2 курс / Гистология / Методы_контрастирования_в_микроскопии_Колтовой_Н_А_Краевой_С_А_

Сведения об авторах:

Краевой Сергей Александрович, д.м.н. заместитель министра здравоохранения РФ.

Окончил Военно-медицинскую Ордена Ленина Краснознаменную Академию им. С.М. Кирова. Дополнительное образование:

повышение квалификации – МВА. «Каскадное обучение системе менеджмента качества и лидерства. Уровень «Руководитель качества».

Российская Академия Государственной службы при Президенте Российской Федерации «Социально-экономическая политика государства и пути ее реализации в здравоохранении». Российская Академия путей сообщения ФГБ ОУ ВПО МИИТ «Охрана труда на предприятиях железнодорожного транспорта» Дипломатическая академия Министерства Иностранных Дел Российской Федерации «Деловой протокол и этикет».

Институт усовершенствования врачей ФГУ «Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России «Организация здравоохранения и общественное здоровье».

«НМХЦ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России программа «Организация здравоохранения и общественное здоровье»

Колтовой Николай Алексеевич (Москва) – окончил МФТИ с отличием, кандидат физикоматематических наук. Много лет проработал в представительстве фирмы Zeiss в Москве, председатель “Image Processing Club”. Специализация – оптика, микроскопия, системы анализа изображений, исследование биожидкостей, спектральные методы исследования в медицине, спектральные методы ранней диагностики рака, кристаллизация биожидкостей.

koltovoi@mail.ru

2

С.Краевой, Н.Колтовой Книга 8. Методы контрастирования в микроскопии.

Аннотация.

Книга посвящена рассмотрению различных методов наблюдения объектов в микроскопии. Описываются различные методы микроскопии: забытые старые методы, и созданные новые методы микроскопии (фазовый контраст, аноптральный контраст, темнопольное освещение, дифференциально-интерференционный контраст, Хоффмановский метод контрастирования, Варел контраст). Описывается компьютерные метод реализации оптических методов контрастирования. Книга предназначена для специалистов, занимающихся микроскопией - медиков, биологов, научных работников.

Серия книг по кристаллизации биожидкостей и спектральным методам.

Книга 1. Кристаллизация сыворотки крови методом открытой капли (угловая дегидратация). Книга 2. Кристаллизация сыворотки крови методом закрытой капли (краевая дегидратация). Книга 3. Тезиография. Кристаллизация тестовых растворов.

Книга 4. Кристаллизация различных биожидкостей.

Книга 5. Обзор литературы по кристаллизации биожидкостей. Книга 6. Структура и свойства воды.

Книга 7. Замораживание жидкостей.

Книга 8. Методы контрастирования в микроскопии. Книга 9. Спектральные методы в микроскопии.

Книга 10. Флуоресцентные методы. Хемилюминесценция. Книга 11. Флуоресцентные методы в медицине.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

S. Kraevoy, N. Koltovoy

Book 8. Contrast Methods in microscopy.

Abstract.

The book is dedicated to one of the most difficult and neglected issues in microscopy - microscopy transparent (not painted) objects. Describes the various methods of microscopy: forgotten the old ways, and created new methods of microscopy. The book is intended for professionals involved in microscopy - doctors, biologists and scientists.

Books about the problems of crystallization bioliquids and spectroscopy. Book 1. Crystallization of blood serum by means open drops evaporation. Book 2. Crystallization of blood serum by means closed drops evaporation. Book 3. Sensitive Cristallization. Crystallization test solutions.

Book 4. Crystallization of different bioliquids.

Book 5. Review of the literature on the crystallization bioliquids. Book 6. The structure and properties of water.

Book 7. Freezing liquids.

Book 8. Contrast Methods in microscopy. Book 9. Spectral Methods in microscopy. Book 10. Fluorescence. Chemiluminescence.

Book 11. Biomedical applications of fluorescence.

3

Оглавление:

Глава 1. Оптические методы контрастирования - 7

1.1Вставки (диафрагмы).

1.2Косое симметричное освещение (кольцевая вставка).

1.3Косое несимметричное освещение.

1.4Двойное диафрагмирование.

1.5Стандартный темнопольный метод.

1.6Полихроматический контраст (цветовой контраст).

1.7Метод фазового контраста.

1.7.1Стандартный метод фазового контраста.

1.7.2Цветной фазовый контраст.

1.7.3Аподизированный фазовый контраст (Nikon).

1.7.4Варел контраст (Zeiss).

1.7.5Компьютерный метод фазового контраста.

1.8Аноптральный метод.

1.9Хоффмановский модуляционный контраст.

1.10Дифференциальный интерференционный контраст.

1.11Конфокальная микроскопия.

1.12Окраска препаратов.

1.13Структурное освещение.

1.14Интерференционная микроскопия.

1.15Метод зеркального освещения.

Глава 2. Изменение изображения объектов при смещении столика микроскопа по оси Z - 53

2.1Изображение светящейся точки.

