2 курс / Гистология / Методы_контрастирования_в_микроскопии_Колтовой_Н_А_Краевой_С_А_
.pdf
Глава 5. Поляризационная микроскопия.
5.1 Поляризационный метод исследования объектов.
Поляризационный метод (PLM – polarized light microscopy) реализуется путем размещения в оптическом пути микроскопа двух поляризационных фильтров – поляризатора и анализатора. Поляризатор размещается между источником света и препаратом, он создает поляризованный свет для освещения препарата. Анализатор размещается между препаратом и окуляром. С помощью анализатора определяется степень поляризации прошедшего через препарат света.
Метод связан с визуализацией объекта или его элементов в поляризованном свете в результате изменения направления поляризации света и проявления анизотропных свойств объекта. Особенностью микроскопа является наличие в оптической схеме поляризационных фильтров: в осветительной части - поляризатора, а в промежутке между объективом и окуляром - анализатора. Наблюдение производится тогда, когда оба поляризационных фильтра повернуты друг относительно друга на угол 90 градусов, и при этом в выходном зрачке микрообъектива наблюдается максимальное затемнение.
Поляризованный свет можно получить различными способами:
-отражением от полированных стеклянный пластинок или от черного стеклянного зеркала, -преломлением в стеклянных пластинках – дешевый материал, но низкая степень поляризации, -пропусканием через двупреломляющий кристалл, например, призма Николя из кальцита – дорогой материал, но высокая степень поляризации, -специальный поляризационный фильтр, поляроид – изобретен в 1936 году.
Рис. 5-1. Поляризация света с помощью стопки стеклянных пластинок.
Наиболее совершенные поляризационные микроскопы созданы для анализа минералов. Кроме наличия поляризатора и анализатора они оснащены линзой Бертрана, для наблюдения коноскопической картинки, набором различных компенсаторов, круглым вращающимся столиком.
91
Как из обычного микроскопа сделать поляризационный микроскоп.
Основными компонентами поляризационного микроскопа являются поляризатор и анализатор.
Рис. 5-2. Оптическая схема поляризационного микроскопа.
Для работы с поляризационным методом разработаны специальные поляризационные микроскопы. Однако в простейшем случае поляризационный метод можно реализовать на обычном микроскопе и помощью двух поляризаторов. Один из поляризаторов должен находиться между источником света и препаратом, а второй поляризатор должен находиться между препаратом и глазом.
Возможные места расположения первого поляризатора: -под конденсором - между осветителем и конденсором, -на конденсор - между конденсором и препаратом, -на предметный столик, под препарат.
Возможные места расположения второго поляризатора (анализатора): -на препарате, между препаратом и объективом,
-вывинчивается объектив и маленький круглый поляризатор крепится сверху объектива, -на оптической оси микроскопа в точке сочленения бинокулярного тубуса с корпусом микроскопа, -на окуляр и смотреть в объектив через поляризационный фильтр.
92
5.2 История создания поляризационных микроскопов.
Одним из первых исследовал поляризацию света французский физик Этьен Луи Малюс (1775-1812). Он же ввел понятие плоскость поляризации. Разработал теорию двулучепреломления света в кристаллах. Малюс сконструировал ряд поляризационных приборов.
Один из первых поляризационных микроскопов был создан в 1830 году французским оптиком Henry Soleil (Paris)(? -1879).
Рис. 5-3. Старинный поляризационный микроскоп Henry Soleil, 1830 год.
В 1839 году английский оптик Andrew Ross создал более совершенную модель поляризационного микроскопа. В качестве поляризатора в первых моделях поляризационных микроскопов использовалась призма Николя.
Рис. 5-4. Поляризационный микроскоп Росса, 1839 год.
93
В России в 1934 году экспериментальными мастерскими ГОИ был выпущен большой поляризационный микроскоп ММ-1. Затем были выпущены поляризационные микроскопы МИН-1, МИН-2, МИН-3, МИН-4, МИН-5, МИН-6, МИН-7, МИН-8.
Рис. 5-5. Микроскоп поляризационный МИН-4, 1968 год.
94
Рис. 5-6. Поляризационный микроскоп МИН-8, 1968 год.
Рис. 5-7. Поляризационный микроскоп ПОЛАМ Р-211М фирмы ЛОМО, 2013 год. Оснащен поворотным монохроматором для работы в спектральном диапазоне 400-700 нм, линзой Бартрана, набор компенсаторов.
95
5.3 Линейная и циркулярная поляризация.
