6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_нарушений_гемостаза_Долгов_В_В_,_Свирин

Плазменные белки гемостаза образуют2 ферментативные системы крови, имеющие своей целью поддержание гемостатического баланса (рис. 31):

1.Система свертывания плазмы. Система со стоит из ферментов, неферментативных бел ковых катализаторов (кофакторов) и инги биторов свертывания. Конечной целью этой системы является образование важнейшего фермента тромбина, а в конечном итоге - фибринового сгустка, составляющего осно ву гемостатического тромба.

2.Система фибринолиза. Конечной целью этой системы является образование главного фер мента фибринолиза плазмина и лизис фибри нового сгустка. Эту систему составляют плазминоген и его активаторы и ингибиторы.

Обе эти системы имеют сходные черты:

ции, в котором участвует ряд белков - протеаз.

•По крайней мере, in vitro имеется несколько путей запуска каждого процесса, а в итоге об разуется один конечный продукт.

•Многие реакции нуждаются в наличии спе цифической поверхности и ионов кальция. In vivo твердой фазой для фиксации реаги рующих белков служат кислые фосфолипиды клеточных мембран, в частности мемб ран тромбоцитов, фибробластов, возможно лейкоцитов.

Кроме каскадных систем свертывания плазмы и фибринолиза, к плазменным белкам гемостаза относятся многочисленные ингибиторы и активаторы, эффекты которых проявляются как действие антикоагулянтов или прокоагулянтов и

Рис. 32. Протеолитическая активация факторов гемо-

стаза. Путем ограниченного протеолиза из неактивного предшественника образуются активный пептид и активированный фермент

для формирования фибринового сгустка. Процесс свертывания происходит в условиях насыщения субстратами (рис. 33). Вследствие этого образование гемостатического тромба может быть достигнуто при значительном диапазоне концентрации и активности конкретного фактора свертывания. Клинические проявления недостаточности компонентов свертывания возникают при их существенном уменьшении, если обратиться к рис. 33 - то это начальный диапазон, при котором скорость реакции зависит от концентрации фактора.

Для эффективного взаимодействия и активации белков свертывания крови необходимо образование комплексов этих белков, их кофакторов и субстрата (рис. 34). Эти условия не могут возникнуть в жидкой фазе. Поэтому большинство процессов активации промежуточных факторов свертывания протекают на фосфолипидах клеточных мембран. В месте сборки комплексов происходит концентрация факторов свертывания. Здесь же присутствуют кофакторы, которые существенно ускоряют процесс формирования сгустка. В создании активного комплекса участвуют:

•Фермент (активный плазменный фактор - протеолитический фермент).

•Субстрат (профермент).

•Активированный кофактор.

•Ионы Са (Са2+).

•Кислые фосфолипиды и специфические ре цепторы на поверхности клеток.

Все белки системы свертывания крови можно разделить на две группы. Одни белки для полноценного формирования требуют наличия витамина К (витамин-К-зависимые белки), а другие - нет.

Рис. 33. Соотношение между концентрацией факторов и скоростью процесса свертывания. В норме скорость коагуляции практически не определяется концентрацией факторов, так как они присутствуют в избытке и процесс идет в состоянии насыщения. Только после значительного истощения фактора его концентрация будет влиять на скорость реакции и соответственно на скорость свертывания плазмы

Рис. 34. Модель сборки комплекса факторов сверты-

вания крови. На поверхность твердой фазы (фосфолипиды фибробластов, макрофагов, активированных тромбоцитов либо, в патологических ситуациях, мембраны поврежденных клеток, бактерий и др,) прикрепляется (интернализуется) крупный кофакторный белок, который организует место контакта факторов свертывания, те в свою очередь взаимодействуют друг с другом по принципу комплементарности

К неферментным активаторам свертывания крови (коферментам) относятся факторы V и VIII. Оба - высокомолекулярные белки, имеющие сходную структуру. Они циркулируют в плазме в неактивной форме и активируются тромбином. ф.VIII в плазме связан с фактором Виллебранда(vWF), который защищает его от преждевременной инактивации. Диссоциация фVIII из комплекса с vWF происходит под воздействием тромбина (рис. 25).

ф.Va и -Villa образуют на фосфолипидных мембранах комплексы с ф.Ха и-IХа соответственно. Специфическая активность ф.Ха и -IХа в комплексах с кофакторами в десятки тысяч раз больше, чем изолированных. Основным ингибитором ф.Va и -VIIIa является комплекс протеин С - протеин S.

