6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / Успехи геронтологии 2010 №03. Том 23

растных групп сохраняется практически постоянным в течение полутора месяцев, в липидах головного мозга данное отношение имеет минимальное значение у мышей в возрасте 17 нед, а затем резко возрастает при существенных различиях значений на уровне индивидуумов (рис. 2). Очевидно, возрастные изменения липидов органа зависят от обеспеченности их антиоксидантами, поскольку липиды головного мозга интактных лабораторных мышей всегда проявляют прооксидантные свойства в реакциях автоокисления, а липиды печени имеют более высокий уровень АОА [8].

Совокупность представленных данных и анализ литературы свидетельствуют о влиянии физикохимических характеристик липидов на регуляцию биохимических процессов в организме животных, что необходимо учитывать при анализе возрастных изменений в тканях мышей и исследовании механизма старения организма.

Литература

1. АнтоновВ. Ф., СмирноваЕ. Ю., ШевченкоЕ. В. Липидные мембраны при фазовых превращениях. М.: Наука, 1992.

2. Биологические мембраны. Методы / Под ред.

Дж. Б. Финдлея, У. Г. Эванза. М.: Мир, 1990.

3.Брин Э. Ф., Травин О. О. Моделирование механизма химических реакций // Хим. физика. 1991. Т. 10. № 6. С. 830–837.

4.Бурлакова Е. Б., Иваненко Г. Ф., Шишкина Л. Н. Вклад

антиоксидантов и эндогенных тиолов в обеспечение радиорезистентности организма // Изв. АН СССР (Сер. биол.). 1985.

№4. С. 588–593.

5.Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975.

6.Козлов М. В., Кушнирева Е. В., Урнышева В. В. и др.

Влияние характеристик липидов на регуляцию биохимиче-

ских процессов в печени и крови животных // Биофизика. 2007. Т. 52. Вып. 4. С. 693–698.

7.Крепс Е. М. Липиды клеточных мембран. Л.: Наука,

1981.

8.Шишкина Л. Н., Хрустова Н. В. Кинетические характе-

ристики липидов тканей млекопитающих в реакциях авто-

окисления // Биофизика. 2006. Т. 51. Вып. 2. С. 340–346.

9.Ramos J. L., Gallegos M. T., Godoy P. et al. Mechanisms of solvent tolerance in gram-negative bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 2002. Vol. 56. P. 743–768.

10.Sperry W. M., Webb M. A revision of the schoenheimersperry method for cholesterol determination // J. biol. Chem. 1950. Vol. 187. № 1. P. 97–106.

Самки мышей аутбредной линии SHR, инбредной 129/Sv и высокораковой трансгенной линии HER-2/neu с двухмесячного возраста получали с питьевой водой нацеленное на митохондрии производное пластохинона SkQ1 (10E (6’-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний) в дозах от 0,5 до 2500 нмоль/кг массы в сут. Животные контрольных групп получали воду без добавления препарата. Оценивали возрастную динамику массы тела, потребления корма и воды, эстральной функции, определяли двигательную активность в тесте «открытое поле», мышечную силу и утомляемость в тесте с подвешиванием на струне и уровень тревожности в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт», а также параметры продолжительности жизни (ПЖ) и канцерогенеза. Существенных различий в массе и температуре тела, потреблении корма и воды между животными опытных и контрольных групп не наблюдалось. С возрастом у мышей SHR, получавших SkQ1, становилась более выраженной тенденция к замедлению возрастных нарушений эстральной функции. Препарат не оказывал влияния на эстральную функцию трансгенных и инбредных животных. Применение SkQ1 значительно уменьшало двигательную активность и выносливость мышей 129/Sv и SHR, не оказывая влияния на тревожность мышей SHR. Отмечена тенденция к замедлению проявлений внешних признаков старения у мышей SHR, получавших SkQ1 в разных дозах. Введение SkQ1 в дозах от 0,5 до 50 нмоль/кг сопровождалось увеличением основных параметров ПЖ мышей SHR (средней ПЖ, средней ПЖ последних 10 %, медианы, максимальной ПЖ), не оказывая значительного влияния на ПЖ самок мышей 129/Sv и HER-2/neu. У трех исследованных линий мышей применение SkQ1 во всех исследованных дозах не оказывало существенного влияния на спонтанный канцерогенез, но достоверно уменьшало смертность мышей SHR от неопухолевой патологии. Полученные данные подтверждают гипотезу о геропротекторных свойствах исследованного препарата и отсутствии у него общетоксической и канцерогенной активности при длительном применении.

