2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Helicobacter_pylori_и_хеликобактериоз_Саторов_С_

г. Душанбе и РРП, эти генотипы выявлялись в одинаковых случаях (по 60 %). Также следует отметить частую выявляемость этих генотипов в Кулябской зоне Хатлонской области. Так, сagH положительными оказались все (100 %) верифицированные в биопсийном материале культуры H.pylori. Кроме того, cagA генотип обнаруживался в несколько большем количестве, чем в других регионах – в 6 из 9 биоптатов, что составляет 66,7 %. В другой зоне Хатлонской области – Курган-тюбинской, cagA и cagH положительными были всего по 3 биопсийных материала (по 42,9 %). В Согдийской области эти показатели значительно варьировали: cagA положительным оказался всего 1 (12,5 %), а количество cagH положительных генотипов было значительно больше – 7 (75 %) из 8 биопсий.

Таблица 17

Встречаемость генотипов ureB, ureC, cagA, cagH, vacS1 и vacS2 H.pylori в различных регионах Таджикистана

Анализ распространенности vac генотипа и H.pylori и его субтипов показало, что частота их распространенности в различных регионах Таджикистана варьирует в больших диапазонах. Обращает на себя внимание достаточно большая разница в частоте встречаемости генотипа vacS1 H.pylori между двумя соседними территориями Хатлонской области. Так, в биопсийном материале из Кулябской зоны этот генотип был обнаружен только в одном случае (11,1 %) из 8 имеющихся в нашей коллекции биоптатов. В исследуемом материале, полученном от больных в Курган-тюбинской зоне, 3 (42,9 %) из 7 проанализированных биопсий характеризовались как vacS1 положительный генотип. Наибольшее количество vacS1 (50 %) и vacS2 (50 %) положительных генотипов было выявлено в биопсиях больных из Согдий-

ской области. В г. Душанбе и РРП эти показатели были невысокими – 13,3 % и 26,7 % соответственно.

Как ранее было отмечено, в нашей коллекции в наибольшем количестве был биопсийный материал, полученный от больных с ЯБДК. Поэтому сравнительный анализ распределения генотипов по регионам при конкретной нозологической форме был проведен на примере биопсийных материалов, полученных от больных с диагнозом ЯБДК (табл. 18). Обращает на себя внимание тот факт, что два из трех генотипов из комбинации всех шести проанализированных в работе хромосомных генов приходятся на биопсийные материалы, полученные от больных с ЯБДК из числа жителей г. Душанбе и РРП. В тоже время не встречался ни один штамм H.pylori верифицированный как генотип из комбинации генов c vacS1 или vacS2 в биопсийном материале больных, проживающих в Кулябской зоне Хатлонской области. Полученные результаты дают основание предположить о некоторой генетической особенности штаммов H.pylori – этиологических агентов ЯБДК, циркулирующих в конкретных регионах Таджикистана.

Таблица 18

Региональное распределение генотипов H.pylori в биоптатах при ЯБДК

Таким образом, нами обнаружена специфичность распределения генотипов H.pylori по регионам Республики Таджикистан. Изоляты, полученные

вг. Душанбе и РРП, характеризуются одновременным содержанием ureС, cagA и cagH генов в хромосоме. Для штаммов H.pylori, верифицированных

вбиопсийном материале, полученном в Согдийской области, характерно несколько частое присутствие vacS1гена и сравнительно редкое содержание

вхромосоме cagH гена. Показано, что наиболее часто cagH генотип H.pylori встречается в Кулябской зоне Хатлонской области – 100 % биопсий. В Кур- ган-тюбинской зоне наблюдается несколько более равномерное распределение генотипов H.pylori.

Важность представлений о распределении генотипов H.pylori при различных заболеваниях может быть обусловлена следующими фактами: штаммы сag и vac генотипов оказывают более значимое воздействие на прогноз заболевания, чем штаммы без этих генов, так как эти гены были верифицированы почти во всех биопсийных материалах, полученных от больных с ЯБДК, независимо от региона Республики Таджикистан. Штаммы H.pylori – этиологические агенты ЯБДК характеризуются некоторой региональной специфичностью, что необходимо учесть при диагностике, лечении и профилактике заболеваний хеликобактерной природы.