Поляризация света бывает двух типов – линейная и циркулярная. Существуют два принципиально различных типа поляризаторов, которые можно использовать в поляризационной микроскопии – линейные и циркулярные. В зависимости от того, какие поляризационные фильтры используются, можно выделить два основных случая: линейные и циркулярный поляризаторы. На практике обычно используют линейные поляризаторы. Но принципиально другую картину можно получить путем использования циркулярных поляризаторов.
Поперечная волна характеризуется двумя направлениями: волновым вектором и вектором амплитуды, всегда перпендикулярным к волновому вектору. Волновой вектор показывает направление распространения волны, а вектор поляризации представляет собой вектор напряженности электрического поля. Так что в трёхмерном пространстве имеется ещё одна степень свободы — вращение вокруг волнового вектора. В общем случае для гармонических волн конец вектора колеблющейся величины описывает в плоскости, поперечной направлению распространения волны, эллипс, и такая поляризация называется эллиптической. Важными частными случаями являются линейная поляризация, при которой колебания возмущения происходят в какой-то одной плоскости, в таком случае говорят о «плоско-поляризованной волне», и круговая или циркулярная поляризация, при которой конец вектора амплитуды описывает окружность в плоскости колебаний, круговая поляризация в зависимости от направления вращения вектора может быть правой или левой.
Электромагнитная волна может быть разложена (как теоретически, так и практически) на две поляризованные составляющие, например, поляризованные вертикально и горизонтально. Возможны другие разложения, например, по иной паре взаимно перпендикулярных направлений, или же на две составляющие, имеющие левую и правую круговую поляризацию. При попытке разложить линейно поляризованную волну по круговым поляризациям (или наоборот) возникнут две составляющие половинной интенсивности.
Если на поляризатор падает линейно поляризованный свет, то интенсивность прошедшего света зависит от угла между направлением поляроида и направлением поляризации света (закон Малюса) I = I0cos2a.
Частично поляризованный свет – это смесь поляризованного и неполяризованного света. Построим график зависимости интенсивности прошедшего света от угла поворота поляроида. Если интенсивность постоянны – то свет не поляризован. Если свет полностью поляризован (линейно), то зависимость интенсивности от угла будет определяться законом Малюса. Степень деполяризации света Р можно определить как отношение минимальной интенсивности прошедшего света к максимальной интенсивности. Для неполяризованного света Р=1. Для полностью поляризованного света Р=0.
Линейно поляризованный свет можно представить в виде суперпозиции двух циркулярно-поляризованных компонент. Циркулярно поляризованный свет можно представить в виде суперпозиции двух линейно поляризованных компонент.
Рис. 5-8. Линейно и циркулярно поляризованный свет.
96
Фазовые пластинки.
Весьма распространённый способ получения различных видов поляризации и их преобразования — использование так называемых фазовых пластинок из двоякопреломляющего материала c показателями преломления no и ne. Толщина пластинки d подобрана так, что на её выходе разность фаз между обыкновенной и необыкновенной компонентами волны равна 90 или 180о. Разности фаз 90 градусов соответствует оптическая разность хода d(no — ne), равная λ/4, а разности фаз 180 градусов — λ/2, где λ — длина волны света. Эти пластинки так и называются — четвертьволновая и полуволновая. Пластинку толщиной в одну четвёртую или половину длины волны изготовить практически невозможно, поэтому тот же результат получают с более толстыми пластинками, дающими разность хода (kλ + λ/4) и (kλ + λ/2), где k — некоторое целое число. Четвертьволновая пластинка превращает линейно-поляризованный свет в эллиптически-поляризованный; если же пластинка полуволновая, то на её выходе получается также линейно-поляризованный свет, но с направлением поляризации, перпендикулярным входящему. Разность фаз в 45о даст циркулярную поляризацию.
Если между параллельными или скрещёнными поляроидами поместить двоякопреломляющую пластинку произвольной толщины и посмотреть через эту систему на белый свет, то мы увидим, что поле зрения стало цветным. Если толщина пластинки неодинакова, возникают разноцветные участки, потому что разность фаз зависит от длины волны света. Если один из поляроидов (все равно, какой) повернуть на 90о, цвета изменятся на дополнительные: красный
—на зелёный, жёлтый — на фиолетовый (в сумме они дают белый свет).
Хроматическая поляризация — вид поляризации света, при котором происходит окрашивание интерференционной картины в различные цвета после прохождения лучей белого света сквозь неоднородно преломляющую свет среду.
5.4 Изображение сферолитов в скрещенных поляроидах (Мальтийский крест).
