5 курс / Инфекционные болезни / Доп. материалы / Хламидийно_ассоциированные_инфекции_Хворик_Д_Ф_

•оценки состояния эпителия уретры, влагалища, цервикального канала;

•оценки степени лейкоцитарной реакции;

•исключения сопутствующих ИППП;

•оценки состояния микробиоценоза влагалища. Диагностическими критериями, подтверждающими на-

личие уретрита у мужчин, являются:

•обнаружение 5 полиморфноядерных лейкоцитов и более в поле зрения в мазках из уретры при просмотре более 5 полей зрения (увеличение микроскопа 1000);

•обнаружение 10 лейкоцитов и более в осадке первой порции мочи (увеличение микроскопа 400).

Диагностическим критерием, подтверждающим наличие уретрита у женщин, является обнаружение 10 и более полиморфноядерных лейкоцитов в поле зрения в мазках из уретры при просмотре > 5 полей зрения (увеличение микро-

скопа 1000).

Диагностическим критерием, подтверждающим наличие вагинита, является соотношение полиморфноядерных лейкоцитов к клеткам плоского эпителия более чем 1 : 1.

Диагностическим критерием, подтверждающим наличие цервицита, является обнаружение 10 полиморфноядерных лейкоцитов и более в поле зрения в мазках из цервикального канала при просмотре более 5 полей зрения (увеличение микроскопа 1000). Для установления диагноза цервицита обязательно наличие клинических признаков воспаления (слизисто-гнойных выделений из цервикального канала), т.е. диагноз может быть установлен при наличии совокупности клинических и лабораторных показателей [39].

С целью идентификации микоуреаплазм можно применять прямую реакцию иммунофлюоресценции, предназначенную для детекции антигенов возбудителя в мазках, соскобах, мазках-отпечатках из цервикального канала, уретры и влагалища. Принцип действия метода основан на реакции ан- тиген-антитело: меченные ФИТЦ антитела против микоплазм специфически соединяются с антигенами, находящимися в фиксированных образцах. При изучении препарата в люминесцентном микроскопе наблюдают флюоресценцию микоплазм в виде отдельных гранул на мембранах клеток. Иссле-

141

дуемый материал должен содержать значительное количество эпителиальных клеток; в сомнительных случаях исследование необходимо повторить. Микоплазмы светятся яркозеленым светом, а желтую или зеленовато-желтую флюоресценцию расценивают как артефакт. Невысокая чувствительность и субъективность оценки данного метода ограничивают его применение с диагностической целью. В связи с чем, прямую реакцию иммунофлюоресценции можно использовать лишь в качестве скрининговых тестов, и полученные результаты всегда следует сопоставлять с клиническими и другими лабораторными данными (культуральными или молеку- лярно-биологическими).

Серологические методы (ИФА), широко распространенные для верификации возбудителей других ИППП, в последнее время начали применять и для выявления микоуреаплазмоза. Существенным недостатком перечисленных тестов является тот факт, что гуморальные антитела к M.hominis и U.urealyticum могут присутствовать у клинически здоровых лиц, а инфицирование людей U.urealyticum не всегда сопровождается повышением уровня антител, поэтому методы серологического выявления специфических антител эффективны лишь в определенных, как правило, острых случаях. Только выявление нарастания титра антител не менее чем в 4 раза может служить диагностически важным критерием. В большинстве случаев серологические исследования не позволяют четко интерпретировать полученные результаты. Это объясняется высокой антигенной разнородностью возбудителя. К тому же у микоплазм, лишенных клеточной стенки, отсутствуют достаточно выраженные антигенные детерминанты, следствием чего является слабая стимуляция антителообразования, поэтому анализ серологических данных весьма затруднен. Этим объясняется довольно низкая (62–75%) диагностическая ценность вышеупомянутых тестов [39, 220].

Несмотря на это, обнаружена корреляция между уровнем специфических IgA, IgM, IgG и выделением микоплазм у лиц с негонококковыми уретритами. У женщин с послеродовыми осложнениями, вызванными микоплазмами, отмечалось четырехкратное нарастание титра антител, а у женщин со спонтанными абортами на 2 месяце беременности, наряду

142

с выделением микоплазм, наблюдались высокие титры антител. Аналогичные данные получены и при моделировании инфекции, вызванной M.hominis, на животных. Однако при обследовании женщин, больных сальпингитом, микоплазменная этиология которого доказана бактериологически, лишь у 34% обследованных обнаружено увеличение уровня специфических IgM. При обследовании женщин с сальпингитами и цервицитами у 50% пациенток была выделена M.hominis, а четырехкратное нарастание титра антител отмечено лишь у 25% женщин.

