2 курс / Гистология / Компьютерная_видеомикроскопия_живых_клеток_Дромашко_С_Е_,_Квитко
.pdfГУО «Институт подготовки научных кадров Национальной академии наук Беларуси»
Кафедра естественно-научных дисциплин
КОМПЬЮТЕРНАЯ ВИДЕОМИКРОСКОПИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОК
Учебно-методическое пособие
Минск
ИПНК
2010
УДК [576.535+004.9]:[61+636.2+615]
ББК 28.705я73
К63
Рекомендовано к опубликованию Ученым советом Института подготовки научных кадров НАН Беларуси протокол № 10 от 30.10.2009 г.
Рецензенты:
доктор биологических наук, доцент, заведующий лабораторией ГНУ «Институт генетики
и цитологии НАН Беларуси» А. П. Ермишин, кандидат биологических наук, доцент кафедры генетики
УО «Белорусский государственный университет» С. В. Глушен
Авторы:
С. Е. Дромашко, О. В. Квитко, И. И. Конева, Я. И. Шейко, М. В. Анисович, Г. Н. Белова
К63 Компьютерная видеомикроскопия живых клеток : учеб.-метод. пособие / С. Е. Дромашко [и др.]. – Минск : ИПНК, 2010. – 37 с. : ил.
ISBN 978-985-6820-28-4.
В пособии дано подробное описание метода и возможностей долговременной компьютерной видеомикроскопии живых клеточных культур. Приводятся примеры исследования таких фундаментальных биологических процессов, как дифференцировка клеток, клеточное старение и раковая трансформация. Дается представление об использовании метода для разработки клеточных технологий в медицине, сельском хозяйстве и охране окружающей среды. Закреплению знаний способствуют контрольные вопросы по проверке уровня усвоения материала и задания для самоподготовки.
Пособие ориентировано на магистрантов, аспирантов, соискателей и студентов, изучающих проблемы современной биологии.
УДК [576.535+004.9]:[61+636.2+615]
ББК 28.705я73
ISBN 978-985-6820-28-4 |
© Коллектив авторов, 2010 |
|
© ГУО «Институт подготовки научных кадров |
|
НАН Беларуси», 2010 |
Оглавление
Введение…………………………………………………………..…… 4
1Фундаментальные аспекты долговременного наблюдения живых клеточных культур………………………………………………..……. 4
1.1Компьютерная видеомикроскопия живых клеточных культур – со-
временный метод биологических исследований ...…..……………… 4
1.2Клеточное старение и раковая трансформация ……..……………….. 9
1.3Немитотическое образование трансформированных клеток……….. 14
1.4Компьютерная видеомикроскопия иммортализированных линий 17
клеток……………………………………………………………………
1.5Молекулярные маркеры клеточного старения……………………….. 20
Контрольные вопросы……………………….………………………… 23
2Примеры прикладного использования компьютерной видеомикроскопии живых клеточных культур……………………...…………….. 23
2.1Медицинская трансплантология …...…………………...…………….. 23
2.2Клеточные технологии для животноводства…………………………. 27
2.3Токсикологическое тестирование веществ, поступающих в окру- 29
жающую среду.……………………..…………….................................. Контрольные вопросы……………………….………………………… 33
Задания для самоподготовки…………………………….……………. 33
Словарь основных терминов и понятий……………………………… 34
Литература……………………………………………………………… 35
3
ВВЕДЕНИЕ
Курс «Современные проблемы биологии» призван обеспечить специальную подготовку в области биологии студентов магистратуры как второй ступени высшего профессионального образования.
Основные его задачи: расширить профессиональный кругозор будущих специалистов высшей квалификации в предметной области биологических наук; ознакомить студентов магистратуры с наиболее актуальными направлениями современных биологических исследований и их прикладными аспектами; углубить специальные знания магистрантов по наиболее актуальным вопросам современной биологии.
Внастоящем учебно-методическом пособии представлены материалы по компьютерной видеомикроскопии живых клеточных культур. Пособие дает обширную информацию по использованию данного метода, позволяющую углубить специальные знания магистрантов при изучении разделов «Генетика, физиология и медицинская биология» и «Прикладные аспекты биологии и биотехнология».
Впособии использованы результаты исследований сотрудников лаборатории моделирования генетических процессов ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», в частности материалы кандидатской диссертации Я.И.Шейко «Генетически детерминированные изменения фенотипа клеток млекопитающих в стареющих и иммортализированных клеточных популяциях» (научный руководитель – ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук О.В.Квитко), а также результаты экспериментов, поставленных ведущим научным сотрудником, кандидатом биологических наук И.И.Коневой с участием других сотрудников лаборатории.