Плоский сферолит представляет из себя круг, в котором молекулы ориентированы вдоль радиусов. При наблюдении в скрещенных поляроидах сферолиты видны в виде характерной фигуры под названием Мальтийский крест. Рассмотрим причину этого явления.
Рассмотрим интенсивность плоско поляризованного света при прохождении двух скрещенных поляризаторов. По закону Малюса I = I0(cos2a)( cos2(a+90)). Интенсивность прошедшего света будет иметь четыре максимума, и выглядеть в виде креста.
Таблица 5-1. Зависимость интенсивности прошедшего света от угла между анализатором и поляризатором:
Угол, |
0 |
45 |
90 |
135 |
180 |
225 |
270 |
315 |
360(0) |
град |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
А |
0 |
0,7 |
1 |
0,7 |
0 |
0,7 |
1 |
0,7 |
0 |
В |
1 |
0,7 |
0 |
0,7 |
1 |
0,7 |
0 |
0,7 |
1 |
АxВ |
0 |
0,5 |
0 |
0,5 |
0 |
0,5 |
0 |
0,5 |
0 |
Таким образом, получаем, что диаграмма пропускания скрещенных поляризаторов имеет вид восьмерки. Следовательно, сферолит будет светиться в виде креста. При этом лучи креста будут направлены под углом 45 градусов к скрещенным поляризаторам.
Если поворачивать объект в поле зрения, а поляризаторы оставлять неподвижными, то ориентация креста не изменится.
Если синхронно поворачивать скрещенные поляризаторы, о объект остается неподвижным, то крест будет поворачиваться синхронно с поляризаторами.
97
Если начать поворачивать один поляризатор относительно другого (угол между ними станет меньше 90 градусов), то крест изменится. Два луча креста, находящиеся в области большого угла между поляризаторами увеличатся. Два луча креста, находящиеся в области малого угла между поляризаторами уменьшатся.
Рис. 5-9. Диаграмма интенсивности света прошедшего через два поляроида.
Рис. 5-10. Изображение сферолита в скрещенных поляроидах.
98
5.5 Поляризационная микроскопия в диагностике различных заболеваний.
Поляризационная микроскопия является одним из эффективных методов морфологических исследования структуры и свойств цитологических и гистологических препаратов.
Ценность метода объясняется его доступностью, оперативностью и простотой. Поляризационный метод применяется в диагностике уже очень давно. Поляризационная микроскопия позволяет изучать свойства гистологических структур, обладающих способностью двойного лучепреломления. В настоящее время широкое применение поляризационной микроскопии сдерживается отсутствием у врачей поляризационных микроскопов. Однако для реализации метода поляризационной микроскопии поляризационный микроскоп можно сделать из любого микроскопа. Для этого микроскоп дооснащается двумя поляризационными фильтрами. Первый поляризационный фильтр помещают непосредственно под конденсором, на осветитель под предметным столиком (между осветителем и объектом). Этот поляризационный фильтр называется поляризатором. Он преобразует обычный свет в линейно-поляризованный. Второй поляризационный фильтр помещают между объективом и глазом исследователя (например, устанавливается на предметное стекло перед объективом или на окуляр). Этот поляризационный фильтр называют анализатором. Он служит для анализа поляризованного света, прошедшего через объект исследования.
У каждого поляризационного фильтра имеется направление, вдоль которого он поляризует свет. Если направления поляризации для поляризатора и анализатора совпадают, то весь свет проходит, и препарат видно в обычном проходящем свете. Если направления поляризации анализатора и поляризатора перпендикулярны, то все поле препарата становится темным. Начинают светиться только оптически неоднородные объекты, объекты, обладающие свойством оптической анизотропии. Наблюдение производится следующим образом. Устанавливается препарат и устанавливается фокус и поле зрения. Поворотом поляризатора добиваются затемнения поля зрения. Перемещают или вращают препарат на предметном столике до появления ярко светящихся структур. Свечение появляется в тот момент, когда ось двулучепреломляющего объекта будет находиться под углом 450 к плоскости поляризации. Если объект обладает свойством двойного лучепреломления, то при постепенном повороте препарата на 360 градусов свечение повторится четыре раза.
