6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_нарушений_гемостаза_Долгов_В_В_,_Свирин

При использовании u-РА метод в техническом исполнении несколько проще, чем при использовании избытка t-PA, и может быть автоматизирован на современных анализаторах.

Содержание PAI-1 в системе циркуляции подвержено суточным ритмам, поэтому пробы при системном анализе необходимо брать в одно время, лучше по утрам. Кроме того, PAI-1 - один из самых неустойчивых белков плазмы, поэтому определение необходимо проводить сразу после взятия крови, транспортировка может привести к потере активности PAI-1 в пробе.

Завышенные результаты теста можно получить при увеличении активностиPAI-2. Этот ингибитор повышается при беременности, поэтому в данном случае исследованиеPAI-1 описанным выше методом может дать ложные результаты. В последнее время активно используется определение PAI-1 методом ELISA или комбинацией иммунохимических и функциональных методов.

Определение тканевого активатора плазминогена (t-PA)

Тканевой активатор плазминогена (t-PA) освобождается в кровоток из эндотелиальных клеток сосудистой стенки, где он синтезируется. Поэтому диагностика дефицита t-PA основывается не только на определении концентрацииt-PA в крови, но и на способности освобождаться из сосудистой стенки при стрессовых воздействиях, в

частности при манжеточной пробе(дозированном пережатии вен). Сначала определяют базовый уровень t-PA, потом на 10-15 минут на предплечье накладывают жгут или раздувают манжетку, вызывающую венозный стаз, затем берут вторую порцию крови, в которой повторно определяют t-PA. Сравнивают результаты обеих проб. Из-за быстрой инактивации тканевого активатора плазминогена PAI-1 и другими ингибиторами пробы крови необходимо немедленно закислить, чтобы предупредить инактивацию t-PA in vitro.

В настоящее время выпускаются специальные пробирки с кислым антикоагулянтом. t-PA имеет суточный ритм, поэтому его необходимо определять так же, как PAI-1.

t-PA обладает высокой амидазной активностью, позволяющей эффективно использовать для его определения метод хромогенных субстратов. Однако при низких концентрациях t-PA в плазме требуется проведение дополнительных процедур непрямого определения активности фермента через плазминоген и использование растворимого фибрина (рис. 125).

Определение t-PA проводится у больных с тромбофилией как часть панели тестов на выявление причины тромбофилии, особенно при нагрузочных манжеточных пробах. Повышение t-PA после инфаркта миокарда рассматривается как неблагоприятный фактор. Нарушение освобождения t-PA после венозного стаза описано у больных с тромбозами и патологией почек.

Определение D-димеров

D-димеры - это специфические продукты деградации фибрина, входившего в состав тромба. Они образуются в процессе лизиса сгустка крови под влиянием плазмина и некоторых неспецифических фибринолитиков (рис. 60). Концентрация D-димеров в сыворотке пропорциональна активности фибринолиза и количеству лизируемого фибрина. Этот тест позволяет судить об интенсивности процессов образования и разрушения фибриновых сгустков.

Определение D-димеров проводится иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител, иммунодиффузии, методом турбидиметрии, латекс-агглютинации (табл. 32). Во всех методах исследования используются моноклональные антитела к эпитопам наD-димере, которые образуются при расщеплении нерастворимого фибрина плазмином. Этих эпитопов нет на фибриногене и растворимых фибрин-мономе- рах, поэтому D-димеры - показатель того, что в процессе фибринолиза расщепляется именно фибрин, а не фибриноген или фибрин-мономеры. Поскольку эти антитела не взаимодействуют с фибриногеном, исследования могут проводиться как в плазме, так и в сыворотке.

Принцип теста, основанный на методеELISA на твердой фазе (стриппированные планшеты), с нанесенными на поверхность пластика первичными антителами, показан на рис. 126. Так как D-ди- меры - не стандартизованный аналит, то разные методы могут показывать разные результаты,

несмотря на то, что используются специфические антитела и калибраторы.

На определение D-димеров практически не оказывает влияние техника взятия крови, примесь тромбоцитов, не требуется использования ингибиторов для подавления других факторов.