С учетом того, что большинство штаммов микоуреаплазм относится к условно-патогенным микробам, положительный результат ИФА не является безусловным основанием к назначению терапии, а сам метод требует дополнительного изучения и сопоставления с клиническими данными и результатами детекции прямыми методами (культуральными или молекулярно-биологическими). Данные методики могут играть лишь определенную роль в эпидемиологических исследованиях, касающихся урогенитальных микоплазм.

Одним из наиболее эффективных методов детекции микоуреаплазм является микробиологическое, или культуральное, исследование. Исследования проводят с материалом из слизистой уретры, сводов влагалища, канала шейки матки, периуретральной области и других подозрительных локализаций, а также с пробами мочи. При транспортировке биоматериал помещают в транспортную среду, приготовленную на той же основе, что и культуральная, не содержащую аргинина, мочевины и других метаболитов, и включающую, с целью предотвращения контаминации, ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры [39].

Классический метод выявления генитальных микоплазм – культуральный метод, т.е. посев на питательные среды. Этот метод дает возможность оценить количество микоплазм, которые содержатся в исследуемом материале. У мужчин материалом для исследования являются отделяемое уретры и первая порция мочи, в ряде случаев исследованию подлежат эякулят и секрет простаты. У женщин чаще всего исследуют вагинальные и цервикальные выделения и первую порциюмочи. Материалы из уретры у женщин исследуют ре-

143

же, так как особенно обильный рост микоплазм происходит при посеве цервикальных и вагинальных выделений. Чтобы избежать высыхания взятых образцов, тампоны, которыми берут материал, погружают в транспортную среду (в ростовую среду для микоплазм или сахарозофосфатный буферный раствор, рН 6,0 – 6,5) [192].

Многие исследователи используют количественные критерии в диагностике, полагая, что концентрация уреаплазм более 104 микробных тел в 1 мл или 1 г отделяемого имеет диагностическое значение, в то время как более низкие концентрации не должны учитываться, поскольку в таких количествах уреаплазмы могут находиться у здоровых людей. Посев исследуемого материала обычно производят на плотную и в жидкую питательные среды, при этом желательно использовать два образца сред для каждого клинического материала. Одновременно производят посев на среды с разведениями антибиотиков для определения чувствительности к ним [38, 170].

Наличие у уреаплазмы фермента уреазы позволило использовать для детекции продуктов расщепления мочевины чувствительный цветной тест с индикатором феноловым красным (индикатор Кларка). При росте U.urealyticum цвет среды изменяется от желтого к красному без помутнения раствора и выпадения осадка. Широко используемая среда U- 9 (Shepard М. и соавт., 1974) позволяет количественно оценить содержание уреаплазм в образцах мочи и уретральных экссудатах.

За предшествующие годы значительно усовершенствованы питательные среды. Установлено, что для роста микоуреаплазм необходимы холестерин, жирные кислоты, фосфолипиды, глико- и фосфогликолипиды, содержащиеся в лошадиной сыворотке (Раковская И.В., Вульфович Ю.В., 1995; Дмитриев Г.А., 2003).

Для выращивания микоплазм требуется высокое содержание холестерина и предшественников синтеза нуклеиновых кислот в питательной среде. В качестве источника холестерина в питательные среды для микоплазм вводят нативную лошадиную сыворотку в объеме 20%. Как источник предшественников синтеза нуклеиновых кислот используют

144

дрожжевой экстракт из пекарских дрожжей, его вносят в среду в объеме 10%.

В качестве основы питательной среды можно использовать триптические перевары сердечной мышцы крупного рогатого скота, инфузы из этого же материала, а также триптиказосоевый бульон или настойный бульон из плаценты и плотную среду на этой же основе [39].

К жидкой части основы добавляют 1% ферментативного пептона (триптона), 0,5% NaCl, устанавливают рН 7,4 для выращивания М.hominis и 6,0 – для U.urealyticum. Для плот-

ных питательных сред добавляют 2% агар-агара. Среды стерилизуют в автоклаве и к стерилизованной среде перед посевом в нее исследуемого материала добавляют лошадиную сыворотку и дрожжевой экстракт. Для подавления бактериальной флоры, содержащейся в биологическом материале, в среду вводят ацетат таллия в конечной концентрации 1:2000 и пенициллин – 1000 ед/мл.

