Добавил:
kiopkiopkiop18@yandex.ru Вовсе не секретарь, но почту проверяю Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Митин_Ю_А_Лабораторная_диагностика_аллергических_заболеваний_Методические

.PDF
Скачиваний:
0
Добавлен:
24.03.2024
Размер:
4.6 Mб
Скачать

Ю.А. Митин

Количество репликатов каждой из исследуемых сывороток определяется количеством аллергенов, на наличие специфических IgE к которым исследуется образец. При этом определение аллерген-специфичских IgE производится из расчета 1 лунка для каждого аллергена.

7.11.В лунки, содержащие калибровочные пробы и контрольную сыворотку, внести по 100 мкл конъюгата Е-1.

7.12.В лунки с исследуемыми сыворотками крови внести по 100 мкл растворов требуемых аллергенов в соответствии с намеченной схемой.

7.13.Инкубировать стрипы при встряхивании в течение 1-го часа в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 500–800 об/мин.

Примечание: общее время внесения калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых сывороток крови не должно превышать 15 минут, а общее время нанесения аллергенов не должно превышать 10 минут, иначе время инкубации различных образцов будет значительно отличаться, что приведет к неправильным результатам.

7.14.По окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки 5 раз. При каждой промывке во все лунки добавить по 300 мкл промывочного буфера, приготовленного по п. 7.6 и выдержать в течение 5–10 секунд с последующим декантированием. После последнего декантирования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

7.15.Во все лунки, кроме лунок А1 и А2, внести по 150 мкл конъюгата Е-2.

Приложение2

7.16.Инкубировать стрипы в течение 30 минут в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью

500–800 об/мин.

7.17.По окончании второй инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки согласно п. 7.14.

7.18.Немедленно внести во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ. Инкубировать стрипы в темноте в течение 15 минут в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 500–800 об/мин.

7.19.Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности,какирастворТМБ,по100мклстоп-реа­ гента для остановки ферментной реакции, инкубировать в течение 1–2 минут при комнатной температуре (+18…25°С).

7.20.В случае невозможности своевременно измерить оптическую плотность растворов в лунках на фотометре, рамку со стрипами можно хранить при комнатной температуре не более 15 минут.

8. Регистрация и учет результатов реакции.

8.1.Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность раствора в лунках при длинах волн: 450 нм и 405 нм.

Если программа фотометра не позволяет вычитать среднее арифметическое значение оптической плотности лунок А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой В-BТ, где ВТ — среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках А1 и А2 и В – значение оптической плотности лунки.

В линейных координатах построить два калибровочных графика в зависимости (ед. опт. плотн.) от концентрации IgE в калибровочных пробах (МЕ/мл): по результатам измерений

140

 

 

 

 

 

 

 

141

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Лабораторная диагностика аллергических заболеваний

Ю.А. Митин Приложение2

 

 

 

 

 

 

при длине волны 450 нм по значениям оптических плотнос-

калибровочные пробы и контрольную сыворотку после

 

тей проб В0…В25 построить калибровочный график №1. И

вскрытия флаконов хранить при температуре +2...8°С не бо-

 

при длине волны 405 нм по значениям оптических плотнос-

лее 1 месяца;

 

 

 

 

 

 

тей проб В0…В100 - калибровочный график №2.

конъюгаты Е-1, Е-2 и раствор ТМБ после вскрытия флако-

 

Определение концентрации аналита в калибровочных и ис-

нов хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца;

 

 

 

 

 

 

следуемых пробах производить следующим образом.

буферный раствор для промывки лунок, подготовленный к

 

В случае, если значение оптической плотности пробы, изме-

использованию, хранить закрытым при комнатной темпера-

 

ренноепри450нм,составляетменее2,3ед.опт.пл.,тодлявы-

туре (+18…25°С) не более 5 суток;

 

 

 

 

 

 

числений следует использовать калибровочный график №1.

концентрированный буферный раствор для промывки лу-

 

Если значение оптической плотности пробы при длине вол-

нок и стоп-реагент после вскрытия флаконов хранить при

 

ны 450 нм больше 2,3 ед. опт. пл., вычисления производят по

температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

 

калибровочному графику №2.

9.2. Для проведения анализа не следует использовать гемо-

 

Примечание: при использовании длины волны 620 нм в качестве

лизированную и мутную сыворотку крови.

 

референтной, за оптические плотности лунок считают разни-

9.3. Образцы сыворотки крови хранить при температуре

 

цу между измерениями основной и референтной длинами волн

+2...8°Снеболее2дней;принеобходимостиболеедлительного

 

(450 нм – 620 нм и 405 нм – 620 нм).

хранения (до 3 месяцев) — при температуре -20°С и ниже. Из-

 

9. Условия хранения и эксплуатации набора.

бегать повторных циклов замораживания-размораживания.

 

9.1. Набор АллергоИФА-специфический IgE должен хра-

9.4. При вскрытии и растворении лиофилизованных компо-

 

ниться в упаковке предприятия-изготовителя при темпера-

нентов необходимо следить, чтоб на крышке и стенках фла-

 

туре +2...8°С в течение всего срока годности. Допускается

конов не оставалось сухого вещества.

 

хранение набора при температуре до +25°С не более 5 суток.

9.5. При использовании набора для проведения нескольких

 

Срок годности набора — 12 месяцев.

независимых серий количественных анализов необходимо

 

В случае дробного использования компоненты набора необ-

иметь в виду, что для каждого независимого эксперимента

 

ходимо хранить следующим образом:

необходимо построение нового калибровочного графика и

определение концентрации иммуноглобулинов Е в конт-

 

стрипыпоместитьвпакетсэтикеткой(приупаковкестрипов

 

в пакет из 2-слойного полиэтилена), который затем вложить

рольной сыворотке.

 

впрозрачныйпластиковыйпакетсзамкомигерметичнозак­

9.6. Запрещается использовать стоп-реагенты из наборов

 

рыть. Хранить в герметично закрытом пакете с замком при

реагентов других фирм-производителей.

 

температуре +2...8°С в течение всего срока годности;

9.7. Для получения надежных результатов необходимо стро-

 

 

 

 

 

гое соблюдение инструкции.

142

 

 

 

 

 

 

 

 

143

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Лабораторная диагностика аллергических заболеваний

Для заметок:

144

Соседние файлы в папке Клинические и лабораторные анализы