2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Молекулярный_и_генетический_анализ_некоторых_семейств_гликозил_гидролаз

генами scrK и scrA. В пользу общего происхождения локусов утилизации сахарозы

Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus и Streptococcus свидетельствует как их структурное сходство, так и высокая гомология образующих их генов. Принимая во внимание более высокую гомологию генов scrB L. plantarum и P. pentosaceus (98.6%), чем генов 16S рРНК этих организмов (94.4%), можно сделать предположение о недавнем горизонтальном переносе локуса утилизации сахарозы Lactobacillus в штаммы P. pentosaceus. Подобное предположение согласуется с плазмидной локализацией детерминантов утилизации сахарозы у Pediococcus.

Генетическое картирование α-галактозидазных генов семейства MEL1-MEL11 в

теломерах дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Материалом для картирования генов MEL2-MEL10 служили гаплоидные линии, содержащие по одному различному гену MEL и маркеры: MATa, ura3, ade2 и lys2. Рекомбинационная маркировка моногенных линий MEL2-MEL10 ауксотрофными мутациями проведена с помощью штамма YP1, обладающего соответствующими мутациями. Для локализации генов MEL использовали теломерные тестеры, у которых была мутация ura3, а маркер URA3 интегрирован в разных штаммах во все концы хромосом. Результаты картирования приведены в Таблице I. Они подтверждают ранее известные данные (Turakainen et al. 1993) о том, что гены MEL расположены в концевых районах хромосом и тесно сцеплены с теломерами. В тех случаях, когда маркеры MEL и URA3 были на одном и том же конце хромосомы все тетрады были родительского дитипа: 2Mel+Ura-:2Mel-Ura+. Если гибрид содержал маркеры MEL и URA3 в разных плечах одной хромосомы, все три типа асков (родительского и неродительского дитипов и тетратипа) обнаруживались в соотношении близком к 1:1:4 соответственно.

Результаты работы доказывают, что гены MEL этого семейства располагаются как в левых (L), так и в правых (R) плечах в разных хромосомах: ген MEL2

картирован в VII L, MEL3 – в XVI L, MEL4 – в XI L, MEL5 – в IV L, MEL6 – в XIII R, MEL7 – в VI R, MEL8 – в XV R, MEL9 – в X R и MEL10 – в XII R. Известно, что ген

Таблица I. Мейотическая сегрегация генов MEL2-MEL10 и MEL12-MEL14 с маркером URA3, интегрированным ((TG1-3)::URA3) в правые и левые теломеры различных хромосом дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Примечание. PD, ND и T – тетрады родительского дитипа (2Mel+Ura-:2Mel-Ura+), неродительского дитипа (2Mel+Ura+:2Mel-Ura-) и тетратипа (1Mel+Ura+:1Mel+Ura-:1Mel-Ura+-:1Mel-Ura-) соответственно.

Римскими цифрами обозначены стандартные номера хромосом. L и R – левые и правые теломеры.

Таблица II. Идентификация полимерных генов MEL12-MEL14 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae CBS 2888

MEL1 расположен в левом плече хромосомы II (Vollrath et al. 1988), а ген MEL11 – в

левом плече хромосомы I (Naumov G.I. et al. 1996).

Обнаружение и картирование нового семейства α-галактозидазных генов

MEL12-MEL14 у Saccharomyces cerevisiae

Молекулярное кариотипирование и последующая Саузерн-гибридизация зонда MEL1 с хромосомной ДНК показали наличие у штамма CBS 2888, по меньшей мере, трёх генов MEL (Рис. 4А и 4B, дорожка 4). Сопоставление интенсивностей гибридизационных полос позволило сделать вывод о сравнительно низком уровне гомологии этих трёх генов MEL с зондом MEL1 по сравнению с ранее известным семейством высокогомологичных генов MEL1-MEL11. На Рисунке 4B (дорожки 2 и 3) для сравнения представлены результаты гибридизации генов MEL2, MEL3, MEL4,

XII

IV

VII, XV

XVI

XIII

II

XIV

X

XI

V

VIII

IX

III

VI

I

Рисунок 4. Сравнительный анализ нового семейства генов MEL12-MEL14 у штамма Saccharomyces cerevisiae CBS 2888 на основе пульс-электрофореза хромосомных ДНК (A) и Саузерн-гибридизации с зондом MEL1 (B). Штаммы: 1 – YNN 295, 2 –

ВКМ Y-1830, 3 – CBS 3081, 4 – CBS 2888, 5 – CR0-1A, 6 – CR0-1B, 7 – CR0-1C, 8 – CR2-19A, 9 – IFO 1815, 10 – IFO 1816, 11 – 61-248. Нумерация хромосом римскими цифрами дана для штамма YNN 295 («Bio-Rad»).

