4 курс / Дерматовенерология / Диагностика_инфекций,_передаваемых_половым_путём_Хворик_Д_Ф

Иммунологические методы. Данные методы основаны на комплементарном взаимодействии специфического антигена с антителом с последующим выявлением продукта этого взаимодействия флюорохромом или с помощью цветной биохимической реакции. С помощью данных способов обнаруживают в клиническом материале (моча, выделения из уретры, мокрота, соскобный материал из уретры и ротоглотки, эякулят, сок предстательной железы, сыворотка крови, ликвор, суставная жидкость) родоспецифический (групповой) антиген либо специфические хламидийные антитела – иммуноглобулины различных классов (А, М, G) [92]. В качестве диагностикума в первом случае используют хламидийные антитела, во втором – хламидийные антигены. В настоящее время наиболее распространенными иммунологическими методами в плане использования для диагностики хламидий являются ИФА и РИФ

[85].

Методика диагностики ХИ с использованием РИФ представлена в таблице 6 (согласно Приложению №5 к Приказу МЗ РБ № 486 от 20 мая 2009 г.).

Таблица 6 – Методика диагностики ХИ с использованием РИФ

21

ацетон или 96° этиловый спирт;

дистиллированная вода;

буферный раствор рН 7–8,5;

Для оценки качества взятия материала просматривают не менее 10 полей зрения, используя увеличение

Учет и оценка люминесцентного микроскопа х400. В одном поле результатов зрения должно быть не менее 5 клеток цилиндрического эпителия. Результат считается

положительным, если в мазке регистрируют яркозеленое свечение в виде кофейного зерна

22

Мероприятия аналитического этапа:

соблюдение технологии постановки реакции прямой иммунофлуоресценции в соответствии с инструкцией производителя;

учет результатов в соответствии с официально признанными критериями.

Мероприятия постаналитического этапа:

правильность внесения результатов в бланк исследования и формулировка лабораторного заключения;

своевременное доведение информации до врача, назначившего исследование.

23

Молекулярно-генетические методы. В настоящее время для выявления нуклеиновых кислот хламидий в образцах биологического материала предлагается значительное количество тест-систем, основанных на различных молекулярнобиологических подходах [87]. В этой связи выбор тест-систем для использования в конкретной лаборатории представляет собой достаточно трудную задачу. При этом решающими должны быть не такие очевидные параметры, как стоимость и удобство в повседневной работе, а чувствительность и специфичность [49]. Различают связанные и не связанные с амплификацией методы выявления нуклеиновых кислот [79, 81, 86].

К основным методам, не связанным с амплификацией нуклеиновых кислот, относятся различные варианты методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот-мишеней и комплементарных зондов, содержащих радиоактивные или другие метки. Лучшим примером такого метода является тест РАСЕ® 2 СТ (Gen-Probe, Inc. SanDiego, CA), одобренный FDA в 1988 г. Тест основан на гибридизации ДНК-зонда со специфическим участком 16 S рибосомальной РНК С.trachomatis. В связи с относительно низкой чувствительностью указанный метод постепенно вытесняется амплификационными методами. Чувствительность данного метода составляет 70-85%, специфичность приближается к 100%.

Тесты, основанные на амплификации нуклеиновых кислот

(NATT – nucleicacidanalysistests), включают полимеразную

24

цепную реакцию (ПЦР), лигазную цепную реакцию (ЛЦР),

методы SDA (single strand displacement) и TMA (transcriptmediated assay). Эти методы имеют преимущества перед другими, обладая высокой чувствительностью и специфичностью. Чувствительность методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) составляет 90-95% и определяется типом пробы. Тестирование invitro различных разведений штаммов C.trachomatis показывает, что МАНК дает положительный результат при наличии 10-100 микроорганизмов, культуральный метод – 1000-10000 микроорганизмов, ИФА – при более высоких количественных показателях C.trachomatis. Другое их преимущество заключается в том, что для тестирования есть возможность использования любого вида клинического материала, в том числе и мочи. С помощью этих методов могут быть обнаружены и неживые C.trachomatis. NATT является дорогостоящим методом, однако, благодаря стоимости трудозатрат в человеко-часах, эти технологии являются рентабельными.

