33
Таблица 4.2. Оптимальные значения электронного увеличения
(zoom) для LSM 5 PASCAL
объектив |
апертура |
формат |
zoom |
|
|
|
|
10 |
0.3 |
512х512 |
4.11 |
10 |
0.3 |
1024х1024 |
2.05 |
10 |
0.3 |
2048х 2048 |
1.03 |
20 |
0.5 |
512х512 |
3.42 |
20 |
0.5 |
1024х1024 |
1.71 |
20 |
0.5 |
2048х 2048 |
0.86 |
40 |
0.75 |
512х512 |
2.57 |
40 |
0.75 |
1024х1024 |
1.28 |
40 |
0.75 |
2048х 2048 |
0.64 |
100 |
1.3 |
512х512 |
1.78 |
100 |
1.3 |
1024х1024 |
0.89 |
100 |
1.3 |
2048х2048 |
0.44 |
|
|
|
|
Формат и зум следует устанавливать при настройке микроскопа. Однако
на их выбор могут влиять и другие факторы. Например, яркость изображения
или время сканирования (см. раздел «Параметры»).
4.7. Конфокальная диафрагма
Диаметр конфокальной диафрагмы(pinhole) имеет существенное значение, поскольку от него напрямую зависит толщина ,слоя которого снимается оптический сигнал. Толщина оптического среза рассчитывается по
формуле:
T = √ ((0.88 λи /(n - √ (n2- NA2)))2 + (1.4 n D/NA)2)
Где: |
Т – толщина оптического среза; λи – длина волны света; n – показатель |
|||||||
преломления |
среды; NA |
– |
числовая |
апертура |
объектива; D |
– диаметр |
||
конфокальной диафрагмы. |
|
|
|
|
|
|
||
|
Чем меньше диаметр диафрагмы, тем тоньше «оптический срез». Однако |
|||||||
при |
этом уменьшается |
световой |
поток, попадающий |
на |
фотоприемник. |
|||
Оптимальное |
соотношение |
разрешение/световой |
поток |
достигается в том |
||||
случае, если диаметр диафрагмы равен диаметру первого дифракционного
максимума |
(диск Эйри). На рис. 4.4 |
приведены экспериментальные данные, |
полученные |
на LEICA TCS SL, о |
зависимости интенсивности сигнала и |
аксиального разрешения от диаметра конфокальной диафрагмы. При диаметре
диафрагмы = 1 их величины приняты за 100%,
34
На LEICA TCS SL диаметр диафрагмы устанавливается в разделе
Beam/Pinhole, а также с помощью ручки на пульте. На LSM 5 PASCAL диаметр
диафрагмы устанавливается в разделе Scan Control/Channels.
|
|
450 |
|
|
|
|
|
|
|
и |
|
400 |
|
|
|
|
|
|
|
Интенсивность сигнала |
разрешение, % |
350 |
|
|
|
|
|
И |
|
300 |
|
|
|
|
|
|
|
||
250 |
|
|
|
|
|
|
|
||
200 |
|
|
|
|
|
|
|
||
150 |
|
|
|
|
|
|
|
||
100 |
|
|
|
|
|
Р |
|
||
50 |
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.6 |
0.8 |
1 |
1.2 |
1.4 |
1.6 |
1.8 |
2 |
|
|
|
|
Диаметр диафрагмы, отн.ед. |
|
|
|||
Рис. 4.4. |
Зависимость |
интенсивности |
сигнала |
и |
аксиального |
разрешения |
от диаметра |
конфокальной |
диафрагмы. Leica |
TCS SL. |
|
Объектив HCX PLAPO CS 63x/1.32. ■ – разрешающая сила (см. п.3.3); ● –
интенсивность сигнала.
В обеих системах существует кнопка установки диаметра диафрагмы,
равному диаметру первого дифракционного максимума. Абсолютное значение диаметра диафрагмы в мкм зависит от используемого объектива и выводится
на экран.
4.8. Мультиспектральный режим
В этом режиме особенно важна правильная спектральная настройка фотоприемников для того, чтобы снизить до минимума влияние сигнала от одного флуорохрома на сигнал от другого(crosstalk), т.е. осуществить разделение каналов и получить изображения с минимальным перекрытием спектров. Эта проблема появляется в случае одновременного сканирования в
двух и более каналах.
35
|
|
СИ1 |
СИ2 |
||
СП1 |
|
|
СП2 |
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Лазер1 |
Канал1 |
Лазер2 |
Канал2 |
Рис. 4.5. Перекрытие спектров полностью отсутствует. СП – спектры поглощения, СИ – спектры испускания флуорохромов 1 и 2.
СИ1 |
СИ2 |
Канал 2
Рис. 4.6. Слабое перекрытие спектров. Обозначения те же.
36
СИ1 |
СИ2 |
Канал 2
Рис. 4.7. Сильное перекрытие спектров. Обозначения те же.