Так как микоплазмы лучше растут в первой генерации в жидких питательных средах, то конструируют жидкие дифференциально-диагностические среды: для выделения М.hominis – с добавлением 0,1% L-аргинина, для U.urealyticum – 0,1% мочевины. В эти среды вводят индикатор – феноловый красный в концентрации 0,002%, по изменению цвета которого судят о разложении аргинина или мочевины с образованием аммиака и ощелачиванием среды. Желто-красный цвет среды переходит в лиловый вследствие ферментативной активности растущих микоплазм. Можно использовать серийные разведения исследуемого материала в лунках панели или в рядах пробирок для определения концентрации микоплазм в материале [39].

Данный подход использован в коммерческих наборах Sanofi, BioMerieux (Франция). Рост микоплазм в жидких средах необходимо подтвердить высевом на плотные среды, при этом учитывать быструю гибель уреаплазм в щелочной среде. Для высева на плотную питательную среду оптимальным является время начала изменения цвета среды. В современных условиях для поддержания рН среды для уреаплазм ис-

пользуют HEPES – буфер 0,05М [39].

145

Рост колоний М.hominis появляется через 24–48 ч в виде характерных колоний с плотным центром и кружевной периферией – «яичница-глазунья». Невооруженным глазом колонии не видны и плохо различимы. Рост колоний на плотной среде рассматривают при малом увеличении микроскопа (х60). Для U.urealyticum характерно образование очень мелких колоний на агаре и часто сливной рост. Для лучшей их визуализации к плотной среде добавляют мочевину и индикатор ее разложения – MnS04. Колонии U.urealyticum окрашиваются на этой среде в коричневый цвет. Определение антигенов микоплазм, т.е. серологическое подтверждение видовой принадлежности выделенной культуры, в обычной практике не производится, хотя это возможно путем эпифлюоресценции – нанесения специфических люминесцирующих антител на поверхность плотной питательной среды и просмотр под малым увеличением в люминесцентном микроскопе.

Для определения чувствительности выделенной культуры к антибиотикам используют метод разведений в жидкой среде. При этом, как правило, берутся пограничные для данного антибиотика концентрации. Пробирки с агрининовым бульоном (для M.hominis) или бульоном с мочевиной (для U.urealyticum), содержащие 2–3 концентрации выбранного антибиотика, засевают испытуемой культурой. Отсутствие роста свидетельствует о чувствительности микроорганизма к данному препарату, появление роста в пробирке с меньшей концентрацией антибиотика свидетельствует об умеренной устойчивости культуры, а рост во всех пробирках – о ее устойчивости. Основным недостатком такого метода определения антибиотикорезистентности является его высокая трудоемкость при абсолютно низкой стандартности исследования. Указанный недостаток может быть устранен при использовании коммерческих тест-систем для определения чувствительности микоплазм к антибиотикам. Так, тест-система Mycoplasma 1ST (BioMerieux, Франция) позволяет определить чувствительность к 6 препаратам – тетрациклину, доксициклину, эритромицину, джозамицину, офлоксацину по двум контрольным точкам и к пристинамицину – по одной точке.

Тест-система S.I.R. Mycoplasma (Diagnostics Pasteur, Фран-

ция) предназначена для определения чувствительности к 8

146

антибиотикам – доксициклину, миноциклину, лимециклину, джозамицину, эритромицину, клиндамицину, пристинамицину и офлоксацину. В первой из названных систем процессы первичного выделения и определения антибиотикорезистентности совмещены, что приводит к неоправданным затратам в случае отрицательного исследования, однако такая стратегия позволяет при положительном результате выдать окончательный ответ на 1–2 суток раньше, чем при использовании второй тест-системы [39, 217].

Таким образом, с учетом структурно-функциональных особенностей микоуреаплазм культуральную диагностику, включая количественный учет результата и определение чувствительности к антибиотикам, следует считать важным компонентом процесса обследования пациентов.