Вцелом, следует отметить, что оценки каких-либо ассоциаций между генами патогенности, также как и связи между различными генотипами и заболеваниями ЖКТ, необходимо накопить большее количество наблюдений, чем в нашем исследовании. Но с другой стороны, очевидно, что существующие в настоящее время методы определения факторов патогенности и вирулентности H.pylori не позволяют однозначно прогнозировать исход и развитие заболевания, вызываемое этим патогеном. Вероятно, необходимо изучать взаимодействие и взаимоотношения микроба и хозяина, как динамический процесс. В настоящее время нами предпринимаются попытки наладить в Таджикистане иммуногенетические основы взаимоотношений макроорганизма и патогенных агентов на основе современных методов молекулярной биологии – геномики, протеомики и транскриптомики. Сочетание этих методов позволит выявить реальное воздействие факторов патогенности и вирулентности H.pylori на хозяина, а также дать прогноз заболеваний.

Несмотря на прогресс в вопросах, связанных сэтиопатогенетической ролью H.pylori при гастродуоденальной патологии, диагностикой и лечением заболеваний хеликобактерной природы, остаѐтся ещѐ много нерешенных вопросов. В частности, Е.Г. Пиняева [30] справедливо задаѐтся вопросом, почему заболевают ЯБДПК только 1/6 всех инфицированных? Почему один и тот же патоген у одних вызывает гастрит, у других – ЯЖ или ЯБДПК, лимфому или рак? К тому же ЯБДПК практически не сочетается с язвой желудка и с раком. Почему наблюдается спонтанное заживление язв, несмотря на персистирование H.pylori-инфекции?

По ее же мнению ответы на эти вопросы, возможно, будут найдены при изучении, главным образом, особенностей микроорганизма («ульцерогенные» и «канцерогенные штаммы»).

Резюмируя данные литературы, посвященные патогенетическим механизмам заболеваний, вызываемых H.pylori и результаты собственных исследований можно заключить, что патогенез и проявление клинических признаков патологии данного генеза обусловлены морфологическими особенностями и способностью возбудителя синтезировать достаточно большое количество токсических продуктов. Патогенез и клиническое проявление H.pylori-ассоциированых патологий связаны со способностью штамма данного патогена синтезировать различные токсические продукты. Роль H.pylori в возникновении ряда гастродуоденальной патологии доказана как клиническими наблюдениями, так и на экспериментальной модели. Однако вопросы генетического контроля факторов патогенности H.pylori требуют дополнительного исследования.

ГЛ А В А 4

ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ HELICOBACTER PYLORIАССОЦИИРОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

На современном этапе изучения бактерий H.pylori существует достаточное количество методов индикации этих микроорганизмов и диагностики патологии данной природы. Микробиологический метод является классическим методом индикации H.pylori. Практическая значимость метода заключается в том, что данный способ позволяет выделить чистую культуру для внутривидового биотипирования и изучить отношение штаммов к противохеликобактерным лекарственным препаратам (С.С. Бунова, 2012; Л.В. Кудрявцева, 2004).

Гистологический метод основан на микроскопическом исследовании парафиновых срезов, с применением специального окрашивания по Уорти- ну-Старри, Гимзе или Генте (А.С. Сарсенбаева и соавт., 2005; И.А. Морозов, 2000; С.Г. Довгаль, 1993).

Для быстрой диагностики хеликобактериоза изучается уреазная активность Н.pylori. В настоящее время разработано большое количество промышленно изготовленных уреазных тестов, среди которых наибольшее распространение получил кло-тест (А.Н. Войницкий и соавт., 2001; Е.А. Корниенко и соавт., 2000).

В практике широко применяются серологические методы диагностики хеликобактериоза, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации, иммуноблотинг, а также иммунохроматографический метод. В качестве антигенных препаратов используют как грубые антигены: взвеси цельных клеток Н.pylori, глициновые экстракты бактерий, ультрадисперсные взвеси, так и более очищенные антигены: жгутиковый антиген, производные цитоплазматической мембраны и др. (Л.В. Кудрявцева, 1999). Инвазивные дыхательные тесты, которые основаны на высокой эндогенной активности уреазы Н.pylori,

так же относятся к эффективным методам диагностики Н.pylori-инфекции. В этих тестах используют мочевину, меченную радиоактивным изотопом углерода, которая расщепляется в желудке с помощью уреазы Н.pylori до аммиака и углекислого газа, содержащего атом С13 (И.Г. Акопян и соавт., 2008; Maas- tricht-3 Guidelines for Helicobacter pylori infection, Copenhagen, 2005).