MEL6, MEL7 и MEL11. Уровень дивергенции этих двух семейств примерно соответствует генетическому различию между семейством генов MEL1-MEL11 дрожжей S. cerevisiae и генами MEL двух других видов-двойников: S. paradoxus и S. mikatae (Рис. 4B, дорожки 9-11). Это позволяет предположить, что штамм CBS 2888 обладает тремя новыми генами ферментации мелибиозы MEL12-MEL14.

Для однозначной идентификации генов MEL12-MEL14 было необходимо получить рекомбинантные штаммы, содержащие по одному изолированному гену MEL. С этой целью штамм CBS 2888 был скрещен с Mel--тестером X2180-1A генотипа mel12 mel13 mel14. Соответствующий гибрид CR0, как и ожидалось, давал полимерное расщепление по ферментации мелибиозы (Табл. II). Для дальнейшего анализа были взяты три сегреганта из одной тетрады (CR0-1). Представленные на Рисунке 4B (дорожки 5-7) результаты Саузерн-гибридизации свидетельствуют, что сегреганты CR0-1A, CR0-1B и CR0-1C, вероятно, имеют соответственно генотипы

MEL12 mel13 mel14, mel12 MEL13 MEL14 и mel12 mel13 MEL14. Эти генотипы подтверждены результатами генетического анализа. Возвратные скрещивания показали, что сегреганты CR0-1A и CR0-1C действительно имеют по одному гену MEL, тогда как сегрегант CR0-1B – два гена MEL (Табл. II, гибриды CR1, CR2 и CR3). Гены MEL у сегрегантов CR0-1A и CR0-1C различны, так как у гибрида генотипа MEL12 mel13 mel14 / mel12 mel13 MEL14 наблюдается выщепление сегрегантов Mel- (Табл. II; гибрид CR4).

Третий ген (MEL13) был изолирован по данным Саузерн-гибридизации у одного из сегрегантов гибрида CR2 – CR2-19A (Рис. 4B, дорожка 8). Моногенное расщепление гибрида CR2-19A x X2180-1A подтвердило наличие у сегреганта CR2-19A только одного гена MEL (Табл. II, гибрид CR5). Рекомбинационный анализ гибридов CR6 и CR7 (Табл. II) однозначно показал различную локализацию генов MEL12, MEL13 и MEL14. Таким образом, доказано, что сегреганты CR0-1A, CR0-1B

иCR0-1C имеют соответственно генотипы MEL12 mel13 mel14, mel12 MEL13 MEL14

иmel12 mel13 MEL14. Отсюда следует, что гибрид CR0 обладает генотипом MEL12 MEL13 MEL14 / mel12 mel13 mel14, а штамм CBS 2888 имеет все эти три гена MEL.

Для картирования новых генов MEL12-MEL14 штаммы, содержащие по одному гену ферментации мелибиозы и мутацию ura3, были скрещены с тестерами, несущими ген URA3 только в определённых теломерных районах. Результаты тетрадного рекомбинационного анализа представлены в Таблице I. Они позволили картировать новые гены MEL в левых плечах хромосом: MEL12 в хромосоме IX,

MEL13 – в XV и MEL14 – в X.

Возможно, что дивергенция между новым семейством генов MEL12-MEL14 и семейством высоко гомологичных генов MEL1-MEL11 связана с экологогеографическими особенностями штамма CBS 2888. Эти дрожжи были выделены из необычного для S. cerevisiae субстрата – почвы, к тому же из географически удаленной южно-африканской популяции. Помимо S. cerevisiae гены MEL были обнаружены у S. bayanus, S. mikatae и S. paradoxus, а также у гибридного таксона S. pastorianus. Было показано, что гены видов-двойников в комплексе Saccharomyces sensu stricto имеют сходство на уровне 75-81% (Naumova et al, 1996). Как мы указывали, судя по интенсивности гибридизации с зондом MEL1 (Рис. 4B), примерно такой же уровень гомологии имеет место и между семействами MEL12-MEL14 и MEL1-MEL11. Логично предположить, что у штамма CBS 2888 произошла интрогрессия чужеродных для вида S. cerevisiae генов MEL.

Результаты настоящего исследования указывают, что гены утилизации мелибиозы семейств MEL1-MEL11 и MEL12-MEL14, подобно семействам полимерных генов ферментации других сахаров – мальтозы, сахарозы и, возможно,

α-метилглюкозида и растворимого крахмала (MAL, SUC, MGL, STA) – никогда не находятся на противоположных концах одной хромосомы дрожжей. Вероятно, противоположные концы каждой хромосомы дифференцированы специфическими последовательностями, участвующими в межхромосомных теломерных перемещениях генов ферментации сахаров соответствующего семейства.

