5 курс / Инфекционные болезни / Доп. материалы / Сибирская язва

21

сибиреязвенной люминесцирующей сывороткой (антисоматической или антиспоровой, в зависимости от вида пробы) – для выявления возбудителя.

Исследование на подвижность проводят микроскопическим методом раздавленной (подвешенной) капли или макроскопическим методом на агаре (0,2- 0,3%-ного). Посев ставят на 24 часа в термостат. Возбудитель сибирской язвы неподвижен.

РИФ с сибиреязвенной люминесцирующей сывороткой является дополнительным методом экспресс-диагностики сибирской язвы. Для люминесцентной микроскопии мазки готовят из патологического материала, непосредственно из подозрительных колоний, из материала, взятого от биопробных животных. На высохшие и фиксированные мазки наносят сибиреязвенные люминесцирующие адсорбированные иммуноглобулины (люминесцентная споровая сыворотка, соматическая, капсульно-соматическая). Этим методом можно выявить в пробах сибиреязвенные микробы в споровой или вегетативной форме. При наличии в пробе вегетативных клеток выявляются палочки с ободком, светящимся зеленоватым светом (рисунок 27).

Рисунок 27 - Люминесцентная микроскопия сибиреязвенного микроба.

Обнаружение в мазке из материала от больного (трупа) крупных грамположительных палочек, окруженных капсулой, позволяет поставить предварительный диагноз сибирской язвы.

Бактериологическое исследование направлено на выделение чистой культуры и ее идентификацию для окончательного подтверждения диагноза. Для посева исследуемого материала используют МПА и МПБ. Пробы, контаминированные посторонней микрофлорой, высевают на питательные среды с полимиксином В, лизоцимом, ЭДТА и ацетатом таллия. Посевы инкубируют при 36-37ОС в течение 18-24 часов.

Для выделения чистой культуры, особенно из загрязненного материала, используют также лабораторных животных (морских свинок, белых мышей). Исследуемый материал вводится подкожно (морским свинкам – в паховую область, белым мышам – в корень хвоста). Мышам вводят по 0,2-0,5 мл, свинкам – по 0,5-1,0 мл. Морские свинки обычно погибают через 2-4 суток, а белые мыши – через 1-2 суток. При наличии сибиреязвенного микроба у лабораторных животных отмечается характерная патологоанатомическая картина: отек в месте введения материала, темная не свернувшаяся кровь, кровоизлияния в клетчатке, рыхлая селезенка. В мазках-отпечатках из внутренних органов и в препаратах, приготовленных из крови, обнаруживаются грамположительные палочки, окруженные капсулой.

22

Чистую культуру пересевают на скошенный МПА и инкубируют при температуре 37ОС в течение 4 суток для получения споровой культуры. Идентификацию выделенной культуры проводят на основании изучения характера роста микроба на питательных средах, подвижности, капсулообразующей способности, теста жемчужного ожерелья, чувствительности к бактериофагу. Дополнительно определяют лецитиназную, фосфатазную и гемолитическую активность культуры.

Капсулообразующую способность изучают на МПА с 0,7% бикарбоната натрия, на МПА с сывороткой крови крупного рогатого скота. Посевы инкубируют в течение 24-48 часов при 37ОС в атмосфере 5-10% углекислого газа (в микроанаэростате или эксикаторе). Посевы культуры для выявления капсулы можно производить в жидкую среду ГКИ (инактивированная сыворотка крови в растворе Хенкса). В сомнительных случаях капсулообразование выявляют путем заражения лабораторных животных. Через 1-2 часа животных забивают, из перитонеальной жидкости и крови готовят мазки, а из селезенки и печени – мазки-отпечатки. Препараты окрашивают для выявления капсулы и микроскопируют.

Лецитиназную активность проверяют на агаре с добавлением куриного желтка или в жидкой желточной среде. Сибиреязвенный микроб не свертывает желток в жидкой среде в течение нескольких суток. При росте на плотной среде вокруг колоний сибиреязвенного микроба мутная белая зона не образуется, так как возбудитель сибирской язвы не обладает лецитиназной активностью.