1 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ДОЛГОВРЕМЕННОГО НАБЛЮДЕНИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
1.1 Компьютерная видеомикроскопия живых клеточных культур – современный метод биологических исследований
Компьютерная видеомикроскопия живых клеточных культур является перспективным современным методом исследования таких фундаментальных биологических процессов, как клеточное старение, дифференцировка и раковая трансформация. Кроме того, выполняемый с помощью этого метода детальный анализ процессов пролиферации, дифференцировки и гибели отдельных клеток и их клонового потомства важен для разработки клеточных
4
технологий в медицинской трансплантологии, сельском хозяйстве и охране окружающей среды.
В сети Интернет, на поисковике GOOGLE, можно найти около 14900 ссылок на работы с использованием видеомикроскопии живых клеток. Подавляющее большинство таких работ связано с конфокальной микроскопией. Впервые концепция этого метода была разработана в середине 1950-х гг. аспирантом Гарвардского университета Марвином Мински (Marvin Minsky). Но широкий интерес к этой области проявился лишь в 80-х гг. благодаря бурному развитию компьютерной и лазерной технологий. В отличие от классического оптического микроскопа, создающего плоское изображение чаще всего трехмерного образца, конфокальный микроскоп в каждый определенный момент времени регистрирует изображение только одного горизонтального сечения объекта. Выстраивание полноценного изображения достигается путем последовательного сканирования (движения образца или оптической системы) всей поверхности образца. Результаты сканирования поверхности передаются в компьютер, который формирует изображение и выводит его на экран монитора. Мощное программное обеспечение позволяет не только оцифровать объект в системе X-Y-Z координат, но сразу визуализировать его как 3D-объект. При этом цифровая модель объекта может быть сохранена и задокументирована на компьютере и в дальнейшем вызвана для обработки или сравнения. Скорость получения информации об объекте составляет несколько секунд. Подробнее об этом методе можно прочитать в статье Г.И.Штейна (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) «Конфокальная микроскопия: мифы и реальность» на специализированном сайте, посвященном данной те-
матике (http://www.confocal.ru/SteinText.htm).
Однако используемые в конфокальной микроскопии люминесцентные красители не позволяют проводить длительное (многодневное) исследование клеточных культур. Нами разработан высокоэффективный метод витального анализа эффектов внешних факторов на культивируемые клетки человека и животных, основанный на учете событий в клеточной популяции клеток на одних и тех же участках клеточной культуры, причем для получения детальной информации о процессах в популяциях клеток используется непрерывная круглосуточная компьютерная видеозапись в течение ряда дней (рисунки 1 и
2).
Непрерывная продолжительная (ежесуточная и многодневная) видеозапись живых клеточных культур выполняется с помощью инвертированного микроскопа и видеокамеры, соединенной с компьютером. В инвертированном микроскопе в отличие от обычного (который используется для изучения «мертвых» фиксированных цитологических препаратов) объектив расположен не с верху, а с низу объекта. Это позволяет визуализировать клетки, ко-
5
торые растут на дне культурального сосуда. Для продолжительной видеосъемки живых клеточных культур в камере инвертированного микроскопа поддерживается постоянная температура, оптимальная для жизнедеятельности клеток (для клеток человека 37оС). В термостатируемую камеру микроскопа помещается культуральный сосуд, на дне которого растут клетки в питательной среде. Для нормального роста клеток в атмосфере культурального сосуда должна быть 5%-ная концентрация углекислого газа (СО2).
термокамера 
инвертированный культуральный микроскоп сосуд
видеокамера
компьютер
терморегулятор
Рисунок 1 – Компьютерный видеокомплекс
Для выполнения видеозаписи и анализа полученных видеозаписей используются подобранные и специально разработанные компьютерные программы, зарегистрированные в Республике Беларусь в качестве информационных ресурсов.
Для детального учета событий, происходящих в клеточной культуре, необходима определенная частота кадров. В наших исследованиях съемка осуществляется с частотой один кадр в минуту. Эта частота обеспечивает на-
6
блюдение за изменениями клеточной культуры в целом, а также за событиями на уровне единичных клеток, например клеточными митозами и гибелью, динамикой формы, движением клеток и др. Иногда для регистрации более быстро протекающих процессов требуется более высокая частоту кадров.
