному смешиванию с цветным реагентом. После этого пробирки вновь возвращаются на поверхность.

12.Используя мышку, щелкните на клавишу «Установить» находящуюся на спектрофотометре. Это будет соответствовать включению инструмента и подготовке его для работы. В этом случае клавиша «Установить» включает в себя также установку нулевой точки, чтобы спектрофотометр точно показывал количество вещества, содержащегося в каждой пробе.

13.Сделайте щелчок и переместите пробу № 1 к спектрофотометру (справа, выше клавиши «Установить»), после этого освободите кнопку мышки. Проба будет помещена на указанное место.

14.Щелкните кнопку «Анализировать». Вы видите, на экране появляются значения оптической плотности и содержания глюкозы.

15.Щелкните кнопкой «Зарегистрировать результат», около табло сбора данных эксперимента.

16.Щелкните кнопкой мышки и переместите пробу в ячейку для тест-пробирок.

17.Повторите этапы 13–16 для оставшихся тест-пробирок.

95

https://t.me/medicina_free

18.Когда все пять пробирок будут проанализированы, щелкните по кнопке «График». Вы получите график стандарта глюкозы, который будите использовать в части II эксперимента.

19.Зарегистрируйте полученный результат в своем отчете.

Работа № 7. Сравнение уровней глюкозы до и после введения инсулина

Выберите работу «Инсулин и диабет «часть II» в меню «Эксперимент».

Экран, который откроется, сходен с экраном для работы (часть I) «Получение стандартной кривой глюкозы» (рис. 22). Обратите внимание, что крысы в клетках находятся в левой части экрана. Одна из крыс будет служить контролем, а другая будет являться экспериментальным животным.

Рис. 22. Экран работы «Сравнение уровней глюкозы до и после введения инсулина»

Рядом с крысами находятся три шприца, которые содержат инсулин, физиологический солевой раствор и аллоксан соответ-

96

https://t.me/medicina_free

ственно. Аллоксан является препаратом, который при введении животным селективно уничтожает все панкреатические β-клетки, продуцирующие инсулин, что ведет к развитию диабета.

В этом эксперименте Вы будите проводить инъекции контрольной крысе физиологического раствора, а экспериментальной крысе – аллоксана (в реальном эксперименте такие инъекции проводятся ежедневно в течении недели). После введения указанных препаратов, Вы получите пробы крови от двух крыс. После этого Вы проведете инъекции инсулина этим крысам и вновь получите пробы крови. Теперь необходимо проанализировать все 4 пробы и провести измерения на спектрофотометре (смотри работу «Получение стандартной кривой глюкозы»), чтобы сравнить количество глюкозы, присутствующей в пробах.

Ход работы:

1.Щелкните мышкой и переместите шприц с физиологическим солевым раствором к контрольной крысе, освободите кнопку мышки для того, чтобы провести инъекцию животному.

2.Щелкните мышкой и переместите шприц с аллоксаном к экспериментальной крысе, освободите кнопку мышки для того, чтобы провести инъекцию животному.

3.Щелкните мышкой и переместите чистую новую пробирку от распределителя пробирок к хвосту контрольной крысы. Освободите кнопку мышки, это будет соответствовать взятию крови из хвостовой вены у крысы. Вы будите наблюдать, как три капли крови поступят в пробирку с хвоста крысы. Теперь щелкните мышкой и переместите пробу в держатель № 1 инкубатора.

4.Щелкните мышкой и переместите следующую пробирку из распределителя к хвосту экспериментальной крысы, после чего вновь освободите кнопку мышки для взятия крови из хвостовой вены. Далее с помощью мышки переместите пробирку в гнездо № 2 инкубатора.

5.Щелкните мышкой и переместите шприц с инсулином к контрольной крысе, освободите кнопку мышки, чтобы произвести инъекцию.

6.Повторите этап 5 с экспериментальной крысой.

7.Повторите этап 3 и 5, получая пробы от каждой крысы и помещая их в гнездо держателя № 3 и № 4, соответственно.

97

https://t.me/medicina_free

8.Щелкните кнопкой «Получить реагенты», расположенной над шприцами. При этом изображение крыс и шприцов исчезнет,

апоявится четыре капельницы.

9.Теперь щелкните мышкой и удерживая кнопку на этикетке капельницы «Деионизированная вода». Переместите колпачок капельницы к пробирке № 1. Освободите кнопку мышки, чтобы

перераспределить содержание капельницы в пробу (при этом 5 капель воды будут добавлены к пробе). Вода будет добавляться

кпробе так, чтобы все пробы имели одинаковый объем.