Фосфатазную активность проверяют на питательном агаре, содержащем фенолфталеинфосфат натрия. Посевы на этой среде инкубируют при 37ОС в течение 18-24 часов. Перед просмотром посевов в крышку чашки вносят раствор аммиака и через 1 минуту учитывают результаты. Под действием паров аммиака происходит окрашивание в розовый цвет колоний микроорганизмов, обладающих фосфатазной активностью. Сибиреязвенный микроб фосфатазной активностью не обладает, поэтому его колонии остаются бесцветными.

Гемолитическую активность проверяют при посеве исследуемой культуры на кровяной агар (3-5%) или в бульон с кровью. Результаты учитывают через 16-20 часов инкубирования посевов в термостате при 37ОС. Возбудитель сибирской язвы гемолитической активностью не обладает, поэтому вокруг колоний зоны гемолиза не образуется.

Сибиреязвенный микроб лизируется специфическими бактериофагами (Гамма-фаг, К-ВИЭВ, Саратов, ВА-9 и другие). Проба с бактериофагами проводится на плотной питательной среде путем нанесения капли суспензии бактериофага на предварительно высеянную культуру. Можно использовать также метод стекающей капли, при котором после нанесения капли суспензии бактериофага чашку наклоняют. Капля суспензии бактериофага при этом стекает по поверхности агара. Результат исследования в виде стерильного пятна или фаговой дорожки (отсутствие роста культуры) обнаруживается через 18-24 часа инкубирования при температуре 36ОС (рисунок 28).

23

Рисунок 28 – Литическое действие бактериофага на сибиреязвенную культуру.

Серодиагностика проводится в тех случаях, когда возбудитель сибирской язвы не обнаруживается в исследуемом материале. Для определения антител в сыворотке крови больного применяют реакцию латексной агглютинации или РПГА с протективным сибиреязвенным антигеном. Сибиреязвенные антигены можно выявлять в РИФ, ИФА, РСК, РНГА, РП в геле и в реакции термопреципитации по Асколи.

Реакция термопреципитации по Асколи чаще всего используется для выявления сибиреязвенного возбудителя или соматического полисахаридного антигена в различных субстратах (кожевенном сырье, изделиях из кожи и шерсти, мясе, почве, испражнениях). Эта реакция позволяет определять наличие сибиреязвенного антигена как в свежем, так и в разложившемся сырье или мумифицированных трупах животного. Эту реакцию разработал в 1902 г. итальянский врач и иммунолог Альберто Асколи для выявления возбудителя в кожевенном сырье. Она позволяет обнаружить антигены возбудителя при отрицательных результатах бактериологического исследования. Компонентами этой реакции являются экстракт исследуемого материала и преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Перед постановкой реакции свежий материал предварительно выдерживают в термостате в течение 18-20 часов. Несвежий материал экстрагируют без выдерживания в термостате. Для приготовления экстракта материал заливают физиологическим раствором, кипятят в течение 10-45 минут и фильтруют. Иммунную преципитирующую сыворотку (0,2-0,3 мл) вносят в специальную узкую преципитационную пробирку и на нее осторожно наслаивают равное количество исследуемого экстракта. На границе соприкосновения компонентов в течение 1-5 минут образуется мутное кольцо преципитации белого цвета, что расценивается как положительный результат (рисунок 29).

Рисунок 29 – Реакция термопреципитации по Асколи.

24

Биологическая проба. Для постановки биологической пробы используют белых мышей, морских свинок, кроликов. Заражение лабораторных животных исходным материалом является обязательным этапом диагностики. Исследуемый материал вводится подкожно. Гибель зараженных животных наступает через 1-3 суток. Павших животных вскрывают, делают мазки-отпечатки их тканей и органов и посевы на МПА. При вскрытии животных отмечается характерный для сибиреязвенной инфекции студенистый геморрагический отек подкожной клетчатки в месте введения материала, гиперемия внутренних органов, увеличение селезенки и несвернувшаяся кровь. В мазках обнаруживаются сибиреязвенные бациллы в виде коротких цепочек, окруженных капсулой. В посевах вырастают типичные для сибиреязвенного микроба шероховатые колонии.