вильнои интерпретации результатов коагулологических тестов.

Активация протромбина - многостадийный процесс, который происходит по механизму про- ферментно-ферментного преобразования. С одной стороны, это обеспечивает нарастание сигнала:

активация одной молекулы предшествующего уровня в системе свертывания приводит к активации от нескольких десятков до нескольких сотен тысяч последующих молекул(рис. 36). С другой стороны, многостадийность позволяет более гибко регулировать процесс.

В классическом каскаде свертывания крови выделяют 2 пути активации процесса:

•Активация тканевым фактором (ТФ). Так как ТФ не относится к плазменным факторам и контактирует с кровью только при повреж дении сосуда, то активация с его участием обозначается как внешний путь свертывания.

•Активация ф.ХII при контакте с отрицатель но заряженной поверхностью твердого тела, или контактная активация. Поскольку фак тор XII в норме присутствует в плазме, акти вация с его участием обозначается как внут-

ренний путь свертывания (все факторы присутствуют в плазме в норме). Внешний и внутренний пути взаимодействуют между собой, а их разделение достаточно условно. Внешний и внутренний пути сходятся на фактореX.

Последний со своим кофактором .Vфа образует протромбиназу - ферментативный комплекс, который активирует протромбин с образованием тромбина. Образовавшийся тромбин поступает в ток крови и активирует фибриноген до фибрин-мо- номеров. Последние спонтанно соединяются, образуя полимеры фибрина. Условно свертывание плазмы (крови) делится на 2 основные фазы:

1)многоступенчатый этап, приводящий к акти вации протромбина и превращению его в ак тивный фермент - тромбин;

2)конечный этап, в котором под влиянием тром бина из фибриногена образуется фибрин.

Схема коагуляционного каскада плазменно го гемостаза представлена на рис. 37.

Внешний путь образования протромбиназы короткий, что ведет к быстрому образованию тромбина.

При контакте ТФ и ф.VIIа формируется комплекс, который активирует ф.Х. Фактор Ха при уча-

2+

стии фактора Va, в присутствии ионов Са , на отрицательно заряженной фосфолипидной поверхно-

сти формирует протромбиназу. В настоящее время полагают, что внешний путь - основной физиологический путь запуска процесса свертывания крови. Подробно его значение будет описано в разделе «Современная теория свертывания крови».

Активность внешнего пути поддерживается за счет механизма положительной обратной свя-

Внутренний путь активации свертывания начинается с активации контактных факторов коагуляционного каскада: ф.ХII, прекалликреина и высокомолекулярного кининогена.

Факторы контактной активации - ф.ХII, прекалликреин, высокомолекулярный кининоген, С1-ингибитор - синтезируются в печени. In vitro эти белки участвуют в активации внутреннего каскада свертывания.

В лабораторных условиях активация происходит на некоторых небиологических отрицательно заряженных поверхностях, например на стекле, каолине, кремнии, сульфате декстрана, а также в присутствии эллаговой кислоты. Имеются данные, что важным механизмом активации контактных факторов является их взаимодействие с поверхностью, характеризующейся свойствами твердой фазы. В патологических условиях контактная активация, вероятно, происходит на мембранах клеток крови и эндотелия, а также при контакте с коллагеном субэндотелия.

Схематично взаимодействие белков при контактной активации показано на рис. 39. Видимо, в «подходящих условиях» происходит аутоактивация и взаимоактивация ф.ХII, ПК до активных ферментов. In vitro активация контактной системы приводит к активации ф.ХI, который в свою очередь активирует .фIХ, образующий с ф.VIII теназный комплекс. Теназный комплекс (название комплекса происходит от английского слова ten - десять) активирует ф.Х, а далее процесс свертывания идет по уже описан-

ному пути. Поскольку сборка теназного комплекса происходит на фосфолипидной поверхности, для нее необходимо присутствие ионов кальция. Контактная фаза активации поддерживается положительной обратной связью. Тромбин активирует ф.VIII и -XI.

Физиологическое значение контактной активации, роль факторов контактной активации в процессе свертывания крови, физиологические активаторы и условия активации этих факторов в организме требуют дальнейшего изучения.