Определение Н.pylori методом ПЦР проводят с использованием биоптатов слизистой оболочки желудка (А.А. Кишкун и соавт., 2005; A.P. Lage at al., 1995). Основу этого метода составляет катализируемое ДНК-полимера- зой многократное образование копий определенного участка ДНК. Механизм ПЦР заключается в том, что данный подход позволяет осуществить амплификацию в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-по- лимеразы из 4 дезоксинуклеозид-трифосфатов. являющихся структурными элементами всякой ДНК и коротких олигонуклеотидных 20-30-членных затравок (праймеров), комплементарных 3-концевым последовательностям антипараллельных цепей ДНК гена.

4.1. Микробиологические методы

4.1.1. Питательные среды и реактивы

Для культивирования и выделения Н.pylori используются различные питательные среды. В частности, селективная питательная среда, которая содержит: колумбийский агар 43 г (Hi-Media), дистиллированную воду – до 1000 мл, с добавлением 100 мл/л цельной крови барана, полимиксин В – 2500 UI/л, ванкомицин – 10 мг/л, триметоприм – 5 мг/л, амфотеррицин – 10 мг/л, трифенилтетразол хлорид (ТТХ) – 40 мг/л. Для транспортировки биопсийных материалов используются Cary-Blaer или Portagerm Pyloriсреда (BioMerioux, Франция).

4.1.2. Бактериологический метод исследования

Бактериологическому исследованию подвергаются биопсийный материал и кал больных гастродуоденальной патологией или другой биологический материал.

Время между взятием биопсийного материала и его поступлением в лабораторию не должно превышать 4 часов. Биопсийный образец перед посевом необходимо измельчать в 0,5 мл дистиллированной воды в стерильных ступках. Затем 0,05 мл взвеси наносят на питательную среду и производят посев сплошным газоном.

Кал для исследования предварительно разводят стерильным физраствором, центрифугируют и 0,05 мл супернатанта наносят на питательную среду и производят посев сплошным газоном.

Культивирование микроорганизмов осуществляется с учетом их биологической особенности – микроаэрофильности (5 % О2, 10 % СО2, 85 % N2) в течение 3-14 дней. Для создания микроаэрофильных условий в анаэростате используют газогенераторные пакеты для микроаэрофилов CampyPakPlus производства Beckton Dikkenson (USA). Оптимальный температурный режим инкубации составляет + 37 °С.

Рис. 19. Рост колонии Helicobacter pylori на среде с 5 % бараньей крови (фотография из интернета)

Для учета результатов бактериологического исследования чашки просматривают с третьего по 7-14 день. Принадлежность выделенных культур к Н.pylori определяют по совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических признаков.

На чашке с селективной средой (рис. 19) определяют типичные колонии – негемолитические, плоские, реже выпуклые, подобные каплям росы, влажные, прозрачные или полупрозрачные, с золотисто-жѐлтым отливом.

Рис. 20. Н.pylori, световая микроскопия (фотография из интернета)

Для определения тинкториальных свойств бактерии окрашивают по Граму. Грамотрицательные Н.pylori – мелкие, короткие, S-образно изогнутые бактерии. Средние размеры хеликобактер – 2,5-4 0,5 мкм; подвижны (лофотрихи); жгутиков обычно 4-5, они часто покрыты чехликами и имеют колбовидные утолщения на концах (рис. 20).

Следует отметить, что стареющие бактериальные клетки утрачивают типичную спиралевидную форму и переходят в кокковую (тип 1). Дегенеративные изменения в кокковую форму могут происходить и при неблагоприятных воздействиях факторов внешней среды (изменение температуры или рН) или нерациональном применении антибиотиков (тип 2). Кокковые формы 2 типа теряют ферментативную активность и репродуктивную способность, у них редуцируется обмен веществ, что создает благоприятные условия для их сохранения в кишечнике и во внешней среде, откуда они могут передаваться человеку фекально-оральным путѐм. Попав в желудок, H.pylori вновь трансформируется в спиралевидные, активные формы, способные колонизировать СОЖ.

