6 курс / Кардиология / Биохимические_и_генетические_особенности_реализации_патогенности

112

S. haemolyticus SH527 были выявлены в большем количестве по сравнению с количеством бактерий штамма S.epidermidis SE36-1 и в меньшем количестве по сравнению с количеством клеток S. aureus ATCC29213. В отличие от взаимодействия клеток НТ-29 с S.epidermidis SE36-1 деструкции клеток НТ-

29, характеризующейся детекцией остатков клеточного скелета, под действием SH527 на этих сроках инкубации выявлено не было (рис. 19 А, B,

С). Через 24 часа инкубации происходила дезорганизация клеточного пласта с образованием конгломератов клеток. На поверхности конгломератов наблюдали прикрепленные клетки стафилококков, практически полностью покрывавших поверхность клеток НТ-29. В некоторых участках стафилококки были покрыты ЭПС (рис. 19 D). Через 48 часов инкубации процесс дезорганизации клеточного пласта, инфицированного стафилококками, продолжался. Количество клеток НТ-29 существенно уменьшилось. Также можно было видеть скопления стафилококков, с

фрагментарным покрытием ЭПС (рис. 19 E, F).

114

Общее токсическое воздействие стафилококков на культуру клеток человека НТ-29

Общее токсическое воздействие бактерий изучаемых штаммов (S. aureus

ATCC29213, S. haemolyticus SH527, S.epidermidis SE36-1) на культуру клеток человека НТ-29 оценивали посредством измерения активности ЛДГ,

вырабатываемой клетками культуры человека. Кинетика изменения активности ЛДГ клеток НТ-29 при добавлении суспензии бактерий, а также при добавлении культуральной жидкости представлена на рисунке 20 А и В,

соответственно. В качестве контроля на этих же рисунках представлена кинетика изменения ЛДГ под действием триптон-соевого бульона и при добавлении эквивалентного количества среды DMEM. Для сопоставления кинетики изменения активности ЛДГ клеток НТ-29 под действием изучаемых стафилококков и стадии роста бактерий были получены кривые роста изучаемых штаммов стафилококков (рис. 21). Наиболее быстро достигает стационарной фазы роста S. aureus ATCC29213 (7 часов), для S. haemolyticus

SH527 и S.epidermidis SE36-1 стационарная фаза роста наступает через 9 и 10

часов соответственно.

118

Идентификация белков проводилась на основании базы данных, содержащей предсказанные по полногеномным данным белки референсного штамма S. haemolyticus JCSC1435. В исходном образце культуральной жидкости максимальное количество белков, идентифицированных по одному и более пептиду, составило 184, максимальное количество белков,

идентифицированных более чем по одному пептиду – 90.

Хроматографические фракции 4 и 5 содержали 141 и 115 белков,

идентифицированных по одному и более пептиду, соответственно. При условии, что идентификация белков проводилась более чем по одному пептиду, для фракций 4 и 5 максимальное количество белков составило 54 и 68, соответственно. Для выявления среди найденных белков секретируемых,

была определена клеточная локализация идентифицированных белков культуральной жидкости и ее хроматографических фракций (4 и 5) (таблица

21). Было показано, что большая часть найденных белков, является цитоплазматическими (148 белков для исходной культуральной жидкости и

113 и 97 –для фракций 4 и 5, соответственно). Кроме того, были найдены белки клеточной стенки и цитоплазматической мембраны как для исходной культуральной жидкости, так и для изучаемых фракций. Наибольший интерес представляют, выявленные в культуральной жидкости и хроматографических фракциях, секретируемые белки (10 белков - для культуральной жидкости, 5

белков - для 4 фракции и 7 – для 5 фракции). Фактор, ответственный за гемолитическую активность изолята SH527 S.haemolyticus, должен быть идентифицирован во всех трех образцах, обладающих гемолитической активностью (образец культуральной жидкости и образцы ее хроматографических фракций 4 и 5). В ходе анализа таких белков было отобрано 5 секретируемых и 45 цитоплазматических (таблица 22 и таблица

23). Функции гипотетических белков были определены на основании генной онтологии. Таким образом, было отобрано пять секретируемых белков и 45

120

Таблица 21. Клеточная локализация идентифицированных белков

культуральной жидкости и ее хроматографических фракций (4 и 5)

Таблица 22. Перечень секретируемых белков, обнаруживаемых в

исходной культуральной жидкости и хроматографических фракциях 4 и

5, обладающих гемолитической активностью

Идентифицируемые белки (функции гипотетических белков основываясь на генной онтологии), класс фермента

гипотетический белок SH0168 (предшественник триацилглицерол-липазы), EC: 3.1.1.3

N-ацетилмурамоил-L-аланин-амидаза, EC: 3.5.1.28

гипотетический белок SH0362 (гипотетический белок схожий с антигеном В)

гипотетический белок SH0762 (гомолог предшественника SsaA, секреторный антиген)