10.Повторите этап 9 для оставшихся тест-пробирок.

11.Щелкните кнопкой мышки и удерживая ее на капельнице с этикеткой «Гидроксид бария». Переместите колпачок капельницы к отверстию пробирки № 1. Освободите кнопку мышки, при этом пять капель раствора будут добавлены к пробе (гидроксид бария используется для очистки белков, клеток и получения чистой глюкозы).

12.Повторите этап 11 для оставшихся тест-проб.

13.Щелкните кнопкой мышки и удерживая ее на капельнице с этикеткой «Гепарин». Смещая мышку вниз, переместите колпачок капельницы к отверстию пробирки № 1. Освободите кнопку мышки, для распределения реагента из капельницы в пробу. Гепарин является антикоагулянтом, который предотвращает кровь от свертывания.

14.Повторите этап 13 для оставшихся тест-пробирок.

15.Щелкните кнопкой «Смешать», находящейся на панели инкубатора, чтобы смешать содержимое проб.

16.Теперь щелкните кнопкой «Центрифугировать». При этом пробирки будут погружены в инкубатор, подвергнуты центрифугированию, а затем вновь появятся на поверхности.

17.Щелкните кнопкой «Удалить осадок», чтобы удалить

осадок.

18.Щелкните кнопкой мышки, удерживая ее на капельнице с этикеткой «Энзим – цветной реагент». Переместите колпачок капельницы к пробе № 1. Освободите кнопку мышки для перераспределения реагента.

19.Повторите этап 18 с оставшимися тест-пробами.

20.Щелкните клавишей «Инкубировать» более одного раза. Пробы будут опускаться в инкубатор, а затем вновь появляться на поверхности.

98

https://t.me/medicina_free

21.Щелкните кнопкой «Установить» на панели спектрофотометра. Это способствует включению инструмента и готовит его

кизмерению.

22.Щелкните клавишей «Построить график стандартной кривой глюкозы», при этом на мониторе появится график эксперимента из работы «Получение стандартной кривой глюкозы» (часть I).

23.Щелкните мышкой и переместите пробирку № 1 к спектрофотометру, затем освободите кнопку мышки. При этом пробирка будет установлена на место.

24.Теперь щелкните кнопкой «Анализировать». На экране монитора появится горизонтальная линия и значение оптической плотности на дисплее.

25.Переместите с помощью мышки красную вертикальную линию, в дальнем правом углу монитора спектрофотометра, над местом, где горизонтальная линия (24 этап работы) пересекает линию стандарта глюкозы. Наблюдайте, что происходит с дисплеем глюкозы, когда Вы передвигаете эту линию влево.

Каково значение глюкозы в той точке, где горизонтальная линия пересекает линию стандарта глюкозы?

Тест-пробирка № 1: ______________ мг/децилитр глюкозы.

26.Щелкните кнопку «Зарегистрировать результат» рядом с табло сбора результатов.

27.Теперь щелкните мышкой и переместите тест-пробирку из спектрофотометра в мойку для пробирок, после этого щелкните кнопкой «Очистить» под экраном осциллографа.

28.Повторите этапы 22–27 для оставшихся тест-пробирок. Запишите результаты для каждой пробы:

Тест-пробирка № 2: ________ мг/децилитр глюкозы Тест-пробирка № 3: ________ мг/децилитр глюкозы Тест-пробирка № 4: ________ мг/децилитр глюкозы

29.Зарегистрируйте полученные результаты и ответьте на поставленные вопросы в своем отчете.

Каким является уровень глюкозы в тест-пробирке № 1 по сравнению с уровнем глюкозы в тест-пробирке № 2? Не забывайте, что проба № 1 содержит образец от контрольной крысы (с инъекцией физиологического солевого раствора) и что проба № 2 содержит образец от экспериментальной крысы (с инъекцией аллоксана) ______________________________________________

99

https://t.me/medicina_free

Дайте объяснение полученным результатам: _________________

При каких условиях аллоксан оказывает свое действие у экспериментальной крысы? ____________________________________

Каким является уровень глюкозы в тест-пробе № 3 по сравнению с уровнем пробы № 1? _____________________________________

Дайте объяснение этому результату: _______________________

Каким является уровень глюкозы в тест-пробирке № 4, по сравнению с пробой № 2? ______________________________________

Дайте объяснение этому результату: _______________________

Каков эффект введения инсулина контрольному животному? __ Каков эффект введения инсулина экспериментальному животному? ___________________________________________________

100

https://t.me/medicina_free