Кокковидные формы H.pylori имеют огромное значение для диагностики H.pylori-инфекции. Их наличие может привести к ошибкам в диагностике, поскольку эти формы не культивируются, не имеют характерных признаков при световой микроскопии, не продуцируют уреазу или продуцируют ее в малых количествах, способны экспрессировать другие антигены.

4.1.3. Постановка оксидазного и каталазного теста

Оксидазная и каталазная активность H.pylori определяется общепринятыми методами.

Для проведения оксидазного теста на чашку с подозрительными колониями наносят 1-2 капли 1 % раствора тетраметил-парафенилендиамина. Реакция на оксидазу считается положительной, если через 20-30 секунд колонии Н.pylori окрашиваются в чѐрный цвет.

Для постановки каталазного теста исследуемую культуру эмульгируют в пробирке с 3 % раствором перекиси водорода. При положительной реакции выделяются пузырьки газа.

4.1.4.Определение спектра чувствительности штаммов H.pylori

кэтиотропном препаратам

Для проведения диско-диффузионного метода поверхность питательного агара в чашках Петри засевают культурой Н.pylori, наносят бумажные диски, пропитанные антибиотиками, затем чашки инкубируют в течение 48 часов при 37 С с соблюдением требований микроаэрофильности. Диаметр зоны задержки роста учитывается при помощи шкалы в зависимости от размера самого диска. При размере диска 9 мм диаметр зоны задержки роста для чувствительных штаммов Н.pylori должен быть не менее 50 мм, при размере диска 7 мм диаметр зоны задержки роста Н.pylori должен быть не менее 40 мм. Если в зоне задержки роста наблюдается рост единичных колоний Н.pylori, то такие колонии считаются резистентными мутантами, а вся исследуемая культура – резистентной.

4.2. Биохимический метод

4.2.1. Постановка быстрого уреазного теста (БУТ)

На сегодня разработаны различные варианты уреазных тестов для индикации H.pylori: тест со средой Христенсена, 4- часовой быстрый уреазный тест, 1-минутный тест, «CLO-тест», «Campy-test», экспресс-тест, «Биохит» и др. Они различаются по времени проведения – от 1 мин. до 24 ч., по носителям сред – жидкие или твердые, по стабильности сред, определяющих сроки их хранения. Почти все уреазные тесты обладают высокой чувствительностью (85-98 %) и специфичностью (по некоторым данным, до 100 %).

Для постановки БУТ, биопсийный материал слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки, полученный при гастродуоденоскопии помещают в пробирку с 0,1 мл диагностического реактива, состоящего из мочевины (2,0 г), 0,5 % водного раствора фенолфталеина (10 мл) и 0,01 М фосфатного буфера (до 100 мл).

Результаты регистрируют через 2, 4, 18 и 24 часа инкубации при комнатной температуре. Мочевина, входящая в состав теста, ферментирутся уреазой H.pylori, в результате чего образуется аммиак и углекислый газ, изменяющие рН среды. Появление малиновой окраски свидетельствует о наличии уреазы (как продукт жизнедеятельности H.pylori) в биологическом образце.

Преимуществом уреазных тестов являются простота выполнения, низкая стоимость и быстрота получения результатов, позволяющие врачу осуществлять работу по схеме «test and treat». Именно благодаря этому качеству уреазные тесты получили широкое распространение в рутинной врачебной практике.

В то же время известно, что у больных с выраженной кишечной метаплазией (кишечный эпителий не колонизируется НР) или у лиц с низкой обсемененностью слизистой оболочки желудка НР могут отмечаться ложноотрицательные результаты тестов. Ложноположительный результат обуславливается деятельностью других уреазопродуцирующих бактерий, таких как грибы рода Candida, псевдомонады, стрептококки и некоторые другие. Так, по данным НИИЭМ им. Л. Пастера, широко распространенный уреазный экспресс-тест – «Хелпил-тест» – обладает достаточным уровнем чувствительности (80 %), но низкой специфичностью (около 65 %), что порой приводит к необоснованному назначению эрадикационной антихеликобактерной терапии.

4.2.2. Уреазный тест в микроампулах

Сущность уреазного теста в микроампулах заключается в том, что в качестве тест-системы для биохимической диагностики хеликобактериоза используется герметически запаяная ампула, которая содержит 0,05-0,5 мл ре-