6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Митин_Ю_А_Лабораторная_диагностика_аллергических_заболеваний_Методические

Ю.А. Митин

Аллергические заболевания очень разнообразны по своим проявлениям, часто скрываются под маской других болезней, например простудных или кожных, поэтому своевременная и точная диагностика играет решающую роль в том, насколько эффективным будет лечение и как изменится в конечном итоге качество жизни пациента.

В методических рекомендациях подробно рассмотрены основные принципы и методы диагностики аллергических заболеваний, дана полная характеристика лабораторных методов диагностики аллергических заболеваний. Большое внимание уделено методам специфической аллергодиагностики, основанным на современных технологиях иммуноанализа, считающимися наиболее достоверными и безопасными для пациента.

Данные рекомендации предназначены для врачей клинической лабораторной диаг­ ностики и врачей-аллергологов, а также окажут неоценимую помощь врачам-клини- цистам других специальностей при проведении дифференциальной диагностики заболеваний.

«Лабораторная диагностика аллергических заболеваний».

Автор: Главный аллерголог Министерства обороны РФ, д.м.н., профессор Ю.А.Митин (ВМедА, СПб).

Условные обозначения:

АЗ – аллергические заболевания АО –ангионевротический отек БА – бронхиальная астма

ГЗТ – гиперчувствительность замедленного типа ИЛ – интерлейкин ИФА – иммуноферментный анализ

РИА –радиоиммунный анализ ОФВ1 – объем форсированного выдоха за 1 секунду ФВД – функция внешнего дыхания

ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы CD4+ – Т-лимфоциты с хелперным фенотипом CD8+ – цитотоксические Т-лимфоциты

Ig – иммуноглобулины

NK-клетки – естественные киллеры

CD – клон дифференцировки лимфоцитов Тh0 – Т – лимфоциты хелперы «нулевого» типа Тh1 – Т – лимфоциты хелперы 1 типа

Тh2 – Т – лимфоциты хелперы 2 типа

Ig G1,2,3,4 – субклассы иммуноглобулинов G

GM – CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор IFN-γ – интерферон гамма

Оглавление

Ю.А. Митин

6.4.1. Классический и «capture» варианты иммуноферментного

6.4.2.Варианты ИФА, основанные на технологии выявления аллергенспецифических иммуноглобулинов

7.Особенности интерпретации результатов исследований общего и аллергенспецифических

8.Современные технологии проточной цитометрии

ивозможности их использования в диагностике

Введение

Введение.

В последние 20-30 лет становится все более очевидным рост аллергических заболеваний. Эта тенденция свойственна большинству стран, в том числе отмечается она и в нашей стране. Эпидемиологические исследования, проведенные за эти последние десятилетия в различных регионах России, показали высокую (от 15 до 35 %) распространенность аллергии, особенно у лиц детского возраста. Кроме того, повсеместно отмечается нарастание тяжести течения большинства аллергических заболеваний. По прогнозам ВОЗ в XXI веке аллергические и иммунодефицитные заболевания по распространенности выйдут на первое место.

Множество современных исследований посвящено изучению различных аспектов аллергии: роли генетической предрасположенности, экзогенных, прежде всего экологических и социальных факторов, обуславливающих ее реализацию. Ученые подчеркивают важное влияние загрязненности воздуха и воды, анализируют последствия необоснованного использования лекарственных средств, множества консервантов для приготовления продуктов питания, подчеркивают роль гиподинамии и снижение инфекционной заболеваемости, вследствие применения в развитых странах многочисленных прививок и средств дезинфекции. В результате этих исследований общий прогноз неутешителен – если эти условия не изменятся, рост аллергии продолжится. И в нашей стране и за рубежом данные о заболе­ ваемости,регистрируемыепообращаемостибольныхвлечебные учреждения, не отражают истинного распространения аллергии, т.к. значительная часть больных с легкими формами забо-

Ю.А. Митин

леваний не обращаются к врачу. Так, по данным отечественных авторов, истинная заболеваемость наиболее распространенным аллергическим заболеванием – аллергическим ринитом, в 100 раз (10% популяции, вместо 0,1%) выше, чем официально регистрируемый уровень.