Анализ аминокислотных последовательностей β-фруктозидаз

Существующая классификация гликозил-гидролаз объединяет ферменты с

β-фруктозидазной активностью на основании гомологии их аминокислотных

(http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/db.html). Семейство GH68 включает в себя исключительно бактериальные белки, главным образом левансахаразы. Семейство GH32 объединяет прокариотические и эукариотические ферменты, имеющие разную субстратную специфичность и характер катализируемой реакции (сахаразы, фруктаназы и фруктозилтрансферазы).

Сходство химических реакций, катализируемых ферментами семейств GH32 и GH68 (перенос β-D-фруктофуранозидазного остатка или его производного с молекулы донора на молекулу акцептора), позволило нам предположить общность их эволюционного происхождения. С помощью программы MACAW было

Рисунок 5. Схемы расположения консервативных участков в β-фруктозидазах семейства GH68: литературные данные (схемы 1-5) и данные, полученные в настоящей работе (схемы 6-8). Деления шкалы соответствуют аминокислотным остаткам последовательности левансахаразы Gluconacetobacter diazotrophicus. 1 – Расположение высоко консервативных остатков. Заглавные буквы соответствуют

предполагаемым компонентам активного центра. Процессированная форма фермента изображена прямоугольником. Скоба соответствует дисульфидной связи. 2

– Участки, консервативные в левансахаразах протеобактерий (Arrieta et al. 1996). 3 – Участки, консервативные в левансахаразах (Arrieta et al. 1996). 4 – Консервативные мотивы, содержащие кислые аминокислотные остатки (Batista et al. 1999). 5 – Участки, консервативные в левансахаразах (Kurimoto et al. 1999). 6 – Консервативные сегменты (L1–L20), обнаруженные в последовательностях β-фруктозидаз семейства GH68. 7 – Консервативные сегменты (D1-D9), обнаруженные в β-фруктозидазах семейств GH32 и GH68. 8 – Консервативные сегменты (N1-N6), обнаруженные в гликозил-гидролазах семейств GH43 и GH68.

проведено множественное выравнивание участков последовательностей гликозидаз семейства GH32, входящих в состав известных консервативных блоков, с аминокислотными последовательностями ферментов семейства GH68. В

последовательностях β-фруктозидаз обоих семейств удалось обнаружить девять участков локального сходства (консервативные сегменты D1-D9; Рис. 5, строка 7),

что позволило объединить их в β-фуранозидазное суперсемейство.

Скрининг полной базы данных аминокислотных последовательностей с помощью программы PSI-BLAST подтвердил наличие сходства у последовательностей гликозил-гидролаз семейств GH32 и GH68. При использовании последовательностей представителей семейства GH68 в качестве исходных для анализа, уже после первой итерации выявляется сходство с белками семейства GH32. Анализ порядка появления последовательностей семейства GH68 в зависимости от выбора исходной последовательности позволил сгруппировать всех известных представителей этого семейства в два чётко обособленных подсемейства. При этом наблюдается закономерность: подсемейство 68a включает исключительно белки грамположительных бактерий, а подсемейство 68b – белки грамотрицательных бактерий (протеобактерий), к подсемейству 68b также относится фруктозилтрансфераза Actinomyces naeslundii.

Анализ порядка появления последовательностей семейства GH32 (при скрининге базы данных с помощью программы PSI-BLAST) в зависимости от выбора исходной последовательности этого семейства, позволил подразделить его на четыре подсемейства. Подсемейство 32a включает все бактериальные сахаразы,

β-фруктозидазу Thermotoga maritima, а также два гипотетических белка простейшего Leishmania major. Подсемейство 32b объединяет главным образом бактериальные фруктаназы и β-фруктозидазы дрожжей и мицелиальных грибов. Исключение составляют три необычных фермента Aspergillus niger и A. sydowii, образующих подсемейство 32c. К подсемейству 32b также относятся две гипотетические инвертазы простейшего Tritrichomonas foetus и фруктозилтрансферазы Aspergillus foetidus, Microbacterium sp. и двух видов бактерий рода Arthrobacter. Подсемейство

32d включает инвертазы и фруктозилтрансферазы высших растений. К этому

подсемейству также относятся некоторые бактериальные β-фруктозидазы и один из гипотетических белков L. major. Число идентичных аминокислотных остатков в последовательностях одного и того же подсемейства, как правило, превышает 30%, а в последовательностях разных подсемейств семейства GH32 составляет около 25%. Выделенные в семействе GH32 подсемейства хорошо согласуются с кластеризацией ветвей на филогенетическом древе этого семейства, построенном с помощью программы ClustalW (Рис. 1).