Ключевые слова: антиоксидант, SkQ1, митохондрия, биомаркеры старения, продолжительность жизни, канцерогенез

Одной из наиболее плодотворно развивающихся в последнее время фундаментальных теорий старения является свободнорадикальная теория [7, 12, 13], согласно которой с возрастом происходит накопление окислительных повреждений макромолекул свободными радикалами [9, 13, 16].

Эта теория объясняет не только механизм старения, но и широкий круг связанных с ним патологических процессов, включая рак. Установлено, что свободные радикалы, в частности активные формы кислорода (АФК), образовываются, преимущественно, в митохондриях. Поэтому перспективным направлением в разработке геропротекторов является использование антиоксидантов, способных целенаправленно проникать внутрь митохондрий, аккумулироваться там и снижать уровень свободнорадикальных процессов.

Было показано, что применение липофильных катионов для транспортировки биоактивных молекул внутрь митохондрий значительно увеличивает их эффективность [14]. Так, MitQ (10-(6’-уби- хинолил) децилтрифенилфосфоний) уже в микромолярных концентрациях селективно блокирует окислительные повреждения митохондрий и предотвращает апоптоз, индуцируемый пероксидом [18]. Однако разница между анти- и прооксидантной концентрациями MitQ невелика [10].

Для снижения риска прооксидативной активности было предложено использовать пластохинон вместо убихинона [3]. Синтезированная молекула 10E(6’-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний получила название SkQ1. Для SkQ1 была показана хорошая проницаемость через фосфолипиды мембраны, большая антиоксидативная и меньшая прооксидативная активность по сравнению с аналогичным препаратом на основе убихинона (MitQ) при тестировании на плоских мембранах, липосомах, митохондриях, бактериях, дрожжах, а также на клетках растений и животных [17]. Предполагается, что SkQ1, как нейтрализатор АФК внутри митохондрии, может замедлять развитие программы старения, обусловленной АФКстимулированным апоптозом в различных органах организма [6].

Врастительных и животных клетках in vitro очень низкие (наномолярные) концентрации SkQ1 ингибировали апоптоз и некроз, вызванный АФК.

Укрыс Wistar SkQ1 в дозах 0,02–250 нмоль/кг в сут уменьшал сердечную аритмию, вызванную

перфузией изолированного сердца раствором H2O2 ex vivo; уменьшал размер инфарктной зоны, вызванной реперфузией сердца in vivo [5]. У крыс линии OXYS с генетической предрасположенностью

кповышенному образованию свободных радикалов введение SkQ1 в дозе 50 нмоль/кг массы в сут предотвращало развитие катаракты, ретинопатий, остеопороза, увеличивало минерализацию костей [4], а в дозе 250 нмоль/кг массы в сут тормозило возрастную инволюцию тимуса [15].

Вконцентрациях 20 нМ–100 нМ SkQ1 увеличивал продолжительность жизни грибов

Podosphora anserina, ракообразных Ceriodaphnia affinis и насекомых Drosophila melanogaster [2].

SkQ1, добавленный в питьевую воду (5 нмоль/кг в сут), подавлял развитие лимфом у мышей с выключенным геном p53 и тормозил рост ксенографтов рака ободочной кишки человека HCT116/p53–/– на бестимусных мышах; не вызывал значительных изменений в росте опухолевых ксенографтов SiHa (HPV-16-ассоциированного рака шейки матки человека), однако заметно увеличивал продолжительность жизни мышей с опухолями [1].

Целью данной работы было изучение действия препарата SkQ1 на некоторые параметры гомеостаза и старения, продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез у разных линий мышей.