Одним из наиболее используемых методов NATT в настоящее время является ПЦР. ПЦР – метод прямого определения специфического участка последовательности ДНК. Процесс ПЦР включает идентификацию специфической последовательности родительской ДНК для амплификации (копирования) с помощью двух коротких праймеров (участков ДНК), которые комплиментарны концевым участкам этой последовательности. Далее происходит удлинение последовательности ДНК за счет имеющихся в реакционной смеси в избытке дезоксинуклеозид трифосфатов, катализируемое Tag полимеразой. В результате этого процесса образуются так называемые ампликоны – копии обнаруживаемой последовательности ДНК. Детекция ампликонов осуществляется с помощью электрофореза в агарозе. Тест имеет видовую специфичность, сравнимую с культурой клеток, имеет чувствительность 10 молекул ДНК любого вида хламидий.

25

Классическая ПЦР. Принцип метода: Амплификация ДНКмишени осуществляется в ходе повторяющихся циклов, каждый из которых включает:

•денатурацию (образование одноцепочечных молекул) ДНК-мишени при температуре более 90°С;

•отжиг на каждой одноцепочечной молекуле ДНК комплементарного олигонуклеотидного праймера при понижении температуры до 55°С-65°С;

•достройка (синтез) двухцепочечной молекулы ДНК с каждого праймера в результате энзиматической активности термостабильной ДНК-полимеразы при использовании содержащихся в реакционной смеси дезоксинуклеозид трифосфатов при температуре 72°С.

По окончании цикла происходит удвоение фрагментов ДНК-мишени. На практике для получения продуктов амплификации (ампликонов) в количестве, достаточном для их детекции обычными аналитическими методами, проводят приблизительно 30 циклов амплификации. Первоначально в ходе ПЦР после каждого отжига праймеров в реакционную смесь приходилось добавлять новую порцию ДНК-полимеразы, так как ранее внесенный фермент инактивировался при высокой температуре на этапе денатурации. Высокую скорость реакции амплификации удалось получить при использовании термостабильной ДНК-полимеразы и благодаря созданию программируемыхтермоциклеров, обеспечивающих быстрое и точное изменение температуры реакционной смеси.

Для детекции продуктов амплификации применяют несколько методов.

Наиболее распространенным методом детекции является горизонтальный электрофорез образца реакционной смеси, полученного после окончания амплификации, в агарозном геле. Результат ПЦР считается положительным при выявлении фрагмента ДНК, по своей молекулярной массе соответствующего молекулярной массе ампликона контрольного образца. Для этого при проведении электрофореза необходимо использовать маркеры (фрагменты ДНК известной молекулярной массы), положительный и отрицательный контроли. Существенные недостатки метода: субъективность оценки результатов

26

электрофореза оператором, низкая производительность, невозможность автоматизации процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР в каждом конкретном образце. Наибольшую опасность составляет возможность наработки в ходе ПЦР неспецифического продукта, сходного по размерам с детектируемым продуктом. При существующей системе детекции возможна выдача оператором ложноположительного результата.

Альтернативой электрофоретическим методам детекции ПЦР-амплифицированной ДНК являются методы гибридизационно-флюоресцентной детекции. В ходе такого способа детекции амплифицированная ДНК гибридизуется и с праймерами, и с мечеными флюоресцентным красителем олигонуклеотидными зондами, специфичными к внутренней последовательности анализируемого фрагмента. Образовавшийся гибрид автоматически регистрируется флюоресцентнымили фотометрическимридером. Таким образом, при гибридизационном способе детекции ДНК специфичность реакции амплификации обеспечивается, во-первых, за счет гибридизации с праймерами, во-вторых, за счет гибридизации со специфическими зондами.

Метод ПЦР в его классическом варианте первоначально использовался для детекции ДНК С.trachomatis с помощью тестсистем, сконструированных в каждой лаборатории самостоятельно. К настоящему времени такие тест-системы вытесняются коммерческими тест-системами. В большинстве тест-систем мишенью является криптическая плазмида или

23SрРНК С.trachomatis.