Аллергологическое исследование. Для ретроспективной диагностики сибирской язвы используется кожная аллергическая проба с антраксином. Реакцию разработал Эль Наумович Шляхов (1920 – 2005 гг.). Антраксин вводят внутрикожно в ладонную поверхность предплечья в объеме 0,1 мл. Результат учитывают через 24-48 часов. Пробу считают положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм (таблица 1).

Таблица 1 – Оценка кожной аллергической пробы с сибиреязвенным аллергеном (антраксином)

Положительная проба с антраксином сохраняется длительное время после переболевания, что позволяет использовать эту реакцию для ретроспективной диагностики заболевания.

Сроки исследования:

-микроскопического – в день поступления материала;

-бактериологического – до 3 суток;

-биологического – до 10 суток.

В настоящее время разработаны новые методы диагностики сибирской

язвы:

25

-люминесцентно-серологический метод при помощи системы фагфлуоресцентный антифаг (основан на использовании явления специфической адсорбции частиц сибиреязвенного индикаторного бактериофага на клетках чувствительного гомологичного микроба, специфической реакции их с антифаговой флуоресцирующей сывороткой и на последующем выявлении возбудителя путем люминесцентной микроскопии);

-твердофазный иммуноферментный метод (позволяет обнаружить возбудителя сибирской язвы даже при наличии одной бациллы в 1 мл воды и 50 бацилл в 1 г зерна или сена);

-серологическая реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) для выявления сибиреязвенных антител;

-ПЦР – диагностика;

-ПДАФ - метод (метод AFLP) - полиморфизм длины амплифицированного фрагмента, основанный на обнаружении локуса, специфичного для каждого штамма.

Лечение сибирской язвы

Основными медикаментозными средствами, используемыми для лечения сибирской язвы у людей, являются антибиотики и противосибиреязвенная сыворотка или противосибиреязвенный иммуноглобулин. Сибиреязвенный микроб обладает высокой чувствительностью к пенициллинам, цефалоспоринам, аминогликозидам, тетрациклинам, фторхинолонам. Меньшую чувствительность он проявляет к макролидам, линкозамидам, фениколам, а к полимиксинам возбудитель сибирской язвы устойчив. В связи с этим устойчивость сибиреязвенного микроба к полимиксинам используется в качестве критерия при выделении возбудителя из внешней среды. Для лечения сибирской язвы используют такие антибиотики как пенициллин, ампициллин, тетрациклин, гентамицин, тобрамицин, стрептомицин, фторхинолоны и многие другие препараты. Рекомендуется использовать также комбинации антибиотиков друг с другом (пенициллин со стрептомицином, пенициллин с тетрациклином, ампициллин с гентамицином и т.д.).

Наряду с антибиотиками для лечения сибирской язвы применяют лечебную противосибиреязвенную сыворотку или противосибиреязвенный иммуноглобулин. Такая схема лечения рекомендуется при любой форме заболевания.

При легком течении заболевания (незначительный отек, отсутствие тенденции к увеличению размеров некроза, слабо выраженная интоксикация) больному назначают лишь антибиотики (пенициллин по 500 тыс. – 1 млн. ЕД внутримышечно 6-8 раз в сутки в течение 5-7 дней; тетрациклин по 0,05-0,1 г внутримышечно 2-3 раза в сутки в течение 5-7 дней).

При среднетяжелом и тяжелом течении сибирской язвы (выраженная склонность отека и некроза к увеличению с усилением явлений интоксикации) лечение антибиотиками сочетается с введением противосибиреязвенного глобулина (40-50 мл внутримышечно однократно). Индивидуальную чувствительность к глобулину проверяют внутрикожной пробой. С этой целью разведенный глобулин вводят внутрикожно в количестве 0,1 мл. Проба считается отрицательной, если через 20 минут после введения диаметр папулы не превышает 0,9 см. После этого пробу повторяют с неразведенным глобулином. И только при отсутствии через 30

26

минут реакции на месте введения неразведенного глобулина вводят лечебную дозу глобулина. В случае крайне тяжелого течения заболевания дозу антибиотиков и глобулина значительно увеличивают.