Материалы и методы

Всего в опытах было использовано 558 самок мышей разных линий: низкораковой аутбредной линии SHR, долгоживущей инбредной 129/Sv и высокораковой линии трансгенных мышей HER-2/neu. Животных содержали в пластмассовых клетках при стандартном режиме освещения (12:12) и температуре (+22 оС), они получали стандартный лабораторный корм ad libitum [8].

Начиная с двухмесячного возраста, опытные животные (от 30 до 50 в группе) в течение всей жизни ежедневно с питьевой водой получали препарат SkQ1 в разных дозах: мыши SHR — 50; 5 и 0,5 нмоль/кг массы в сут; 129/Sv — 250 и 5 нмоль/кг массы в сут; HER-2/neu — 2500; 250; 50 и 5 нмоль/кг массы в сут. Мыши контрольных групп (от 30 до 80 в группе) получали чистую питьевую воду.

Ежемесячно проводили оценку возрастного изменения массы тела, потребления корма и воды. Раз в 3 мес оценивали температуру тела интраректально, а также рассчитывали параметры эстральной функции (продолжительность эстрального цикла и его фаз, регулярность), цитологически исследуя содержимое влагалищных мазков.

В возрасте 12 и 15 мес у мышей SHR и 129/Sv, получавших SkQ1 в дозе 5 нмоль/кг, проводили исследование двигательной активности в тесте «открытое поле», помещая животное в круглую камеру диаметром 50 см, дно которой расчерчено на квадраты 5×5 см. За каждым животным наблюдали в течение 10 мин и фиксировали количество пересеченных квадратов поля, количество вертикальных стоек, продолжительность реакций груминга и замирания. У мышей SHR в возрасте 20 мес проводили оценку мышечной силы и физической утомляемости в тесте с подвешиванием за передние лапки на струне, натянутой на высоте 70 см. Регистрировали время до момента падения животного и через 20 мин повторяли эксперимент. Сумму отношений массы мыши к продолжительности первого и второго подвешивания расценивали как показатель мышечной силы, разницу между этими отношениями рассматривали как показатель восстановления сил. Также в возрасте 20 мес у мышей SHR определяли уровень тревожности в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». Животное на 5 мин помещали в установку, представляющую собой крест с рукавами 30×7 см (два открытых рукава с прозрачным дном и два закрытых темных рукава), приподнятый на высоту 50 см. Фиксировали время нахождения в центре, в закрытых рукавах, количество переходов.

За животными вели наблюдение в течение всей жизни. Для регистрации внешних проявлений процесса старения животных фотографировали, а павших мышей подвергали рентгенографии.

Регистрировали сроки гибели мышей и рассчитывали параметры продолжительности жизни — ПЖ (медиану, среднюю и максимальную — ПЖ). Проводили полную аутопсию, регистрируя наличие опухолей и неопухолевых патологических процессов. Полученный материал подвергали гистологическому исследованию. Выявленные новообразования классифицировали согласно критериям МАИР [11, 19]. Для статистической обработки результатов использовали пакеты статистических программ STАTISTICA 6 и GraphPad InStat 4. Достоверность различий оценивали по критериям t Стъюдента, χ2 и точному методу Фишера.

Результаты и обсуждение

Масса тела, потребление корма и воды.

У мышей всех исследованных линий с возрастом увеличивались показатели массы тела, потребления корма и воды. В отдельные сроки опыта у мышей всех линий наблюдали статистически достоверные отличия массы тела (рис. 1) и количества потребляемого корма (рис. 2) в опытных группах от контрольных, однако определенных тенденций выявлено не было. У мышей 129/Sv, получавших SkQ1 (в дозах 5 и 250 нмоль/кг), в позднем возрасте (с 16 мес) наблюдали повышенное потребление жидкости по сравнению с контрольными группами (p<0,05), рис. 3. У мышей SHR и HER-2/neu существенных отличий в потреблении жидкости не выявлено. В целом, значительного влияния SkQ1 на возрастную динамику массы тела, потребления корма и воды, а также корреляции этих параметров с дозой препарата во всех исследованных группах установить не удалось.