Тест-системы, основанные на принципе классической ПЦР, являются наименее удобными в повседневной работе (особенно при ручном исполнении), но отличаются относительно низкой стоимостью.

Для повышения чувствительности и специфичности классической ПЦР был разработан ее вариант, получивший название гнездной ПЦР. При этом используют две пары праймеров. После проведения амплификации с использованием первой пары праймеров полученные ампликоны используют во втором раунде ПЦР со второй парой праймеров. Вторая пара

27

праймеров отжигается на внутренних участках ампликонов, таким образом, продукт второго раунда амплификации оказывается короче, чем продукт первого раунда. Повышение чувствительности и специфичности гнездной ПЦР достигается за счет увеличения общего количества циклов амплификации (по 15–30 в каждом раунде) и отжига второй пары праймеров только на фрагментах, полученных в первом раунде. Метод гнездной ПЦР используется в основном в исследовательских целях и не нашел широкого применения в коммерческих тест-системах.

С практической точки зрения, весьма перспективной является мультиплексная ПЦР. При этом варианте в одной и той же пробирке находятся несколько пар праймеров, специфичных для разных мишеней, что позволяет проводить детекцию нескольких мишеней одновременно. Конструирование праймеров и оптимизация условий для мультиплексной ПЦР несколько сложнее, чем решение этих задач для классической ПЦР, так как необходимо исключить возможную комплементарность между различными праймерами и обеспечить для них одинаковую температуру отжига. Мультиплексная ПЦР по чувствительности несколько уступает обычной реакции.

ПЦР в реальном времени (real-timePCR). Один из принципиальных недостатков, затрудняющих использование классической ПЦР в рутинной диагностике, связан с крайне высокой чувствительностью этого метода, что повышает вероятность ложноположительных результатов из-за перекрестной контаминации исследуемых образцов. Вероятность перекрестной контаминации удается предотвратить при использовании метода ПЦР в реальном времени благодаря тому, что процессы амплификации и детекции продуктов амплификации происходят одновременно в одной и той же пробирке. Для детекции продуктов амплификации разработаны достаточно сложные технологии, основанные на комплексе ферментативных реакций, в результате которых в реакционной смеси возникает флюоресцентный сигнал, по интенсивности пропорциональный количеству образовавшегося продукта амплификации.

Специфичность флюоресцентного сигнала удается получить при использовании ДНК-зондов, комплементарных

28

внутренним участкам фрагмента ДНК, ограниченного праймерами. Наибольшее распространение получили TaqMan зонды и «молекулярные маяки». Детальное описание конструкции зондов и химических реакций, приводящих к появлению флюоресценции, при накоплении в реакционной смеси продуктов амплификации выходит за рамки настоящего протокола.

ПЦР в реальном времени может быть использована для определения количественного содержания ДНК-мишени в биологическом образце. Целесообразность количественной детекции С.trachomatis при УГХ в настоящее время не определена, что, однако, не исключает такой возможности в будущем.

Серологические методы. Диагностика ХИ при помощи серологических методов (реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации) до настоящего времени была недостаточно успешной. Одной из причин этого является то, что хламидии в большинстве случаев обладают низкой иммуногенностью и поэтому определяют формирование недостаточно напряженного иммунного ответа.

Таким образом, в последние годы для подтверждения хламидиозов применяется большое разнообразие лабораторных методов, что приводит к определенным трудностям при их использовании в практическом здравоохранении. При различных вариантах течения и исходов УГХ методы этиологической верификации диагноза имеют разное значение. Полагаем, что при неосложненном варианте УГХ необходимо использовать как минимум 2 метода диагностики, стартовым может быть ПИФ, а арбитражным ПЦР, так как ИФА имеет низкую частоту выявления маркеров и может только дополнять ПИФ и ПЦР. При осложненном (БР, бесплодие и др.), ИФА (IgG) может выступать в качестве стартового метода, а ПЦР – арбитражного, в отличие от ПИФ, который является дополнительным методом диагностики осложненного варианта УГХ.

По результатам проведенных комплексных исследований предложен диагностический алгоритм лабораторных исследований при УГХ (рисунок 2) [38].

29