Профилактика сибирской язвы

Неспецифическая профилактика. Основными направлениями профилактики сибирской язвы у людей является проведение ветеринарносанитарных мероприятий: вакцинация восприимчивых животных; изоляция больных и подозрительных животных, уничтожение трупов погибших животных и обеззараживание объектов (подстилка, навоз), обезвреживание мест содержания больных животных; учет и ликвидация почвенных очагов (мест сохранения возбудителя в почве); очистка водопоев, осушение заболоченных участков; организация скотомогильников (глубина ямы не менее 2 м, использование хлорной извести при захоронении трупов животных); проведение санитарноограничительных мероприятий; санитарный надзор за предприятиями, занятыми переработкой животного сырья; разъяснительная работа среди населения.

Необходимо добиваться прекращения бесконтрольного убоя животных, соблюдения правил утилизации, уборки и уничтожения трупов, осуществлять надзор за заготовкой сырья животного происхождения, следить за санитарным состоянием ферм, пастбищ, водопоя, трасс прогона скота. Очень важно регистрировать и изолировать инфицированные территории с сибиреязвенными захоронениями. Скотомогильники огораживают и дезинфицируют. На угрожаемой территории обязательно контролируют выполнение ветеринарно-санитарных правил при проведении гидромелиоративных, строительных и других земляных работ.

При вспышке сибирской язвы немедленно устанавливают карантин. Запрещают ввод, вывод, перегруппировку животных, убой на мясо, заготовку и вывоз продукции животноводства. Всех животных клинически обследуют. Больных и подозрительных по заболеванию изолируют и лечат, а через 14 дней после выздоровления вакцинируют. Клинически здоровых вакцинируют немедленно. Молоко от больных животных обеззараживают и уничтожают, а от подозреваемых в заражении – допускают к употреблению после кипячения. Трупы сжигают, захоронение их при сибирской язве запрещено. Места, где были трупы или больные животные тщательно дезинфицируют. Почву орошают раствором хлорной извести, содержащим 5% активного хлора (10 л на 1 кв. м), затем перекапывают на глубину 25 см и перемешивают с сухой хлорной известью, содержащей не менее 25% активного хлора (на 3 части почвы 1 часть хлорной извести). После этого сухую почву увлажняют.

Инфицированный навоз сжигают. Все кожевенное сырье исследуют в лаборатории на сибирскую язву, контаминированное сырье сжигают.

Карантин снимают через 15 суток после последнего случая гибели или выздоровления животного, окончания реакции на прививки и проведения заключительных ветеринарно-санитарных мероприятий.

При выявлении случаев сибирской язвы на мясокомбинатах убой животных прекращают и проводят обеззараживание всех инфицированных объектов.

Для специфической профилактики сибирской язвы среди животных в 1881 г. французский естествоиспытатель Луи Пастер предложил две живые вакцины (I и

27

II вакцины Пастера), отличающиеся друг от друга по степени ослабления вирулентности. Разработанные вакцины Л. Пастер предложил использовать для иммунизации сельскохозяйственных животных. Первые прививки животных против сибирской язвы были проведены в мае 1881г. (рисунок 30).

Рисунок 30 – Пастеровская прививка против сибирской язвы животных, май 1881 г.

В 1883 г. русский ученый Лев Семенович Ценковский также разработал аналогичные две живые вакцины, длительное время использовавшиеся при иммунизации разных видов сельскохозяйственных животных. До сих пор II вакцина Ценковского применяется в качестве тест-культуры при контроле качества сибиреязвенных вакцин (рисунок 31).

Рисунок 31 – Лев Семенович Ценковский (1822-1887 гг.).

В нашей стране широко использовалась также вакцина, разработанная Иваном Николаевичем Ланге в Казанском ветеринарном институте (рисунок 32).

28

Рисунок 32 – Иван Николаевич Ланге (1845-1912 гг.).