В этих условиях значение своевременной диагностики аллергических заболеваний все более возрастает. Как правило, такая диагностика осуществляется комплексно и включает ряд последовательных этапов: сбор аллергологического анамнеза, клинические и лабораторные исследования, кожные и провокационные аллергические тесты. И если за последние десятилетия сбор анамнеза, методы клинического обследования, методики кожных и провокационных тестов изменились незначительно, то в области лабораторной диагностики аллергии произошли революционные изменения, обусловленные технологическими и методическими достижениями иммунодиагностики.

Актуальность изучения лабораторных методов аллергии подчеркивается целым рядом преимуществ, которыми они обладают: быстротой получения и объективным характером результата, полной безопасностью проведения диагностики, отсутствием необходимости отмены лекарственных препаратов, возможностью одномоментной диагностики сенсибилизации к большому числу аллергенов (десятки и сотни). Анализу современного состояния и перспективам лабораторной диагностики аллергических заболеваний посвящена данная работа.

Основные понятия: аллергия, антиген, аллерген, сенсибилизация

1. Основные понятия: аллергия, антиген, аллерген, сенсибилизация.

Ухудшение экологической обстановки, связанное с развитием промышленности и сельского хозяйства, часто возникающими техногенными авариями и чрезвычайными ситуациями, обусловило значительный рост и разнообразие видов и проявлений патологии иммунной системы человека, в том числе аллергии. Что же характеризует состояние аллергических заболеваний сегодня и место аллергологии в системе здравоохранения? Исходя из данных, полученных при изучении заболеваемости в мире и России, аллергия является одной из важнейших медикосоциальных проблем, значение которой неуклонно возрастает. Так, частота аллергических заболеваний среди представителей взрослого и детского населения России в последнее десятилетие существенно увеличилась и составляет в регионах от 15 до 35 %, следовательно, медико-социальное значение аллергии, по-ви- димому, будет возрастать и в последующие годы. Как правило, дебют аллергического заболевания отмечается уже в детском возрасте, и поэтому в повседневной практике врачам различных специальностей приходится все чаще сталкиваться с больными аллергией, у которых имеется сочетание нескольких заболеваний.

Решение этой проблемы в значительной степени зависит от уровня профессиональной подготовки по аллергологии и иммунологии не только иммунологов и аллергологов, но и врачей общей практики, терапевтов, хирургов, а также специалистов клинической лабораторной диагностики.

Ю.А. Митин

Поэтому интерес врачей к методам диагностики аллергии закономерен. В настоящее время мы наблюдаем стремительное развитие и совершенствование лабораторных методов диагностики аллергических заболеваний – одной из составных частей иммуноанализа. Все возрастающее влияние на методы лабораторной диагностики оказывают такие дисциплины, как химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии иммуноанализа.

Диагностические потребности приводят к тому, что расширяется число объектов исследований (общий иммуноглобулин Е, более 1000 аллергенспецифических иммуноглобулинов Е, различные субпопуляции лимфоцитов). С другой стороны, углубляются и совершенствуются сами методы анализа, меняется процедура его проведения, сокращается время, уменьшается расходреагентов,внедряютсяавтоматизированныевысокопроиз­ водительные системы. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров аллергических заболеваний и технологий их выявления.

Совершенствование технологий и доступность методов

вряде случаев приводят к тому, что данные лабораторных исследований рассматриваются изолированно от остальной клинической информации, им придается преувеличенное диагностическое значение, не делаются поправки на специфичность и чувствительность используемых методов и систем, что может приводить к неверной трактовке результатов диагностики. Конечно, использование в специфической диагностике только лабораторных методов может быть единственно возможной мерой

вслучаях, когда, например, постановка кожных проб невозмож-

Основные понятия: аллергия, антиген, аллерген, сенсибилизация

на или опасна – при наличии кожных аллергических процессов (атопического дерматита, крапивницы, псориаза), в период обострения бронхиальной астмы или поллиноза, при невозможности отмены антигистаминных препаратов, после перенесенного в прошлом анафилактического шока, а также если клинические методы оказались мало информативны.

Однако, на сегодняшний день решение задач аллергологической диагностики затруднено тем, что далеко не во всех медицинских ВУЗах (при первичной подготовке врачей общей практики) ведется преподавание аллергологии и иммунологии, как самостоятельной дисциплины. Другая трудность обусловлена тем, что еще до недавнего времени отсутствовали медицинские стандарты диагностики и лечения больных с аллергическими заболеваниями и нарушениями иммунной системы, а их требования, изложенные в первом издании 2001г., пока еще не стали обязательными. Важным является и осмысление результатов более чем столетнего развития аллергологии и иммунологии, включая терминологию, классификации и определения болезней, сохранение ведущей роли лечащего врача в диагностике, профилактике и лечении аллергии.