Повышение уровня D-димеров в крови определяется при возникновении венозных тромбозов, атеротромбозе, тромбоэмболии легочной артерии, ДВС-синдроме, после операций, особенно при большом операционном поле и других состояниях с повышенным образованием

Рис. 126. Принцип метода ELISA для определения D-ди-

меров. Специфические антитела нанесены на твердую фазу (пластик). С ними взаимодействует субъединица D из пробы и остается иммобилизованной на твердой фазе, Добавляются проявляющие антитела, конъюгированные с ферментом, которые могут взаимодействовать только сD-ди- мерами. Несвязавшиеся антитела отмываются, добавляется субстрат для фермента, по изменению окраски раствора определяется количество D-димеров, D-мономеры, формирующиеся при деградации фибриногена и входящие в состав ПДФ, не определяются тестом на D-димеры

Таблица 32

Контроль качества в коагулологии является центральным элементом обеспечения эффективности диагностических исследований. Помимо непосредственного контроля за самой аналитической процедурой, необходимо стандартизовать и контролировать взятие и подготовку образцов на преаналитическом этапе. Оценка полученных данных должна проводиться с учетом состояния пациента, используемых им лекарственных препаратов, особенностей подготовки образца на преаналитическом этапе, методики выполнения анализа, используемых инструментов и реактивов. О высокой степени качества и

диагностической эффективности лабораторных исследований можно говорить лишь тогда, когда под контролем находится весь процесс от назначения исследования и взятия биологического материала до получения достоверного результата. Решающим фактором правильности выполнения исследования является проведение всеобъемлющего внутрилабораторного контроля качества всех выполняемых тестов. Оптимальная система контроля предполагает оценку качества лабораторных исследований на внутрилабораторном, федеральном и международном уровнях.

Калибраторы требуются для многих тестов. Часто для практических целей используется свежая сливная плазма от нескольких (не менее 5, желательно более 20) здоровых доноров (пулированная плазма, или пул-плазма). Основой применения пул-плазмы является представление о том, что при смешивании плазмы значительного количества здоровых доноров (в импортных пулах смешивается плазма десятков и сотен тысяч здоровых доноров) активность практически всех факторов гемостаза становится средней для данной популяции и принимается за 100%, или 1 Ед/мл.

Тем не менее возможны колебания активности различных факторов в пул-плазмах, собранных в разных регионах. Это связано с несколькими факторами:

•имеются генетически детерминированные особенности активности различных факторов

вданной популяции людей;

•при использовании пула плазмы, набранной от ограниченного количества доноров (20 и менее), однонаправленные изменения актив ности фактора у нескольких из них могут вли ять на результирующую активность фактора

впуле.

Эти факторы обуславливают необходимость федерального и международного контроля активности различных факторов в пуле. Приготовление пулированной плазмы для коагулологической

диагностики требует соблюдения некоторых условий:

•необходимо собрать плазму от достаточного количества доноров в течение ограниченно го времени;

•пул-плазму необходимо тщательно переме шать до однородной массы;

•рационально хранить ее небольшими порци ями;

•температура хранения должна быть не выше

-40 °С.

Все это часто делает невозможным приготов-

ление пул-плазмы в клинико-диагностической лаборатории. Однако у приготовленной на месте плазмы есть одно преимущество: активность факторов в ней соответствует средней для популяции, проживающей в данном регионе.

Альтернативой пул-плазме являютсякоммер-

ческие контрольные плазмы, которые готовятся

на биологической матрице(лучшие из плазмы человека) путем добавления определенных количеств факторов от тестированных доноров, или

коммерческие пулированные плазмы, при изго-

товлении которых смешивается плазма десятков и даже сотен тысяч доноров. Такие плазмы, как правило, проходят строгий международный контроль. В продаже имеются не только нормальные контрольные плазмы, но и плазмы, дефицитные по отдельным факторам.

Обычно на основе калибраторов делается серия разведений и строится калибровочная кривая. Как правило, для построения калибровочной кривой бывает достаточно 4 разведений. При нелинейной калибровке используют6 разведений калибратора.

