5 курс / Инфекционные болезни / Доп. материалы / Диагностика_инфекций,_передаваемых_половым_путём_Хворик_Д_Ф
.pdfМетоды лабораторной диагностики. Результаты лабораторных исследований в процессе лечения позволяют оценить адекватность проводимой терапии, а по ее окончании – полноту излечения. Вместе с тем следует отметить, что на сегодняшний день не существует единого алгоритма и схемы диагностического обследования пациентов с подозрением на хламидиоз [72, 94].
Особенности хламидий свидетельствуют об их нетрадиционности в плане выявления классическими бактериологическими методами диагностики, а именно, данные микроорганизмы не растут на обычных питательных средах [65, 73, 75]. В этой связи для лабораторной диагностики УГХ в настоящее время используются основные четыре группы методов:
бактериоскопические (цитологические), с окраской мазка по Гименезу, Романовскому–Гимза, Макиавелли или раствором Люголя;
культуральные – выделение хламидий на клеточных линиях L-929, Mс Coy, Hela, куриных эмбрионах и др.;
иммунологические, основанные на выявлении антигенов (реакция иммунофлюоресценции) либо антител (ИФА)
С.trachomatis;
молекулярно-генетические (молекулярнобиологические), направленные на выявление нуклеиновых кислот С.trachomatis;
серологические методы выявления антител к
С.trachomatis.
Достоверность лабораторной диагностики УГХ возрастает при одновременном использовании нескольких методов, особенно при обследовании пациентов с локализованными и системными формами инфекционного процесса [78, 80].
Первостепенное значение для диагностики хламидий имеет качество взятия и обработки материала от пациентов [74].
На результатах диагностики сказываются количество взятых образцов, а также место, из которого они были получены. Наиболее информативным может быть клинический материал, если он получен при следующих условиях:
мазки взяты при наличии клинических признаков
11
заболевания;
пациент не использовал лекарственные препараты для местного применения минимум в течение последних 4872 часов;
у женщин при исследовании материалов из УГТ взятие образцов желательно проводить приблизительно в середине менструального цикла (если заболевание не имеет явных проявлений) или в дни, когда нет кровянистых выделений (при обострении процесса);
у мужчин взятие образцов из уретры необходимо проводить при условии задержки мочеиспускания не менее 3-4 часа;
пациент не принимал душ в течение 24 часов;
пациент не принимал антимикробные препараты в
течение последних 3-4 недель.
Из-за возможной токсичности отобранного материала для диагностики имеют значение типы тампонов, с помощью которых берутся соскобы со слизистых. Так, было показано, что дакроновые тампоны лучше ватных, а их основа из пластика или металла лучше деревянной, причем, использование специальных щеточек особых преимуществ, в сравнении с дакроновыми тампонами, не дает.
Перечень медицинских показаний для обследования на УГХ представлен в таблице 4 (согласно Приложению №1 к приказу МЗ РБ № 486 от 20 мая 2009 г.).
Таблица 4 – Перечень медицинских показаний для обследования на ХИ
Показания |
Рекомендуемый |
|
вид исследований |
||
|
Мужчины |
|
Воспалительные заболевания половых путей |
МАНК |
(уретрит, эпидидимит, простатит, парауретрит, |
|
дизурия, кольцевидный баланит и баланопостит, |
|
деферентит, фуникулит, куперит; везикулит; |
|
колликулит; проктит и/или проктоколит). |
|
Бесплодие, эпидидимит, орхит, орхоэпидидимит, |
МАНК |
простатит. |
|
Плановые оперативные вмешательства на органах |
МАНК |
мочеполовой системы. |
|
12
|
|
Показания |
|
|
|
Рекомендуемый |
|
|
|
|
|
вид исследований |
|
|
|
|
|
|
|
|
Воспалительные заболевания суставов. |
|
МАНК |
||||
Длительно |
|
текущий |
|
конъюнктивит |
МАНК |
|
неустановленной этиологии. |
|
|
|
|
||
Длительно текущий назофарингит неустановленной |
МАНК |
|||||
этиологии. |
|
|
|
|
|
|
|
|
Женщины |
|
|
||
Воспалительные |
заболевания |
половых |
путей |
МАНК |
||
(выделения из мочеполовых органов; уретрит, |
|
|||||
вульвовагинит, цервицит, ВЗОМТ, бартолинит, |
|
|||||