Аллергология как дисциплина формировалась на примерах реализации патологической роли аллергических реакций при различных заболеваниях – поллинозе, анафилактическом шоке, отеках Квинке и др. И до сих пор ряд исследователей считает аллергию явлением сугубо патологическим, не отмечая ее защитной роли. Приведем одно из определений – «аллергия – это такое состояние, иммунный ответ при котором сопровождается повреждением собственных тканей» (G.J.Lawlor, T.J.Fisher, M.D.Adelman, 2000). Однако в противовес этому мнению осно-

Ю.А. Митин

ществам, могут стать антигенами входя в состав его активного центра (эпитопа).

Эпитоп–участокмолекулыантигена,способныйвступать в связь (ионную, водородную, ван-дер-ваальсовую, гидрофобную) с активным центром антитела или рецептором клеток.

Факты говорят, что способность вызывать иммунный ответ, т.е. быть иммуногеном, возникает у веществ только с определенной, «критической» массой. Экспериментальные исследования подтверждают это – подавляющее большинство веществ, молекулярная масса которых превышает 10000 дальтон, является иммуногенами, а менее 5000 дальтон не являются таковыми. Однако если увеличить их молекулярную массу (полимеризация, конъюгация с белком и т.п.), то вещество становится иммуногенным.

Критическая молекулярная масса – более 5000 дальтон.

Рис.1. Патогенетический механизм трансформации гаптена в аллерген.

Механизм трансформации гаптена в аллерген.

14

Основные понятия: аллергия, антиген, аллерген, сенсибилизация

Полные антигены обладают составом определенной сложности. Так, если обратить внимание на химический состав таких полных антигенов, то выяснится, что антигенов, состоящих только из атомов одного вида (только из одного химического элемента) нет. Следовательно, по химическому составу, антиген не простое, а сложное вещество.

Антиген – иммуногенное сложное вещество, обладающее эпитопом и критической молекулярной массой.

Обладает ли аллерген всеми свойствами антигена? Разберем свойства аллергена по аналогии с антигеном. Итак, известно, во-первых, что аллергены это сложные вещества. Так же как антигены, полноценные аллергены не состоят из атомов одного вида. Кроме того, эти вещества должны обладать свойством, связанным с их воздействием на иммунную систему сходным с иммуногенностью (способностью вызывать иммунный ответ в виде продукции специфических антител или специфических рецепторов клеток). Такое свойство аллергены имеют. Это свойство называют аллергенностью – способностью вызывать специфически (аллергически) измененный иммунный ответ – аллергическую реакцию. Также как и при обычном иммунном ответе, в аллергической реакции принимают участие антитела и клетки иммунной системы. В-третьих, аллерген, так же как антиген, специфичен, что обусловлено наличием эпитопа или эпитопов. В-четвертых, для него, как и для антигена, соблюдается закономерность, связанная с необходимостью наличия критической молекулярной массы (более 5000 дальтон). Таким образом, аллерген в полной мере обладает всеми свойствами антигена – способен вызывать иммунный ответ, имеет эпитоп и молекулярную массу, превышающую критическую. Аналогично

15

Ю.А. Митин

антигену, аллерген может быть образован из гаптена.

Однако, возникает резонный вопрос, чем же аллерген отличается от антигена? По-видимому, принципиально, только одним свойством – ответом иммунной системы. Вследствие внутренних изменений иммунной системы, предшествующих формированию аллергии, на воздействие отдельных антигенов возникает особый, измененный, приводящий к появлению сенсибилизации или аллергической реакции, иммунный ответ, что выделяет этот антиген из массы других, т. о. превращая его из антигена в аллерген.

Аллерген – иммуногенное сложное вещество, обладающее эпитопом, критической молекулярной массой, иммунный ответ на которое реализуется сенсибилизацией или аллергической реакцией.

В 1994 году классификация аллергенов была унифицирована номенклатурным субкомитетом ВОЗ по аллергенам. В обозначении названия аллергена участвуют первые три буквы рода, первая буква вида, арабская цифра обозначает гомологичные аллергены (порядок открытия) разных видов. Например, Dermathophagoides farinae-Der f1

Der – род, f – вид, 1 – гомологичные аллергены разных видов. 0.000 — изоформы аллергенов обозначают дополнительны-

ми четырьмя цифрами.