Свнедрением в практику молекулярно-биологических методов лабораторных исследований появилась возможность повысить уровень соответствия лабораторной диагностики современным требованиям, направленным на достижение эффективного результата лечения. Среди достоинств методов амплификации нуклеиновых кислот – высокая аналитическая и, как следствие, – диагностическая чувствительность, высокая специфичность, универсальность технологии для разных микроорганизмов, позволяющая унифицировать лабораторные исследования.

Использование методов ПЦР упрощает лабораторную диагностику, однако при высокой чувствительности ПЦР и других генных методик они не могут дать ответ о количестве уреаплазм в клиническом образце, а регистрируют только наличие генетического материала уреаплазм. Лишь ПЦР в реальном времени обеспечивает количественное определение копий ДНК микоплазм или уреаплазм в материале [39].

Стех пор как были разработаны первые ПЦР-тесты для выявления ДНК М.genitalium, в литературе описаны еще около 10 ПЦР-диагностикумов. В 2002 г. было опубликовано первое исследование, в котором для анализа ДНК М.genitalium применен метод ПЦР в реальном времени. Данная технология позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации непосредственно в процессе реакции, в режиме реального времени, что существенно

147

сокращает продолжительность анализа и снижает риск контаминации. Кроме того, методология ПЦР в реальном времени позволяет проводить количественную оценку исследуемой мишени в пробе.

Применение ДНК-зондирования оказалось успешным для обнаружения микоплазм в клиническом материале и позволило повысить частоту их выявления по сравнению с культуральным исследованием, причем устранив риск перекрестных реакций. Высокочувствительным является метод ДНК/РНК блот-гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами, комплементарными вариабельным участкам молекулы 16S РНК. Разработаны генные зонды с использованием рекомбинантных плазмид, видоспецифичных для М.hominis, а также универсальный зонд с использованием плазмиды М.genitalium 16, позволяющий выявить как микробную, так и микоплазменную флору (Борхсениус С.Н. и соавт., 1987).

Разработаны тест-системы для мультиплексной ПЦР, позволяющие одновременно определять в одном клиническом образце несколько возбудителей (М.hominis,

М.genitalium, U.urealyticum и С.trachomatis), что позволит ус-

тановить истинную роль микоплазменной инфекции при патологии УГТ, а также распространенность микоплазмоза среди населения.

В качестве альтернативы ПЦР для выявления М.genitalium предложен тест на основе метода транскрипци- онно-опосредованной амплификации. Мишенью является рибосомная РНК – молекула, присутствующая в количестве нескольких тысяч копий на одну клетку, что обеспечивает высокую чувствительность метода. К тому же, автоматизация большинства этапов технологии ТМА позволяет одновременно проводить анализ большого числа проб [134].

Модификация метода ПЦР – «ПЦР в реальном времени» позволяет не только оценить количественное содержание микроорганизмов в клиническом материале, но и обеспечивает возможность одновременной идентификации нескольких возбудителей (multiplex-ПЦР), при этом время получения результата занимает всего несколько часов с возможностью автоматизации процесса [39].

148

Перспективной является реакция транскрипционной амплификации, в частности NASBA-Real-time, характеризующаяся возможностью адекватно оценивать наличие жизнеспособных микроорганизмов, что особо важно при контроле результатов лечения и в случае получения противоречивых результатов различных методов лабораторных исследований. Реакция NASBA-Real-Time может являться референтным тестом. Однако перечисленные МАНК в настоящее время чаще применяются в научных, а не в практических целях

[39].

Проведенный анализ позволяет заключить, что комплекс лабораторных методов достаточно эффективен для диагностики урогенитальных микоплазмозов. Вместе с тем, в каждом случае целесообразен дифференцированный подход. ПЦР-диагностика является оптимальной методикой для оперативного и ретроспективного анализа распространенности данной инфекции на отдельных территориях. Кроме того, методы амплификации нуклеиновых кислот являются единственным инструментом диагностики инфекций, вызываемых М.genitalium. В случаях же упорно рецидивирующей инфекции, плохо поддающейся лечению обычно используемыми препаратами, либо в случаях смешанной инфекции обследование следует проводить культуральным количественным методом с определением чувствительности выделенных штаммов.

Клинический протокол диагностики пациентов с урогенитальным микоплазмозом в РБ (приложение к приказу МЗ РБ № 1020 от 29.10.2009 г.) представлен в табли-

це 31 [68].

149

Таблица 31 – Клинический протокол диагностики пациентов с урогенитальным микоплазмозом [68]

150