Температура тела. Во всех исследованных дозах SkQ1 не оказывал значительного влияния на температуру тела мышей SHR и HER-2/neu

SHR

Масса тела, г

38

35

32

29

26

23

20

Возраст, мес

(рис. 4). У мышей 129/Sv, получавших SkQ1 в дозе 250 нмоль/кг, в возрасте 6–18 мес температура тела была выше, чем у контрольных, а позже (21–24 мес) была ниже контрольной (p<0,05). При этом доза 5 нмоль/кг не влияла на температуру тела животных 129/Sv. Все это может свидетельствовать о случайном характере выявленных различий и отсутствии существенного влияния SkQ1 на температуру тела исследованных линий мышей.

Эстральная функция. У мышей линии SHR

под влиянием всех исследованных доз SkQ1 c возрастом становилась более выраженной тенденция к торможению возрастных нарушений эстральной функции, выражающихся в увеличении длительности цикла и снижении частоты регулярных циклов (рис. 5). У мышей SHR достоверные различия в частоте иррегулярных циклов (р<0,05) по сравнению с контрольными группами были отмечены в возрасте 15 мес (при дозе 50 нмоль/кг) и 18 мес (у мышей всех опытных групп). Влияния препарата на эстральную функцию трансгенных животных HER-2/neu и инбредных 129/Sv выявлено не

129/Sv

Масса тела, г

33

30

27

24

21

18

15

Возраст, мес

Рис. 2. Динамика потребления корма у мышей разных линий в опытах с SkQ1

было. Таким образом, SkQ1 препятствовал возрастным нарушениям регулярности эстрального цикла у инбредных мышей SHR, но не у инбредных 129/Sv или трансгенных HER-2/neu.

Физиологические тесты. С возрастом у мышей линий SHR и 129/Sv наблюдалась тенденция к снижению горизонтальной и вертикальной двигательной активности в тесте «открытое поле», тогда как продолжительность реакции замирания, наоборот, увеличивалась (табл. 1). Препарат SkQ1 в дозе 5 нмоль/кг значительно угнетал горизонтальную двигательную активность (количество пересеченных квадратов поля) мышей SHR в возрасте 12 мес — на 58 % (p<0,05), 15 мес — на 61 % (p<0,05); мышей 129/Sv в возрасте 12 мес — на 56 % (p<0,05), 15 мес — на 46 % (p<0,05). Также под воздействием препарата у мышей обеих линий наблюдалась тенденция к торможению вертикальной двигательной активности, определяемой по количеству вертикальных стоек, и снижению продолжительности реакции груминга. У опытных мышей линии SHR прослеживалась тенденция к увеличению продолжительности реакции замирания, тогда как у мышей 129/Sv подобной тенденции не наблюдалось. Таким образом, препарат SkQ1 в дозе 5 нмоль/кг снижал двигательную активность мышей линии 129/Sv и SHR.

При исследовании мышечной силы у пожилых (20 мес) мышей линии SHR с учетом различий в массе тела (по отношению массы мыши к продол-

жительности подвешивания) статистически достоверных различий выявить не удалось (табл. 2). Показатель М/Т2–М/Т1 отражает способность

квосстановлению сил после первого подвешивания. Чем этот показатель выше, тем ниже способность

квосстановлению сил и, таким образом, выше физическая утомляемость. Животные, получавшие SkQ1, отличались более высокой утомляемостью, чем в контрольных группах (0,5 и 50 нмоль/кг — p<0,05; 5 нмоль/кг — p>0,05). Таким образом, SkQ1 во всех исследованных дозах усиливал утомляемость животных аутбредной линии SHR, снижая их выносливость.

Втесте «приподнятый крестообразный лабиринт» статистически достоверных различий у опытных 20-месячных мышей SHR по сравнению с мышами контрольной группы выявлено не было (табл. 3) из-за больших индивидуальных колебаний.

Рис. 3. Динамика потребления жидкости у мышей разных линий в опытах с SkQ1

В целом, проведенные опыты позволяют предположить, что препарат SkQ1 угнетает двигательную активность и выносливость мышей, не оказывая влияния на уровень тревожности, оцениваемый в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт», а также на мышечную силу.