В1941 г. военные ученые Николай Николаевич Гинсбург и Александр Лазаревич Тамарин разработали живую вакцину СТИ на основе селекционированного ими бескапсульного штамма СТИ-1. Штамм СТИ-1 был выделен Н.Н. Гинсбургом и А.Л. Тамариным в Санитарно-техническом институте (г. Киров) 29 мая 1940 г. из штамма “Красная Нива” путем многократного отбора бескапсульных вариантов на свернутой лошадиной сыворотке. В конце 1941 г. вакцина СТИ была представлена на Государственные испытания, а с 1942 г. она стала широко использоваться для иммунизации вначале животных, а затем - людей. За разработку вакцины этим ученым была присуждена Сталинская премия.

Внастоящее время для профилактики сибирской язвы у людей применяют живую вакцину СТИ (приготовлена из бескапсульного штамма В. anthracis СТИ-1), химическую вакцину (на основе протективного антигена штамма СТИ-1), комбинированную вакцину (на основе спор бескапсульного штамма СТИ-1 и протективного антигена этого же штамма). Все вакцины применяются по эпидемиологическим показаниям.

За рубежом в практике ветеринарии и медицины используют только химическую вакцину, представляющую собой очищенный протективный антиген, продуцируемый клетками штамма Sterne на специальных питательных средах.

29

Литература

1. Бакулов И.А. и др. Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении “старой болезни”, Владимир, 2001, 284 с.

2. Литусов Н.В. и др. Патоморфогенез сибирской язвы. М., Медицина, 2002, 240 с.

3. Маринин Л.И. и др. Микробиологическая диагностика сибирской язвы.

М., ВУНМЦ МЗ РФ, 1999, 222 с.

4.Онищенко Г.Г. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты

микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики.

М., ВУНМЦ МЗ РФ, 1999, 448 с.

5. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. – М.: ОАО Издательство Медицина, 2005. – 600 с.

6. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М., 2002, 384 с.

30

Приложение 1.

Методы окраски для выявления капсулы

1. Простая окраска. При окраске разведенным фуксином мазка из органов или крови больного человека или животного капсула обнаруживается в виде неокрашенной каймы вокруг окрашенного тела микроба; при окраске метиленовой синькой капсула или не окрашивается, или окрашивается фуксином в розовый цвет, облекая тело микроба, окрасившееся в синий цвет.

2. Окраска по Романовскому-Гимзе. Фиксированный мазок кладут в чашку Петри мазком вниз на спички и наливают рабочий раствор краски РомановскогоГимза или погружают препарат в стаканчик с краской (15-20 капель краски на 10 мл воды). Краска Романовского-Гимзы – это смесь азура, эозина и метиленовой синьки. Через 15-20 минут препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, капсулы - в розовый.

3. Окраска по Михину. На фиксированный мазок наливают метиленовую синьку Леффлера (30 мл насыщенного спиртового раствора метиленовой синьки растворяют в 100 мл воды, добавляют 1 мл 1% раствора NaOH и выдерживают в термостате месяц), при легком нагревании выдерживают 3-5 минут (до появления паров), промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, капсулы - в светло-розовый.

4. Окраска по Ребигеру. 15-20 г генцианвиолета растворяют в 100-150 мл 40% формалина, тщательно и многократно взбалтывают и дают отстоятся несколько часов при комнатной температуре, затем фильтруют. Полученным раствором окрашивают нефиксированные мазки в течение 15-30 секунд (не более 1 минуты). Бациллы - тёмно-фиолетовые, капсулы розового или фиолетово-розового цвета.

5. Окраска по Ольту. В 100 мл кипящей дистиллированной воды растворяют 3 г сафранина, после охлаждения фильтруют. Красят 1-2 минуты. Бациллы - красные, капсулы - жёлтые.

6. Окраска по Бурри-Гинсу. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом с ней - каплю исследуемого материала; обе капли тщательно, но быстро (чтобы не дать им высохнуть) перемешивают; из полученной смеси готовят мазок таким же способом, как из капли крови. Мазок высушивают, фиксируют на пламени и окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными; они резко выделяются на темном фоне.