α-L-Арабиназы и β-D-ксилозидазы – гомологи β-фруктозидаз

Анализ консервативных участков каждого из семейств β-фруктозидаз показал, что наиболее протяжённым из них является сегмент L13 семейства GH68 (содержит сегмент D7, консервативный у β-фруктозидаз обоих семейств; Рис. 5, строки 6 и 7). Использование «усреднённой структуры» участка L13 всех гликозидаз семейства GH68 для скрининга базы данных аминокислотных последовательностей с помощью программы PSI-BLAST уже после первого раунда позволило нам показать наличие у негостатистическидостоверногосходстваспоследовательностями ряда β-ксилозидаз и α-L-арабинофуранозидаз, относящихся к семейству GH43 гликозидаз.

Для дальнейшего исследования сходства последовательностей гликозил-гидролаз семейства GH43 и β-фруктозидаз была применена программа PSI-BLAST. При использовании последовательностей представителей семейства GH43 в качестве исходных для анализа, после первого раунда и двух итераций, как правило, удавалось получить в качестве белков-гомологов всех представителей этого семейства. Анализ порядка появления последовательностей семейства GH43 в зависимости от выбора исходной последовательности, позволил различить в этом семействе семь подсемейств (43a-g). Как видно на филогенетическом древе семейства GH43 (Рис. 6), все выделенные нами подсемейства имеют примерно одинаковый иерархический статус (пунктирной линией на рисунке отмечен уровень сходства, соответствующий критерию подсемейства).

При использовании последовательностей белков семейства GH43 в качестве исходных для анализа с помощью программы PSI-BLAST вслед за гликозидазами этого семейства в качестве белков-гомологов в базе данных GenPept выявляются представители семейств GH32, GH62 и GH68. Также обнаружено сходство этих гликозидаз с рядом неохарактеризованных гипотетических белков эубактерий и архебактерий. Использование последовательностей каждого из них для анализа с помощью программы PSI-BLAST показало, что все они образуют семейство белков-гомологов. Для него нами предложено название «семейство GHLP» (Glycoside Hydrolase Like Protein family) и высказано предположение о возможном наличии гликозил-гидролазных активностей у его представителей. Следует отметить, что все белки этого семейства обладают гомологией только с C-концевой

0.1

Рисунок 6. Филогенетическое древо гликозидаз семейства GH43. Справа указаны номера последовательностей в GenPept и их распределение по подсемействам. Ветви AAB87371N и AAB87371C соответствуют N- и C-концевым доменам белка.

частью последовательностей гликозидаз семейств GH32, GH43, GH62 и GH68. Сравнение с помощью программы MACAW последовательностей,

представляющих гликозидазы семейств GH43 и GH68, показало наличие у них шести общих консервативных участков (консервативные сегменты N1-N6). Эти сегменты в первичной структуре сгруппированы попарно в три кластера (Рис. 5, строка 8). Гомологичные им участки также оказались консервативными в остальных трёх семействах: GH32, GH62 и GHLP. В качестве примера на Рисунке 7 представлена структура участков последовательностей гликозидаз пяти семейств, соответствующих консервативным сегментам N5 и N6. В состав сегмента N5 входит высоко консервативный остаток Glu и кластер гидрофобных аминокислотных остатков, вероятно соответствующий β-слою во вторичной структуре. В случае сахаразы S. cerevisiae было показано, что этот остаток Glu является донором протона в активном центре фермента, а примыкающий к нему у гликозидаз семейства GH32 остаток Cys также существенен для энзиматической активности фермента (Reddy & Maley, 1996).

Полученные нами данные о гомологии с β-фруктозидазами семейств GH32 и GH68, а также наличие α-фуранозидазной активности у гликозидаз семейств GH43 и GH62 позволяют включить эти семейства в состав β-фруктозидазного суперсемейства. Это суперсемейство становится первым суперсемейством гликозилгидролаз, содержащим ферменты гидролизующие гликозидную связь как с сохранением (GH32 и GH68), так и с обращением (GH43) оптической конфигурации субстрата. Семейство GHLP гипотетических гликозидаз термофильных бактерий также относится к этому суперсемейству на основе гомологии аминокислотных последовательностей.

Подпись к Рисунку 7. Множественное выравнивание последовательностей гликозидаз. Слева указаны номера последовательностей в GenPept, справа – их принадлежность к семействам. На чёрном фоне указаны консервативные аминокислотные остатки (сверху – консервативный мотив), на сером фоне – кластер гидрофобных аминокислотных остатков. В нижней части рисунка звёздочками отмечены консервативные сегменты N5 и N6, стрелочкой – остаток Glu, входящий в состав активного центра сахараз.