Состояние волосяного покрова и скелета.

Известно, что с возрастом происходят изменения волосяного покрова и вибрисс, а также позвоночника. Этот процесс выражается в нарастающем облысении животных, укорочении и исчезновении вибрисс, а также в искривлении позвоночника (кифозе). Так, например, у всех 22-месячных мышей линии SHR контрольной группы вибриссы отсутствовали, тогда как в опытных группах у всех мышей вибриссы были сохранены, за исключением частичной потери вибрисс у 20 % животных, получавших SkQ1 в дозе 0,5 нмоль/кг (табл. 4, рис. 6). Что касается состояния волосяного покрова, то в позднем возрасте (более 20 мес) у всех

Рис. 4. Динамика температуры тела (% от контрольного значения) у мышей разных линий в опытах с SkQ1

мышей SHR контрольной группы отмечалось полное или частичное облысение, тогда как у большинства опытных мышей волосяной покров сохранялся (рис. 7). Препарат SkQ1 не оказывал влияния на состояние волосяного покрова и вибрисс мышей 129/Sv. Искривление позвоночника (кифоз) в виде горба отмечалось у опытных мышей линий SHR и 129/Sv несколько реже, чем в контрольных группах (см. табл. 4, рис. 8).

В целом, полученные данные могут свидетельствовать о торможении развития исследо-

–0,2

–0,4

–0,6

–0,8

–1

–1,2

–1,4

Таблица 2

SHR

Мыши с иррегулярными циклами, %

70

60

50

40

30

20

10

0

HER=2/neu

Мыши с иррегулярными циклами, %

35

30

25

20

15

10

5

0

Рис. 5. Динамика относительного количества мышей разных линий с иррегулярными эстральными циклами в опытах с SkQ1

Таблица 4

Состояние волосяного покрова и скелета у самок мышей линий 129/Sv и SHR в опытах с разными дозами SkQ1

* Частичное укорочение вибрисс

129/Sv

Мыши с иррегулярными циклами, %

70

60

50

40

30

20

10

0

Возраст, мес

Контрольная группа

ванных признаков старения у мышей под влиянием

SkQ1.

Продолжительность жизни. Введение SkQ1 увеличивало выживаемость и ПЖ аутбредных мышей SHR: медиану ПЖ — максимально на 92 % при дозе SkQ1 5 нмоль/кг, среднюю ПЖ последних 10 % выживших — максимально на 13 % при дозе 50 нмоль/кг, максимальную ПЖ — до 6 % при дозе 50 нмоль/кг и среднюю ПЖ при дозе 0,5 нмоль/кг — на 32 %; 5 нмоль/кг — на 45 %; 50 нмоль/кг — на 35 %, p<0,05 (табл. 5, рис. 9).

У мышей долгоживущей линии 129/Sv, получавших SkQ1 в дозе 5 нмоль/кг, было отмечено небольшое снижение медианы ПЖ (на 9 %, p<0,05) и средней ПЖ (на 6 %, p<0,05). Однако при введении большей дозы препарата (250 нмоль/кг) подобного эффекта обнаружено не было, а максимальная ПЖ при этой же дозе имела даже тенденцию к увеличению (на 7 %, p>0,05).

Препарат не оказывал влияния на ПЖ мышей HER-2/neu. Таким образом, SkQ1 значительно увеличивал ПЖ самок инбредной линии мышей SHR, особенно при дозах 50 и 5 нмоль/кг, не оказывая значительного влияния на ПЖ самой инбредной и трансгенной линии мышей.

Патологические изменения. У опытных мышей всех трех линий при аутопсии никаких патологических изменений, свидетельствующих о токсичности исследуемого препарата, обнаружено не было. При определении основных причин гибели животных при наличии крупных опухолей, имевших, скорее всего, фатальный характер, основным заболеванием, приводящим к смерти, считали новообразование, при отсутствии такового — неопухолевую патологию. При анализе параметров канцерогенеза мы учитывали только тех мышей, которые дожили до срока обнаружения первой