2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Медицинская_микробиология,_вирусология_и_иммунология_1_том
.pdfГенетика микробов |
203 |
Из исследуемого образца выделяют общую ДНК, которую мож но амплифицировать по стабильной последовательности 16S РНКгену. Выделенную ДНК метят флуорохромом или ферментом и обрабатывают ею микрочип, создавая условия для гибридизации.
Отмывают несвязавшуюся ДНК, определяют локализацию моле кулярных гибридов постановкой ИФА или денситометрией.
Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в
исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного)
по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чи стую культуру.
Для проведения этой реакции из исследуемого материала вы деляют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для данного микроба гена. Обнаружение гена осуществляют его нако плением. Для этого необходимо иметь праймеры (затравки) ком плиментарного З’-концам ДНК исходного гена. Накопление (ам
плификация) гена выполняют следующим образом. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распа дается на 2 нити. Добавляют праймеры. Смесь ДНК и праймеров
охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомо го гена связываются с его комплементарными участками. Затем к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавливают температуру, оптимальную для функционирования
ДНК-полимеразы. В этих условиях в случае комплементарное™ ДНК гена и праймера происходит присоединение нуклеотидов к З’-концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом количество ДНК гена увеличивается каждый раз вдвое (рис. 5.7). Проводят реакцию в специальных приборах — амплификаторах. Результат оценивают последующей денситометрией амплифицированной
ДНК или ее электрофорезом в полиакриламидном геле. ПЦР при меняют для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.
ПЦР в реальном времени представляет ускоренный метод ПЦР,
при котором амплификацию и определение продукта амплифика ции проводят одновременно. Для этой цели в амплификационную пробирку вводят молекулярный зонд, который в случае связывания
с амплифицированной цепью генерирует флюоресцентный сигнал определенной длины волны. Реакцию проводят в автоматическом
режиме.
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
204 |
Глава 5 |
5' |
А 3' |
Участок связывания |
|
I |
|
|
Z |
праймера 8 |
Участок связывания праймера а
Денатурация
92-95 °C
Связывание праймеров при отжиге 37-60 °C
Амплификация
Рис. 5.7. Полимеразная цепная реакция (схема)
Генетика микробов |
205 |
Опосредованная транскрипцией амплификация рРНК использует ся для диагностики смешанных инфекций. Этот метод основан на обнаружении с помощью молекулярной гибридизации амплифицированных рРНК, специфичных для определенного вида бакте рий. Исследование проводят в три этапа:
•амплификация пула рРНК на матрице выделенной из иссле
дуемого материала ДНК при помощи ДНК-зависимой РНКполимеразы;
•гибридизация накопленного пула рРНК с комплиментарными видоспецифическими рРНК олигонуклеотидами, меченными флюорохромом или ферментами;
•определение продуктов гибридизации методами денситоме
трии, ИФА.
Реакцию проводят в автоматическом режиме в установках, в которых одномоментное определение рРНК, принадлежащих раз личным видам бактерий, достигается разделением амплифицированного пула рРНК на несколько проб, в которые вносят для гибридизации комплементарные видоспецифическим рРНК мече
ные олигонуклеотиды.
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 6
БИОТЕХНОЛОГИЯ, ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
6.1. Биотехнология
Биотехнология является наукой, которая на основе изучения процессов жизнедеятельности живых организмов, главным обра зом микроорганизмов, животных и растительных клеток, исполь
зует эти биологические процессы, а также сами биологические объекты для промышленного производства продуктов, необходи
мых для жизни человека или воспроизводства биоэффектов, не проявляющихся в естественных условиях (А.А. Воробьев).