Основные классы аллергенов.

Пыльцевые аллергены:

Международное обозначение:

g1…n–пыльцалуговыхтрав(каждыйвидимеетиндивидуаль- ный порядковый номер, например, g1-колосок душистый);

16

Основные понятия: аллергия, антиген, аллерген, сенсибилизация

w1…n – пыльца сорных трав;

t1…n – пыльца деревьев и кустарников.

Аллергены условно патогенных микроорганизмов и грибов (плесеней):

m1…n – грибы и плесени.

Эпидермальные аллергены:

e1…n – индивидуальные аллергены животных.

Ингаляционные аллергены

h1…n – домашняя пыль с различным содержанием эпидермальных аллергенов, микроклещей и др.;

d1…n – микроклещи;

i1…n – инсектные (насекомых) аллергены.

Пищевые аллергены:

f1…n – пищевые продукты.

Лекарственные аллергены:

с1…n – лекарственный препарат.

Гиперчувствительность — это патологическая чрезмерно сильная иммунная реакция на чужеродный агент, которая приводит к повреждению тканей организма.

Аллергия (allos – иной ergos – действие) — это неадекватный по силе иммунный ответ на аллерген, т. е. гиперчувствительность к данному аллергену.

Организм, ткани и клетки которого способны отвечать на воздействие того или иного вещества-аллергена при повторном контакте реакцией гиперчувствительности, называют сенсибилизированным.

17

Ю.А. Митин

Аллергическая реакция – это иммунный ответ на аллерген, в результате которого образуются аллергенспецифические анти- телаилиаллергенспецифическиеТ-лимфоциты.Всовременном понимании аллергия включает в себя все формы иммунологически опосредованных реакций гиперчувствительности (РГЧ).

Формирование, длительность сохранения сенсибилизации зависят от пути проникновения аллергена (чаще парентерально или ингаляторно), дозы (чаще на небольшие или сверхбольшие количества – сенсибилизирующая доза), природы аллергена (к некоторым аллергенам абсолютная чувствительность), длительности воздействия, но, главным образом, от предшествующих попаданию антигена нарушений иммунологической реактивности.

Рассматривая закономерности становления иммунной системы плода при наличии аллергических заболеваний у матери, выяснили, что формирование аллергической реактивности у детей во время внутриутробного периода происходит под влиянием аллергически измененной иммунной системы матери, «подготавливающей» иммунную систему плода к последующему восприятию антигенов, как аллергенов. Закрепление этих особенностей иммунного ответа носит информационный характер, поскольку информация о силе и характере ответа иммунной системы сохраняется в клетках иммунологической памяти, а при сохранении изменений иммунореактивности повторный иммунный ответ на данное вещество реализуется, как ответ на аллерген, а не антиген.

Возможным объяснением феномена развития сенсибилизации является факт использования одних патогенетических механизмов иммунного ответа при аллергии и нормальной им-

18

Основные понятия: аллергия, антиген, аллерген, сенсибилизация

мунной реакции. Так же как при аллергии, вторичный иммунный ответ на антиген характеризуется повышенной силой (гиперчувствительностью), сокращением времени такого ответа, наличием структур, реагирующих иным образом на специфический антиген – клеток иммунологической памяти, эффекторов гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), специфических антител.

Известно, что иммунный ответ на аллерген – аллергическая реакция, развивается в течение определенного времени. В первую фазу происходит развитие и закрепление специфически измененного иммунного ответа — сенсибилизация — т. е. переход от нормальной реакции на антиген к патологически (обязательно иммунологически) измененной. Сенсибилизация бывает активной, когда организм своими силами полностью реализует механизмы аллергии и пассивной, формирующейся при введении специфических антител или сенсибилизированных лимфоцитов из другого организма, например, при переливании крови от сенсибилизированных лиц к несенсибилизированным.

Сенсибилизация не возникает, как ранее считалось, начиная с момента повторного попадания аллергена в организм. Она является результатом не только неоднократного попадания антигена в организм, но, обязательно, связана с предшест­ вующими нарушениями иммуннорегуляции, что может быть в дальнейшем реализовано измененной реакцией на антиген. Становление сенсибилизации может происходить в течение 2-х и более недель, но, сформировавшись, она может сохраняться месяцы, годы и даже всю жизнь. Важно подчеркнуть, что антиген становится полноценным аллергеном, способным вызывать аллергические реакции, в результате завершения процесса сен-

19