Рис. 39. Контактная фаза активации плазменных фак-

торов. Контакт с поверхностью твердого тела вызывает активацию фактора XII, который запускает каскад свертывания плазмы, каскад активации фибринолиза, активацию калликреин-кининовой системы (положительная обратная связь) и активацию системы комплемента(отрицательная обратная связь)

Классическая теория свертывания крови оставляла слишком много вопросов и противоречила клиническим данным. Например, с одной стороны, было неясно, какая поверхность в физиологических условиях является активатором, с другой стороны, почему дефицит факторов внутреннего пути (ф.VIII, -IX, -XI) приводит к выраженной кровоточивости при нормальной активности факторов внешнего пути, а глубокий дефицит факторов контактной активации, как правило, не сопровождается геморрагическим синдромом. В современной каскадно-матричной теории гемостаза эти противоречия разрешены.

С современной точки зрения, контактная активация играет большую роль во взаимодействии системы свертывания крови с другими протеолитическими системами крови (фибринолитической, ангиотензин-рениновой, калликреин-кини- новой, системой комплемента и др.).

В настоящее время изучены следующие функции белков контактной активации:

1.Брадикинин стимулирует повышение внутри клеточной концентрации цАМФ и приводит к:

•Вазодилатации и снижению артериально го давления.

•Активации системы фибринолиза путем стимуляции секреции тканевого актива тора плазминогена.

•Ингибированию активации тромбоцитов.

•Стимуляции репарации и росту гладкомышечной ткани в поврежденных сосудах.

2.Прямое ингибирование тромбин-индуциро- ванной активации тромбоцитов.

3.Активация фибринолиза.

•Непосредственная активация плазмино гена калликреином и ф.ХIIа. Однако оба этих белка значительно менее активны, чем тканевой активатор и урокиназа.

•Активация калликреином проурокиназы до активной сериновой протеазы - двухцепочечной урокиназы.

4.Блокада клеточной адгезии.

5.Антиангиогенное действие.

6.По-видимому, контактная активация играет важную роль в активации свертывания кро ви при взаимодействии крови с нефизиоло гическими поверхностями, в частности при установке искусственных протезов или искус ственных клапанов сердца.

Внутренний путь образования протромбиназы (рис. 40) включает активирующее действие ф.ХПа на ф.Х1, который в свою очередь активирует ф.1Х.

Поскольку значение контактной активации в процессе свертывания крови переосмыслено, физиологическая роль ф.Х1 изучается. Видимо, в физиологических условиях ф.Х1 в основном активируется тромбином. ф.Х1 довольно устойчив к инактивации ингибиторами и имеет длительный период полувыведения. Образовавшись в достаточном количестве, ф.Х1 увеличивает количество активного ф.1Х, за счет чего соответственно значительно возрастает концентрация тромбина, который в свою очередь активирует по механизму положительной обратной связи ф.1Х, -VIII и -V. В то же время избыток тромбина тормозит начало процесса фибри-

Рис. 40. Внутренний каскад активации плазменного ге-

мостаза. Начинается с взаимной активации контактных факторов системы гемостаза, Фактор XIIа переводит фактор XI в ХIа. Фактор ХIа активирует факторIX. Все последующие этапы активации свертывания по внутреннему пути

2+

требуют ионов Са и зависят от присутствия фосфолипидов. Фактор IХа активирует фактор X, но эта реакция не очень эффективная. Однако появившийся тромбин активирует фактор VIII. Активный фактор Villa вместе с фактором IХа, ионами Са2+ и фосфолипидами очень эффективно активирует фактор Ха, Обратная связь поддерживает развитие процесса за счет активации тромбином ф.VIII, -IX и -V

Конечная стадия каскада свертывания плазмы заключается в образовании из растворимого плазменного белка фибриногена нерастворимого фибрина под воздействием тромбина и ф.ХIII

(рис. 42).

Рис. 42. Последовательные стадии образования нераст-

воримого фибрина из растворимого фибриногена

Тромбин

Тромбин - ключевой фермент гемостаза. Тромбин - витамин-К-зависимый белок - является сериновой протеазой. В печени происходит синтез неактивного предшественника протромбина, который в дальнейшем циркулирует в плазме. В комплексе ф.Ха-Va-II на фосфолипидной поверхности происходит ограниченный протеолиз протромбина. Образуется несколько активных структур с уменьшающейся молекулярной массой - мезотромбин, α-тромбин, β-тромбин, γ-тромбин. Наиболее значимым продуктом является сериновая протеаза - α-тромбин. На мо-

лекуле тромбина имеется, по крайней мере, 4 сайта связывания для субстратов, ингибиторов, кофакторов и иона кальция. Это, а также способность тромбина активно функционировать не только на твердой фазе, но и в токе крови позволяет ему выполнять многочисленные функции. Важнейшие функции тромбина в гемостазе:

•Ограниченный протеолиз фибриногена до фибрин-мономеров (происходит в жидкой фазе - кровотоке).