В соответствии с клиническими и аналитическими потребностями предлагаются калибровочные растворы для следующих основных коагулологических тестов:

цедура приготовления которой определены в стандарте DIN58939-1.

Стандарты ВОЗ

Для некоторых аналитов, определяемых в клинико-диагностических лабораториях, Всемирная организация здравоохранения(ВОЗ) рекомендует международные стандарты. На основе этих стандартов изготовлены стандартные образцы

бинового комплекса и всех факторов сверты вания, определяемых коагуляционными ме тодами;

•калибровочная плазма для колориметричес ких методов определения AT, протеина С;

•калибровочная плазма для определения фиб риногена хронометрическим или оптичес ким методом на основе протромбинового времени;

•калибровочная плазма для определения кон центрации нефракционированного и низко молекулярного гепарина.

Референтная плазма - централизованно приготовленная нормальная плазма, критерии и про-

свою очередь производят вторичные стандарты, тестированные по первичным стандартам. Вторичные стандарты фасуются вместе с выпускаемыми коммерческими наборами реактивов. Среди стандартов ВОЗ для системы гемостаза широко известен стандарт тромбопластина, используемый в тесте протромбиновое время(ПВ). Фир- мами-изготовителями стандартизация по«индексу чувствительности» (ISI, или МИЧ) проводится по одному из международных эталонов(RBT/90, ВСТ/253 и др.). Этот индекс чувствительности, если он определен, указывается на упаковке реагента и в инструкции к выпускаемому тромбопластину.

двух документах: приказе МЗ РФ № 45 и отрас-

левом стандарте ОС 91500.13.0001-2003.

Согласно этим документам требуемое аналитическое качество аналитов определяется следующими характеристиками:

1.«Предельно допустимые значения смещения (В) и коэффициента общей аналитической вариа ции (CV), рассчитанные по 20 измерениям оп ределяемого аналита в контрольном материа ле». В табл. 36 приведены объединенные дан ные нормативных документов, установленные путем экспертной оценки на основе сведений о биологической вариации и данных об анали тической вариации в лабораториях России.

2.«Биологически обоснованные нормы анали тической точности клинических лаборатор ных исследований». Данные взяты из между народной базы данных и получены, исходя из следующих предположений.

Целевое значение коэффициента общей аналитической вариации не должно превышать половины коэффициента внутрииндивидуальной вариации, или:

где CV - целевое значение коэффициента общей аналитической вариации, %; CV: - коэф-

фициент внутрииндивидуальной биологической вариации, %.

Требования к целевому значению смещения формулируются в виде неравенства:

где В - целевое значение смещения средней арифметической от установленного значения, %; CVl - коэффициент внутрииндивидуальной биологической вариации, %; CVG - коэффициент межиндивидуальной биологической вариации, %.

Таблица 36

Биологически обоснованные нормы аналитической точности клинических лабораторных исследований

Межлабораторный контроль качества показателей гемостаза организован в рамках Федеральной системы внешней оценки качества лабораторных исследований (ФСВОК). Ниже приведены соответствующие программы, в которых должна участвовать каждая КДЛ, занимающаяся исследованием гемостаза.

Раздел ФСВОК «Коагулология»: оценка каче-

ства исследований показателей плазмы крови в нормальном и патологическом диапазонах - протромбиновое время (индекс и международное нормализованное отношение); АЧТВ (индекс); фибриноген и тромбиновое время (индекс).

Контрольные образцы: лиофилизированная плазма человека.

Число циклов за год: 3 или 6 по выбору лабо-

ратории.

«Коагулология-1,5»: для лабораторий, которым для двукратного измерения всех исследуемых из числа вышеперечисленных показателей достаточно 1,5 мл плазмы.

«Коагулология-3»: для лабораторий, которым для двукратного измерения всех исследуемых из числа вышеперечисленных показателей достаточно 3,0 мл плазмы.

«Коагулология-4,5»: для лабораторий, которым для двукратного измерения всех исследуемых из числа вышеперечисленных показателей достаточно 4,5 мл плазмы.