С помощью поляризационного метода выявляются оптически неоднородные объекты. Объекты обладают свойством оптической анизотропии (анизотропные), если в них скорость распространения света зависит от направления поляризации. Многие биологические объекты имеют выделенную молекулярную ориентацию, и являются анизотропными. У них показатель преломления вдоль выделенного направления больше, чем в поперечном. Они обладают свойством положительного двойного лучепреломления. Существуют так же объекты, обладающие свойством отрицательного двойного лучепреломления (у них показатель преломления вдоль выделенного направления меньше, чем в поперечном направлении). С помощью поляризационного метода можно производить наблюдение и диагностику любых препаратов – цитологических и гистологических, окрашенных и неокрашенных, фиксированных и нефиксированных (нативных). Практически в каждом препарате имеются светящиеся объекты. Желательно из срезов, анализируемых поляризационным методом, удалить парафин. Остатки парафина обладают собственным двойным лучепреломлением.
Рассмотрим основные области применения поляризационного метода в диагностике.
99
5.5.1 Сферолиты.
Первую группу объектов, распознаваемых с помощью поляризационной микроскопии, составляют круглые объекты, капли, липоиды, которые в скрещенных поляроидах выглядят как Мальтийский крест. Появление данных объектов связано с нарушением липидного обмена, с болезнями почек. Эти объекты в различных статьях называются по разному:
-капли – так как имеют круглую форму, -липоиды – так как в их состав входят липоиды (липоиды – это липиды, не являющиеся жирами, например, эфиры холестерина),
-липидные жидкие кристаллы (lipid liquid crystal) (smetic mesohase) - так как обладают свойствами жидких кристаллов, сфероидов (жидкий кристалл – вещество, обладающее свойствами как жидкости, так и кристаллов – анизотропия), Ориентировочный диаметр этих капель – 2,4 микрометра.
Эффектом анизотропии обладают холестерин и его эфиры, фосфатиды, цереброзиды, миелины. Нейтральные жиры и жирные кислоты свойством двойного лучепреломления не обладают. Можно выделить два типа объектов: 1-вещества, анизотропия которых исчезает при нагревании и вновь появляется при охлаждении (холестерины и его эфиры), 2-вещества, анизотропия которых при нагревании не исчезает (цереброзиды, фосфатиды, миелины).
Для эфиров холестерина если препарат быстро охладить а потом нагреть, то свойство анизотропии пропадает, так как разрушается жидкокристаллическая фаза.
Липопротеины (липопротеиды)– это комплексы, состоящие из белков и липидов. Липопротеины условно делят на следующие классы: липопротеины высокой плотности ЛВП, липопротеины назкой плотности ЛНП, липопротеины очень низкой плотности ЛОНП и хиломикроны. Они различаются размером, и немного различаются составом. Размеры липопротеинов: ЛВП – 4-14 нм, ЛНП – 20-25 нм, ЛОНП – 25-75 нм, Хилломикроны -75-1200нм. Липопротеины представляют из себя сферу. Оболочка сферы состоит из мономолекулярного слоя фосфолипидов, с включенными в его состав молекулами холестерина и белков. Внешняя сторона оболочки – гидрофильная, а внутренняя сторона оболочки – гидрофобная. Внутри оболочки содержатся молекулы эфиров холестерина, триглицерида и небольшое количество свободного холестерина. Концентрация эфиров холестерина (cholesterol ester) и триглицерида
(triglycerides) составляет 3,3 и 0,68 mmol/L соответственно.
Хиломикроны (chylomicron) – это самые большие липопротеины. Хиломикроны образуются в энтероцитах после переваривания и всасывания жиров из тонкой кишки. Энтероциты - адсорбирующие клетки эпителия желудочно-кишечного тракта, в частности толстого и тонкого кишечника. Затем хиломикроны попадают в лимфатические сосуды, и через грудной лимфатический проток попадают в кровь. Из-за большого размера, хиломикроны вызывают сильное рассеивание света. В результате этого после приема пищи плазма крови всегда выглядит опалесцирующей или даже мутной, в зависимости от количества потребляемой с пищей жиров. Концентрация хиломикрон в плазме крови обычно достигает максимума через 3-6 часов после приема пищи, а затем в течении часа постепенно снижается. Хиломикроны и липопротеины локализованы в плазме крови.
Липосомы (liposomes) – частицы, которые образованы одним или несколькими концентрическими замкнутыми липидными бислоями.
В зависимости от размера частиц и числа образующих их липидных слоев различают следующие виды липосом:
1- малые моноламеллярные-Small Unilamellar Vesicles SUV, образованные одиночным липидным бислоем (диаметр 20-50 нм),
2- крупные моноламеллярныеLarge Unilamellar Vesicles LUV, образованные также одиночным бислоем (диаметр 50-200 нм и выше),
3- крупные мультиламеллярные (многослойные)- Large Multilamellar Vesicle LMV, насчитывающие до нескольких сотен липидных бислоев (диаметр от 0,1 до 10 мкм).
100