•Активация ф.V, -VIII, -VII, -XI.

•Активация тромбоцитов.

•В комплексе с тромбомодулином тромбин активирует протеин С.

•Активация ф.ХIII.

•Ограниченный протеолиз плазматической карбоксипептидазы В до активной формы - активируемого тромбином ингибитора фиб ринолиза (TAFI).

•Стимуляция выброса из эндотелиоцитов тка невого активатора плазминогена.

Однако роль тромбина в организме не огра ничивается вышеперечисленными функциями. Ключевая роль в процессе свертывания крови, активация сосудистого эндотелия, клеточный рост и процессы репарации, активация перифе рических клеток крови, активация фибриноли за - это наиболее изученные функции тромби на. Видимо, со временем этот список значитель но увеличится.

мина с фибрином, что способствует предотв ращению преждевременного лизиса фибринового сгустка.

•Значительную роль ф.ХIII играет в процес сах полимеризации актина, миозина и других компонентов цитоскелета тромбоцитов, что чрезвычайно важно для активации тромбо цитов и ретракции образовавшегося фибринового сгустка. Это объясняет наличие ф.ХIII в цитоплазме тромбоцитов.

•Обнаружены перекрестные реакции ф.ХIII с ф.V, фон Виллебранд протеином.

Помимо непосредственно реакций гемостаза,

ф.ХIII участвует в процессах образования соединительной ткани, репаративных реакциях:

•Участвует в связывании молекул фибронектина между собой и с молекулами фибрина. Вероятно, это важно для направленной миг рации клеток и процессов репарации.

•Играет роль в биосинтезе коллагена, катали зируя образование связей между молекулами коллагена типов I, II, III и V.

относительно друга (рис. 43). Пространственная структура молекулы

фибриногена состоит из центрального Е-доме- на и 2 периферических D-доменов. α- и β-цепи формируют глобулярные структуры - фибринопептиды А и В (ФПА и ФПВ), которые закрывают комплементарные участки в фибриногене и не позволяют этой молекуле полимеризоваться. Процесс взаимодействия фибриногена и тромбина происходит в жидкой фазекровотоке. Тромбин соединяется с фибриногеном и отщепляет конечные последовательности от -αи β-це- пей - 2 ФПА и 2 ФПВ (рис. 44). Образуются ра-

Рис. 44. Формирование фибрин-мономеров из фибри-

ногена. Тромбин отщепляет фибринопептиды ФПА и ФПВ от молекулы фибриногена, тем самым образуются растворимые мономеры фибрина, которые способны полимеризоваться до линейного полимера, или «растворимого фибрина»

створимые мономеры фибрина. В дальнейшем происходит спонтанное соединение комплиментарных участков фибрин-мономеров. Сначала образуются димеры, далее олигомеры и в конечном итоге собираются мононити полимеризованного фибрина. Таким образом, фибриновая цепь формируется спонтанной, конец в конец полимеризацией фибрин-мономеров, при которой концевая часть одного мономера взаимодействует с центральной частью другого мономера в месте отщепления ФПА. Результатом такой полимеризации является линейный полимер шириной в 2 молекулы (рис. 44). На этом этапе фибрин легко растворим в 5-молярной

мочевине, поэтому он получил названиераство-

римого фибрина.

Соединяясь с фибриногеном, тромбин не только отщепляет фибринопептиды. но и активирует связанный с ним фактор XIII. Фактор ХIIIа образует ковалентные связи между γ-цепями(D-доме- нами) нитей растворимого фибрина (рис. 45), которые соединяются за счет образования пептидных мостиков между боковыми радикалами лизина и глютамина. Сшитые между собой мононити фибрина образуют прочную сеть, менее подверженную фибринолизу и более устойчивую к механическим воздействиям. В такой форме фибрин не растворяется в 5-молярной мочевине и на-

зывается нерастворимым фибрином.

Образовавшийся фибриновый сгусток - трехмерная молекулярная сеть, в которую включены тромбоциты, эритроциты и лейкоциты (рис. 46). Активированные тромбоциты, связанные с нитями фибрина через рецепторы GPIIb-IIIa, сокращают-

Рис. 46. Организованный тромб, в котором в фибрино-

вую сеть включены клетки крови