СИ1 |
СИ2 |
Лазер1 Канал1
Рис. 4.8. Спектр испускания 2-го флуорохрома (СИ2) попадает в канал 1–го флуорохрома за счет значительного превышения интенсивности СИ2 над СИ1.
37
Существуют следующие варианты взаимодействия сигналов от двух
флуорохромов. Идеальный вариант представлен на .рис4.5. Перекрытия
спектров практически нет, и можно проводить одновременное сканирование.
На рис.4.6 представлен вариант со слабым перекрытием спектров. Часть
спектра испускания первого флуорохрома попадает во второй фотоприемный канал. В этом случае можно применять одновременное сканирова, ниео
попробовать уменьшить перекрытие, уменьшив мощность первого лазера и
компенсировав падение яркости изображения увеличением усиления первого канала, а также сдвинув полосу приема второго канала вправо. В случае
сильного перекрытия спектров из-за их близкого расположения, или вследствие слишком большой квантовой эффективности первого флуорохрома(за счет
свойств |
флуорохрома или его |
большой |
концентрации) по |
сравнению со |
вторым |
(рис.4.7), необходимо |
применять |
последовательное |
сканирование, |
когда сначала включаются лазер и фотоприемник первого канала, а затем они отключаются и включается второй канал(режим Sequential scan на LEICA или
Multitrack |
на |
LSM). |
В |
особых |
случаях, когда, например, квантовая |
эффективность |
второго |
флуорохрома |
намного выше первого(рис.4.8), даже |
||
при выключенном |
лазере второго |
канала лазер первого канала буде |
|||
возбуждать |
люминесценцию второго флуорохрома, и левый край его спектра |
||||
может попасть в первый канал. В таком варианте не поможет даже
последовательное |
сканирование, и |
следует |
изменить |
соотношение |
|
концентрации красителей. |
|
|
|
|
|
Существует |
также |
программный |
способ |
уменьшения |
перекрытия |
спектров, основанный на различных математических алгоритмах, учитывающих |
|||||
информацию о |
спектрах |
применяемых |
красителей, применяющих |
методы |
|
линейной алгебры, адаптивном или ручном разделении изображений по приемным каналам (программы Dye Finder -Leica, Unmix - LSM).
Наличие эффекта перекрытия спектров можно проверить в режиме
одновременного сканирования, уменьшая мощность лазера первого канала.
Если при этом уменьшается яркость |
изображения второго , токанала |
|
необходимо предпринять меры, изложенные выше. |
||
Однако наиболее эффективным приемом в случае перекрытия спектров |
||
является применение |
последовательного |
сканирования(Sequential Scan |
(Leica), Multitrack (LSM)), |
при котором лазер и приемный канал включаются для |
|
|
|
|
|
|
|
38 |
сканирования последовательно для каждого флуорохрома. На вклейке В |
||||||
приведен пример одновременного (а) и последовательного (б) сканирования |
||||||
одного и того же препарата. |
|
|
|
|
||
Для |
каждого |
варианта |
перекрытия |
спектров |
можно |
предложить |
оптимальные режимы работы конфокальных микроскопов (см. табл. 4.3). |
|
|||||
Таблица 4.3. Выбор оптимального режима работы ЛСКМ в зависимости от степени перекрытия спектров двух флуорохромов
Линии |
|
Линии испускания расположены: |
|
возбуж- |
|
близко |
далеко |
дения |
близко |
Подбор концентраций, |
Одновременное |
располо- |
|
Программа Dye Finder |
сканирование |
жены: |
|
(Leica), Unmix (LSM) |
|
|
далеко |
Sequential Scan (Leica) |
Одновременное |
|
|
Multitrack (LSM ) |
сканирование |
В принципе, |
на LSM |
5 |
PASCAL |
в режиме Multitrack допускается |
использование до 8 |
каналов, |
т.е. |
можно |
осуществить сканирование одного и |
того же поля 8 раз с разными спектральными параметрами (несмотря на то,
что реально существуют только два фотоприемн) ика затем получить
совмещенное изображение. На LEICA TCS SL в режиме Sequential scan можно
использовать |
до 4 каналов. Надо |
учесть, что |
при |
последовательном |
сканировании |
время сканирования существенно возрастает, |
что не всегда |
||
приемлемо, особенно при исследовании динамических процессов.
Последовательное сканирование осуществляется: а) между линиями
(lines), б) между кадрами (frames) и в) между сериями срезов(stacks), т.е.
сначала идет сканирование по одной линии(кадру, серии срезов) в первом канале, затем по той же линии(кадру, серии срезов) во втором канале, и так далее (Рис.4.9).
Ввиду невозможности быстрого переключения некоторых узлов наLSM 5 PASCAL и LEICA TCS SL (например, дихроичных зеркал) не все варианты оптических настроек доступны при последовательном сканировании«между линиями». На LEICA TCS SP5 переключение спектральных каналов происходит
с помощью AOBS (acousto optic beam splitter, акустооптический разделитель луча), имеющий высокую скорость переключения режимов, поэтому такой проблемы не возникает.