6.1.1. Объекты биотехнологии, ее цели и задачи
Биотехнология (от греч. bios — жизнь, tecen — искусство, lo gos — наука) представляет собой область знаний, которая возникла и оформилась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генной инженерии, иммунологии, химической технологии и ряда других наук. Рождение биотехнологии обусловлено потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для народного хозяй ства, в том числе для медицины и ветеринарии, а также принципи ально новых технологиях. Целью биотехнологии являются получе ние продуктов из биологических объектов или с их применением, а также воспроизводство биоэффектов, не встречающихся в при роде. В качестве биологических объектов чаще всего используются одноклеточные микроорганизмы, животные и растительные клет ки, а также организм животных, человека или растений. Выбор этих объектов обусловлен следующими причинами.
Клетки являются своего рода биофабриками, вырабатывающи ми в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продук
ты: белки, жиры, углеводы, витамины, аминокислоты, антибиоти
ки, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и т.д. Многие
208 Глава 6
Биотехнология, используя перечисленные выше биологиче
ские объекты, получает огромный ассортимент продукции, при меняемой в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пище вой и химической промышленности, других отраслях народного хозяйства. К ним относятся продукты, без которых немыслимо существование современного человека: антибиотики, витамины, ферменты, вакцины, гормоны, аминокислоты, нуклеотиды, ком племент и препараты крови, иммуномодуляторы, антитела, диа
гностические препараты, сердечно-сосудистые, противоопухоле вые и множество других фармацевтических препаратов, пищевые и кормовые белки, биологические средства защиты растений, ин сектициды, сахара, спирты, липиды, дрожжи, кислоты, бутанол, ацетон и др.
Помимо этого биотехнология играет большую роль в оздоровле нии окружающей среды: с помощью биотехнологических процес
сов проводят очистку от загрязняющих веществ почвы, водоемов, воздушной среды путем их биоконверсии и биодеградации.
Однако биотехнология не ограничивается получением только вышеперечисленных продуктов. Значительные, более масштабные и революционные проблемы она решает на пути создания транс генных животных и растений, т.е. создания новых, ранее неиз вестных пород животных и растений, а также клонирования жи вотных. Новейший раздел биотехнологии — генная и белковая
инженерия — позволяет получать совершенно уникальные био
технологические эффекты, открывать способы диагностики, про филактики и лечения врожденных болезней, влиять на свойства генома человека, животных и растений.
6.1.2. История развития биотехнологии
Старая биотехнология возникла в древности, примерно 6000-
5000 лет до н.э., тогда, когда люди научились выпекать хлеб, ва рить пиво, приготовлять сыр и вино. Этот первый этап биотехно логии был сугубо эмпирический и продолжал оставаться таким, несмотря на совершенствование технологических процессов и расширение сфер использования биотехнологических приемов, вплоть до открытия Л. Пастером в XIX в. ферментативной приро ды брожения. С этого момента начался второй, научный, этап тра диционной биотехнологии. В этот период получены и выделены
210 |
Глава 6 |
6.1.3. Микроорганизмы и процессы, применяемые в биотехнологии
На Земле существует около 100 тыс. видов бактерий, не считая
многочисленных грибов (250 тыс. видов), вирусов, простейших. Микробы способны синтезировать продукты или осуществлять ре
акции, полезные для биотехнологии. Однако в практике использу ют не более 100 видов микроорганизмов, так как остальные мало изучены.
Так, например, дрожжи используют в хлебопечении, пивоваре нии, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток.
Из бактерий в биотехнологии чаще всего используют род Acetobacter— для превращение этанола в уксусную кислоту, углекислый
газ и воду; род Bacillus — для получения ферментов (В. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis)\ род Clostridium — для
сбраживания сахаров в ацетон, этанол, бутанол; молочнокислые бактерии (Lactobacillus и др.); псевдомонады, например РР. denitrificans, — для получения витамина В12; Corynebacterium gentamicum —
для получения аминокислот и др.
Из грибов в биотехнологии для получения разнообразных анти биотиков применяют род Streptomyces, Penicilium chrysogenium, Cefalosporum acremonium, Streptomyces spp. и др.