2.2Изображения различных объектов при смещении столика микроскопа.

2.3Проблемы фокусировки для неоднородных сред.

2.4Светлопольное освещение - Полоска Бекке.

Глава 3. Компьютерные методы контрастирования - 66

3.1Контрастирование на этапе регистрации изображений. 3.1.1 Оптическое контрастирование в микроскопе.

3.1.2 Аппаратное контрастирование в цифровой камере. 3.1.3 Фотографическое цветоделение.

3.2Контрастирование при обработке отдельного изображения. 3.2.1 Программное контрастирование.

3.2.2 Псевдорельеф.

3.2.3 Выделение контуров.

4

3.3Контрастирование при совместной обработке нескольких изображений. 3.3.1 Компьютерный метод косого симметричного освещения.

3.3.2 Компьютерный метод фазового контраста. 3.3.3 Расфокусировка.

3.3.4 Псевдорельеф. 3.3.5 Расширенный фокус.

3.3.6 Мультиспектральная обработка изображений.

3.4Контрастирование при отображении изображения.

3.4.1Аппаратное контрастирование при отображении.

3.4.2Псевдоцвет (pseudocolor), цветовое кодирование.

3.4.3Метод цифровой трансформации.

Глава 4. Наблюдение мельчайших частиц с помощью микроскопа - 72

Глава 5. Поляризационная микроскопия - 90

5.1Поляризационный метод исследования объектов.

5.2История создания поляризационных микроскопов.

5.3Линейная и циркулярная поляризация.

5.4Изображение сферолитов в скрещенных поляроидах (Мальтийский крест).

5.5Поляризационная микроскопия в диагностике различных заболеваний.

5.6Литература по поляризационной микроскопии.

5

Глава 1. Оптические методы контрастирования.

В настоящее время существуют различные методы наблюдения (методы оптического контрастирования) в проходящем свете, применяемые в микроскопии.

Таблица 1-1. Различные методы оптического контрастирования, применяемые в микроскопии.

7

Часто очень эффективным оказывается совместное применение нескольких методов контрастирования одновременно. Например, одновременное применение проходящего освещения (при малом накале лампы) и флуоресцентного метода позволяют наблюдать светящиеся объекты, и видеть расположение светящихся объектов в клетке. Одновременное применение поляризационного метода и слабого проходящего света позволяет и структуру препарата, и локализацию оптически неоднородных компонент.

1.1 Вставки (диафрагмы).

Суть оптических методов контрастирования состоит в создании специальных методов освещения препарата. Различные методы освещения в микроскопе реализуются путем использования различных типов конденсоров. Основное конструктивное различие конденсоров состоит в использовании различных вставок.

Рис. 1-1. Оптическая схема микроскопа с конечной длиной тубуса.

8

диафрагмы конденсора и объектива, кольцевая диафрагма конденсора для режима темного поля и косого освещения.

b- цветные диафрагмы. Если вместо непрозрачной диафрагмы использовать цветную диафрагму такой же формы, то получится цветная модификация соответствующего метода контрастирования. Примеры цветных диафрагм: цветные диафрагмы для режима темного поля (полихроматический контраст, освещение по Рейнбергу).

c- полупрозрачные вставки. Полупрозрачные вставки используются для фазового метода контраста.

d- цветные полупрозрачные вставки. Цветные полупрозрачные вставки используются для цветовой модификации метода фазового контраста.

Таблица 1-2. Различные методы использования вставок для контрастирования.

Режим освещения светлое поле (проходящий свет) является основным при наблюдении объектов под микроскопом. При этом используются стандартные объективы и конденсоры. Метод основан на выявлении объектов, которые поглощают свет. Эти объекты видны темными на светлом фоне.

Возможны два варианта освещения объекта проходящим светом: параллельный световой поток (освещение плоским зеркалом) и сходящийся световой поток (освещение вогнутым зеркалом).

Разрешение зависит от длины волны света. Чем меньше длина волны – тем выше разрешение. Поэтому максимальное разрешение достигается при наблюдении объекта в синем свете.

Глубина резкости зависит от апертуры объектива и от апертурной диафрагмы. Чем меньше апертура объектива – тем больше глубина резкости. Чем сильнее закрыта апертурная диафрагма – тем больше глубина резкости. Для достижения максимальной четкости рекомендуется устанавливать освещение в максимум, и регулировать четкость положением апертурной диафрагмы.

Если значение апертуры конденсора больше апертуры объектива, то на препарат попадает свет, который не проходит в объектив. Этот дополнительный свет создает дополнительное рассеивание в препарате и снижает контрастность и качество изображения.

Если апертура конденсора меньше чем апертура объектива, по объектив не использует всю возможную апертуру и теряется разрешение.

Самым оптимальным является случай, когда апертуры объектива и конденсора совпадают. Таким образом, при смене объектива необходимо закрывать или открывать ирисовую диафрагму конденсора, чтобы апертура конденсора стала равной апертуре объектива.

10