пельвиоперитонит, |
посткоитальные |
или |
|
|||
межменструальные кровянистые |
выделения из |
|
||||
половых путей, дизурия). |
|
|
|
|
||
Воспалительные заболевания органов малого таза, |
МАНК |
|||||
хронические боли в области малого таза, бесплодие. |
|
|||||
Женщины, которым ранее проводилось лечение |
МАНК |
|||||
влагалищной части шейки матки (консервативное, |
|
|||||
хирургическое лечение) без предварительного |
|
|||||
углубленного обследования. |
|
|
|
|
||
Женщины с ранним сексуальным дебютом (до 17 |
МАНК |
|||||
лет). |
|
|
|
|
|
|
Перед проведением медицинских вмешательств: |
МАНК |
|||||
прерывание |
|
беременности, |
|
проведение |
|
|
репродуктивных |
технологий |
(ЭКО, |
ИКСИ, |
|
||
инсеминация донорской спермой), проведение |
|
|||||
внутриматочных |
вмешательств, |
введение |
|
|||
внутриматочных систем, плановыми операциями на |
|
|||||
органах мочеполовой системы. |
|
|
|
|
||
Женщины |
с |
отягощенным |
акушерско- |
МАНК |
||
гинекологическим |
анамнезом, |
|
планирующие |
|
||
беременность. |
|
|
|
|
|
|
Беременные женщины при постановке на учет. |
МАНК |
|||||
Беременные с осложненным течением настоящей |
МАНК |
|||||
беременности: кольпит, цистит, пиелонефрит, |
|
|||||
кондиломатоз, угроза прерывания, истмико- |
|
|||||
цервикальная недостаточность, хориоамнионит, |
|
|||||
преждевременное излитие околоплодных вод. |
|
|||||
Воспалительные |
заболевания |
|
суставов |
МАНК |
||
неустановленной этиологии. |
|
|
|
|
||
Длительно |
|
текущий |
|
конъюнктивит |
МАНК |
|
неустановленной этиологии. |
|
|
|
|
13
|
Показания |
|
Рекомендуемый |
|
|
вид исследований |
|
|
|
|
|
Длительно текущий назофарингит неустановленной |
МАНК |
||
этиологии. |
|
|
|
|
Новорожденные |
|
|
Длительно |
текущий |
конъюнктивит |
МАНК |
неустановленной этиологии. |
|
|
|
Длительно текущий назофарингит неустановленной |
МАНК |
||
этиологии. |
|
|
|
Новорожденные с |
осложнением |
перинатального |
МАНК |
периода: внутриутробная инфекция, конъюнктивит, |
|
||
заболевания органов дыхания, заболевания ЛОР- |
|
||
органов. |
|
|
|
|
Прочие контингенты |
|
|
Лица, предполагающие у себя наличие ХИ. |
МАНК |
||
Лица, имевшие половой контакт с лицом с |
МАНК |
||
установленной ХИ. |
|
|
|
При обследовании на другие ИППП. |
|
МАНК |
|
Лица, подвергшиеся половому насилию. |
МАНК или |
||
|
|
|
культура клеток |
Группы риска: МСМ; лица, занимающиеся |
МАНК |
||
коммерческим сексом. |
|
|
Хламидии являются «требовательными микроорганизмами» к соблюдению надлежащих условий их транспортировки (состав транспортной среды, температура, при которой осуществляется доставка и хранение материала, длительность транспортировки и хранения), поэтому условия транспортировки должны соблюдаться очень точно [76]. В случае несоблюдения правил взятия и условий доставки биологического материала образцы не подлежат исследованию; об этом сообщается врачу, направившему биологический материал на исследование; разбитые стекла подлежат уничтожению. При взятии и транспортировке материала для проведения молекулярно-биологических и иммунологических методов исследования на С.trachomatis и использовании рекомендуемой для этого транспортной среды необходимо четко соблюдать инструкцию производителя применяемой тест-системы [75].
Далее приведена характеристика диагностических приемов, которые используются для диагностики УГХ.
14
Бактериоскопические (цитологические) методы.
Методы цитологических исследований – микроскопическое исследование клинического материала. Соскобы со слизистых оболочек мочеиспускательного канала и шейки матки берут ложкой Фолькмана, специальной щеточкой или зондом, соблюдая правила антисептики. Выделения и слизистую пробку цервикального канала удаляют тампоном. Соскобы из глубины уретры и цервикального канала осуществляют со всех четырех квадрантов. В материале должны присутствовать эпителиальные клетки. Присутствие выделений и примесей крови маскирует хламидии и затрудняет диагностику. При экстрагенитальных поражениях соскобный материал получают аналогичным способом.