Естественно, широкое применение в получении диагностикумов, вакцин, иммуноглобулинов, пробиотиков, фагов и других
микробных препаратов находят патогенные и вакцинные штаммы болезнетворных микробов, а также условно-патогенные микроор ганизмы.
Многие микроорганизмы — бактерии, дрожжи, вирусы — ис пользуются в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов — про
дуцентов биотехнологической продукции. Так получены реком
бинантные штаммы Е. coli, продуцирующие интерфероны, инсу лин, гормоны роста, разнообразные антигены; штаммы В. subtilis, вырабатывающие интерферон; дрожжи, продуцирующие интер лейкины, антигены вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены вируса гепатита В, вируса
клещевого энцефалита, ВИЧ и др.
Биотехнология, генная инженерия |
211 |
6.2.Генетическая инженерия и область
ееприменения в биотехнологии
Генетическая инженерия является сердцевиной биотехнологии. Она по существу сводится к генетической рекомбинации, т.е. об мену генами между двумя хромосомами, которая приводит к воз никновению клеток или организмов с двумя и более наследствен ными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации in vitro или генетической ин женерии заключается в выделении или синтезе ДНК из отличаю щихся друг от друга организмов или клеток, получении гибридных молекул ДНК, введении рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки, создании условий для экспрессии и секреции про дуктов, кодируемых генами.
Гены, кодирующие те или иные структуры, или выделяют (кло
нируют) как таковые (хромосомы, плазмиды), или прицельно выщепляют из этих генетических образований с помощью ферментов
рестрикции. Эти ферменты, а их уже известно более тысячи, спо собны резать ДНК по многим определенным связям, что является важным инструментом генной инженерии.
В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК, наподобие рестриктаз ДНК. Эти фер менты названы рибозимами.
Сравнительно небольшие гены могут быть получены с помощью химического синтеза. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества,
а затем по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене,
поскольку каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида (кодон). С помощью синтезатора создают химическим путем ген,
аналогичный природному гену.
Полученный одним из способов целевой ген с помощью фер ментов лигаз сшивают с другим геном, который используется в качестве вектора, для встраивания гибридного гена в клетку. Век тором могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений.
Экспрессируемый ген в виде рекомбинатной ДНК (плазмида,
фаг, вирусная ДНК) встраивается в бактериальную или животную клетку, которая приобретает новое свойство — продуцировать не свойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым
геном.
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
212 Глава 6
В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего ис пользуют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, нетифоидные серовары сальмонелл, дрожжи, вирусы.
Методом генной инженерии созданы сотни препаратов меди цинского и ветеринарного назначения, получены рекомбинантные штаммы-суперпродуценты, многие из которых нашли практическое
применение. Уже используются в медицине полученные методом генной инженерии вакцины против гепатита В, интерлейкины-1, 2, 3, 6, инсулин, гормоны роста, интерфероны а, £, у, фактор не кроза опухолей, пептиды тимуса, миелопептиды, тканевый акти ватор плазминогена, эритропоэтин, антигены ВИЧ, фактор свер тывания крови, моноклональные антитела и многие антигены для
диагностических целей.
Задания для самоподготовки (самоконтроля) (к главам 5, 6)
А.Назовите процесс, в котором принимает участие бактериофаг:
1.Конъюгация.
2.Трансформация.
3.Трансдукция.
4.Репарация.
Б.Назовите свойства плазмиды, необходимые для осуществления передачи хромосомы путем конъюгации:
1.Интегративность.
2.Гипермутабельность.
3.Трансмиссивность.
4.Суперспирализованность.
В.Назовите структуры, которые участвуют в распространении ге нов в популяции бактерий:
1.Плазмиды.
2.Интегрон.
3.Транспозон.
4.Репликон.
Г.Назовите ферменты, которые применяются в генной инжене рии:
1.Рестриктазы.
2.Лигазы.
3.Протеазы.
4.ДНК-полимераза.