Наиболее распространенными методическими приемами являлась окраска препаратов из клинических материалов по Романовскому-Гимза, по Гименезу, окраска раствором Люголя, окраска по Макиавелли.
Для постановки предварительного диагноза УГХ достаточно обнаружить одно типичное цитоплазматическое включение. Метод прост в исполнении. Одновременно в препаратах можно оценивать морфофункциональное состояние лимфоцитов и нейтрофилов. Однако выявленные клеточные изменения могут служить лишь косвенным признаком наличия хламидий в материале. Необходимо помнить, что этот метод выявляет и псевдовключения (клеточные структуры и бактерии), напоминающие включения хламидий.
Чувствительность метода составляет 30% при хламидийных конъюнктивитах, 10-20% – при УГХ, 15-20% – при пневмохламидиозах, 10-15% – при хламидиозах с поражением центральной нервной системы. Данный метод не пригоден для скрининговых исследований.
Культуральные методы. В связи со сложным жизненным циклом C.trachomatis труднее поддается выделению по сравнению с большинством бактерий. Для того чтобы оптимизировать все этапы культурального метода, необходимо иметь тесные связи с сотрудниками лаборатории, выполняющими данное исследование: от взятия пробы, ее транспортировки (предпочтительно с помощью холодильной камеры) и
15
последующего лабораторного исследования. Все вышеперечисленные факторы делают данный метод дорогостоящим, однако он имеет высокую чувствительность и специфичность. При этом специфичность может быть повышена увеличением кратности исследования.
Методика культуральной диагностики ХИ представлена в таблице 5 (согласно Приложению №5 к Приказу МЗ РБ № 486 от
20 мая 2009 г.).
Таблица 5 – Методика культуральной диагностики ХИ
Название |
|
|
|
Описание |
|
|
|
Метод основан на выделении культуры C. |
|
||||
Принцип метода |
trachomatis |
с |
использованием |
специальных |
||
|
питательных сред |
|
|
|||
|
1) |
соскоб из уретры; |
|
|
||
|
2) |
соскоб из цервикального канала; |
|
|
||
Биологический |
3) |
отделяемое из заднего свода влагалища; |
||||
4) |
сперма; |
|
|
|
|
|
материал для |
5) |
секрет предстательной железы; |
|
|
||
исследования |
|
|
||||
6) |
соскоб из конъюнктивы; |
|
|
|||
|
|
|
||||
|
7) |
соскоб из ротоглотки; |
|
|
||
|
8) |
синовиальная жидкость. |
|
|
||
|
1) |
камера Горяева; |
|
|
||
|
2) |
светооптический микроскоп с |
иммерсионным |
|||
|
|
объективом; |
|
|
|
|
|
3) |
инвертный микроскоп; |
|
|
||
|
4) |
стерильные |
|
пенфлаконы или |
культуральные |
|
|
|
панели; |
|
|
|
|
Оборудование, |
5) |
водяная баня; |
|
|
|
|
6) |
шейкер; |
|
|
|
|
|
инструменты и |
7) |
центрифуга с горизонтальным ротором; |
||||
материалы |
8) |
эксикатор или СО2-инкубатор; |
|
|
||
|
|
|
||||
|
9) |
автоклав; |
|
|
|
|
|
10) влажная камера или чашка Петри с |
|||||
|
|
увлажненным фильтром; |
|
|
||
|
11) средства индивидуальной защиты персонала; |
|||||
|
12) предметные стекла; |
|
|
|||
|
13) карандаш для маркировки стекол. |
культура клеток McCoy; линии L-929, Hela и др. Реагенты ростовая среда;
0,02% раствор Версена;
16
Название |
|
Описание |
|
|
0,25% раствор трипсина; |
||
|
раствор трипанового синего; |
||
|
среда роста: среда Игла с 3% глютамина, содой, |
||
|
HEPES, 5–7% эмбриональной телячьей сыворотки |
||
|
(ЭТС) и гентамицином (20 мкг/мл); |
||
|
изолирующая среда: среда Игла с 3% глютамина, |
||
|
содой, HEPES, гентамицином (20 мкг/ мл), |
||
|
эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) в |
||
|
количестве 10% от общего объема, 40% раствор |
||
|
глюкозы (1,25 мл на 100 мл среды); |
||
|
транспортная |
среда на основе сахарозо- |
|
|
фосфатного буфера; |
||
|
раствор Хенкса; |
||
|
метанол или формалин; |
||
|
дистиллированная вода; |
||
|
НСl для корректирования рН; |
||
|
изолирующая среда. |
||
|
Ведение культуры клеток |
||
|
Для ведения культуры McCoy, L-929, Hela и др. |
||
|
используется ростовая среда. Пересев клеток |
||
|
проводится на 4-е сутки. |
||
|
Для более быстрого и полного снятия клеток со |
||
|
стекла к 0,02% раствору Версена добавляют 0,25% |
||
|
раствор трипсина в соотношении 2:1. |
||
|
Контроль качества культуры клеток проводится |
||
|
прижизненно под светооптическим микроскопом. В |
||
|
работу берутся клетки с отсутствием зернистости в |
||
Подготовка к |
цитоплазме и четкими границами. Подсчет клеток |
||
выполняют по общепринятой методике в камере |
|||
проведению |
|||
Горяева с использованием трипанового синего. |
|||
анализа |
|||
Приготовление клеточного монослоя. |
|||
|
|||
|
Суспензия клеток McCoy, линии L-929, Hela и др. в |
||
|
ростовой среде в концентрации 50-100 тыс/мл |
||
|
разливается по 2 мл в стерильные пенфлаконы, |
||
|
содержащие на дне подложки (покровные стекла), |
||
|
или по 1 мл – в лунки специальных 24-луночных |
||
|
культуральных панелей типа «Costar» с подложками |
||
|
или без них. |
|
|
|
Монослой на поверхности покровных стекол |
||
|
должен стать слитным через 2 суток. Его следует |
||
|
оценивать в |
инвертном микроскопе. Нельзя |
17
Название |
|
Описание |
|
|
|
работать с культурой, если среда мутная, щелочная |
|
||||
или |
контаминирована. |
Следует |
подобрать |
||
концентрацию клеток таким образом, чтобы |
|||||
формирование монослоя происходило через 2 |
|||||
суток. Если крышки культуральных панелей не |
|||||
обеспечивают герметичность, культуру инкубируют |
|||||
во влажной атмосфере CO (около 5%) с тем чтобы |
|||||
регулировать рН. |
|
|
|
||
Клеточный |
монослой |
можно |
формировать |
||
непосредственно на дне лунки панели. Отсутствие |
|||||
подложки |
увеличивает |
площадь |
монослоя, |
||
упрощает процесс его снятия при проведении |
|||||
пассажей. При наличии погружного объектива |
|||||
индикацию хламидий можно выполнять в лунках |
|||||
панелей. |
|
|
|
|
Образцы биологического материала, если они были заморожены, оттаивают на водяной бане при 37°С. Во флаконы, содержащие клинический материал, добавляют по 2–3 мл изолирующей среды.
Для придания образцам однородности их встряхивают на шейкере.
Маркируют лунки панелей.
Перед заражением из лунок с монослоем McCoy линии L-929, Hela и др. удаляют ростовую среду. Для повышения чувствительности культуры клеток к хламидиям можно проводить предварительную обработку клеток DEAE-декстраном.
После удаления ростовой среды проводят Процедура анализа инокуляцию образцов и контролей на монослой в количестве 0,5 мл на лунку панели. Панель помещают в центрифугу с горизонтальным ротором и центрифугируют при 2500-3000 оборотов течение
1часа. Необходимая температура (33-35°С) в центрифуге обычно достигается от выделения тепла самим ее механизмом при такой скорости. Центрифуга может быть подогрета холостым ходом или обдувом горячим воздухом.
После центрифугирования зараженную культуру на
2часа помещают в СO2 инкубатор (или эксикатор) при 37°С.
Удаляют инокулят, после чего в каждую лунку или флакон вносят по 1-2 мл изолирующей среды с
18
Название |
|
|
|
|
Описание |
|
|
|
|
||
|
циклогексимидом. Панели инкубируют в СO2- |
|
|||||||||
|
инкубаторе в течение 24-72 часов, а флаконы |
||||||||||
|
помещают в обычный термостат на этот же период. |
||||||||||
|
Исследование |
зараженной |
культуры |
проводится |
|||||||
|
после |
24-часового |
инкубирования |
при |
|||||||
|
использовании |
иммунофлуоресцентного метода и |
|||||||||
|
спустя 48-72 часа при использовании окраски по |
||||||||||
|
Романовскому – Гимза. |
|
|
|
|
|
|
||||
|
Оценка |
полученных |
|
результатов |
может |
|
|||||
|
проводиться одним из следующих методов: окраска |
||||||||||
|
по Романовскому – Гимза. |
|
|
|
|
|
|
||||
|
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием |
||||||||||
|
мазков разводят из расчета 1–2 капли красителя на |
||||||||||
|
1 |
мл |
дистиллированной |
воды. |
Мазки, |
||||||
|
фиксированные в метиловом спирте, окрашивают |
||||||||||
|
раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл |
||||||||||
|
основного буферного раствора + 47 мл |
||||||||||
|
дистиллированной воды) |
в |
течение |
40–120 мин. |
|||||||
|
(продолжительность |
окрашивания |
подбирают |
||||||||
|
эмпирически) |
при |
37°С |
|
во |
влажной |
камере |
||||
|
(закрытая чашка Петри с увлажненным фильтром |
||||||||||
Учет и оценка |
на дне). После окрашивания мазки промывают в |
||||||||||
результатов |
проточной воде и высушивают на воздухе. |
|
|
||||||||
|
Препарат микроскопируют, начиная с малого |
||||||||||
|
увеличения (объектив х10), затем переводят на |
||||||||||
|
большое увеличение (объектив х40), затем |
||||||||||
|
используют |
иммерсию |
|
(объектив |
х100 |
||||||
|
иммерсионный), окуляр х7 или х10. |
|
|
|
|||||||
|
При детекции с использованием окраски по |
||||||||||
|
Романовскому – Гимза в зараженной культуре |
||||||||||
|
выявляются |
включения |
|
элементарных |
телец |
||||||
|
хламидий в виде нескольких, обычно зернистых, |
||||||||||
|
микроколоний сине-фиолетового цвета; выявление |
||||||||||
|
хламидий |
с |
помощью |
иммунофлуоресцентного |
|||||||
|
метода |
проводится |
согласно |
инструкции |
|||||||
|
производителя к прилагаемой тест-системе. |
|
|
||||||||
Заключение |
Возбудитель C.trachomatis, выявлен. |
|
|
|
|||||||
лабораторного |
Возбудитель C.trachomatis, не выявлен. |
|
|
|
|||||||
исследования |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
На преаналитическом этапе оценивается:
Контроль качества —взятие биологического материала в соответствии с требованиями;
19
Название |
Описание |
|
|
|
—выполнение требований хранения и доставки |
|
|||
материала в лабораторию; |
|
|
|
|
—выполнение требований маркировки проб и |
||||
соответствия |
маркировки |
пробы |
маркировке |
|
направления; |
|
|
|
|
—контроль |
растворов |
красителей |
(внешнее |
|
состояние, срок годности), условия и сроки |
||||
хранения; |
|
|
|
|
—контроль транспортных и питательных сред, |
||||
реагентов (внешнее состояние, срок годности), |
||||
условия и сроки хранения; |
|
|
|
качество лабораторной посуды.
Мероприятия аналитического этапа:
—включение официально зарегистрированных контрольных материалов;
—соблюдение технологии окраски в соответствии с инструкцией производителя;
—контроль качества среды;
—учет результатов в соответствии с официально признанными критериями.
Мероприятия постаналитического этапа:
—правильность внесения результатов в бланк исследования и формулировка лабораторного заключения;
—своевременное доведение информации до врача, назначившего исследование.
|
Нарушение техники взятия, правил хранения и |
|||||||
|
транспортировки клинического материала. Техника |
|||||||
|
взятия |
материала, |
правила |
хранения |
и |
|||
|
транспортировки |
биологического |
материала |
|||||
|
должны проводиться в строгом соответствии с |
|||||||
Перечень |
Приложением 2 настоящей инструкции. |
|
|
|||||
возможных |
Неудовлетворительное |
техническое |
состояние |
|||||
ошибок при |
оборудования. Оборудование, используемое для |
|||||||
выполнении и |
проведения культуральных исследований, должно |
|||||||
пути их |
иметь |
соответствующие |
сертификаты |
о |
||||
устранения |
государственной |
поверке |
и |
метрологической |
||||
|
аттестации. |
|
|
|
|
|
|
|
|
Нарушение методики |
проведения культурального |
||||||
|
исследования, окраски по Романовскому – Гимза, |
|||||||
|
ПИФ. Проведение культурального исследования с |
|||||||
|
последующей окраской по Романовскому – Гимза |
20