а
Продольные и поперечные бороздки, шириной 200 мкм и глубиной 50 мкм, образуют квадратные участки ростовой поверхности размером 1х1 мм. Бороздки значительно уменьшают перемещение клеток
б
Рисунок 2 – Культуральный флакон (а) и субстратная стеклянная пластинка (б)
7
Длительность видеосъемки зависит от задачи исследования и может варьировать от десятков минут до многих дней. Продолжительная круглосуточная видеозапись живых клеток необходима, например, для регистрации процесса формирования клеточного клона, т.е. многих клеток, возникающих путем митотических делений из одной клетки-родоначальницы. Так, в демонстрационном видеофильме, полученном в результате трехнедельной записи, показан процесс формирования густой клеточной культуры из одной клетки.
Многодневная съемка требуется также для анализа процессов клеточного старения единичных клеток, потерявших способность делиться. Можно наблюдать постепенное увеличение размера клеток, появление двуядерных клеток, замедление движения, вакуолизацию цитоплазмы и гибель клетки (апоптоз). Процесс клеточной гибели сопровождается либо быстрым и резким уменьшением объема клетки (конденсацией), либо распадом клетки на несколько конденсированных фрагментов.
Наряду с прижизненным изучением фенотипических изменений мы также анализировали экспрессию гена бета-галактозидазы в отдельных клетках на фиксированных препаратах. Повышенная экспрессия этого гена является общепризнанным маркером клеточного старения.
В качестве объектов исследования использовали эмбриональные фибробласты человека и мыши, а также постоянную иммортализированную линию, выделенную нами при культивировании эмбриональных фибробластов мыши (рисунок 3).
а |
б |
в |
Рисунок 3 – Объекты исследования: культуры эмбриональных фибробластов человека (а) и мыши (б); иммортализированная культура эмбриональных фибробластов мыши (в)
Человек и мышь – виды млекопитающих, резко контрастные по продолжительности жизни, а также частоте возникновения онкологических забо-
8
леваний, которая у грызунов на несколько порядков выше, чем у человека (таблица 1). Выполненное в наших работах сравнение изменений фенотипа на уровне отдельных клеток и их клонов у человека и мыши позволило получить новые данные о генетических процессах, ведущих к старению и раковой трансформации.
Таблица 1 – Частота раковой трансформации у видов с контрастной продолжительностью жизни
Максимальная (рекорд- Биологический вид ная) продолжительность
жизни
122 года
4 года
Частота раковой трансформации (в пересчете на клеточную генерацию в отн. ед.)
1
105 – 106
2.2 Клеточное старение и раковая трансформация
Основываясь на опытах с культурами раковых (иммортализированных) клеток, биологи долгое время были уверены, что в оптимальных условиях бесконечно долго могут делиться и нормальные клетки животных и человека
– как в культуре, так и в организме. Однако в начале 1960-х гг. Леонард Хайфлик установил, что в клеточных культурах нормальные диплоидные (соматические клетки) человека способны делиться лишь ограниченное количество раз. Предельное количество делений («лимит Хайфлика») сильно зависит от возраста индивидуума, которому эти клетки изначально принадле-
9
жали. Так клетки новорожденных делились в культуре 80–90 раз, а 70летнего человека – только 20–30 раз. Достигнув «лимита Хайфлика», клетки переходят в состояние старения, или одряхления – сенесенса (от англ. – senescence), которое характеризуется резким нарушением метаболизма, прежде всего, прекращением репликации ДНК. Вслед за этим состоянием обычно следует гибель клеток.
Заметный вклад в повышение современного уровня познания процессов клеточного старения, а также тесно связанной со старением раковой трансформации внесли исследования по генетике соматических клеток. Дальнейший прогресс в этой области может быть достигнут благодаря совершенствованию экспериментальных моделей и методов. Исследования соматических клеток, в частности молекулярно-генетические, в основном выполняются на большой совокупности клеток в один из моментов роста клеточной популяции. Однако данный подход не позволяет изучать всю последовательность связанных со старением и трансформацией генетических и эпигенетических изменений, начиная с возникновения их в отдельных клетках и заканчивая экспансией этих изменений в клеточной популяции. Для устранения этого пробела необходим непрерывный мониторинг генетических процессов в клеточных популяциях на уровне отдельных клеток, а также их потомств на протяжении многих поколений.
Так же, как при клеточной дифференцировке, при старении и трансформации происходит модификация эпигенетического состояния клеток. Спектр экспрессии генома в свою очередь обусловливает клеточный фенотип, представляющий собой совокупность морфологических и функциональных характеристик клеток.
Взаимосвязь изменений клеточного фенотипа с процессами старения и трансформации изучалась группой немецких исследователей под руководством Клауса Байройтера. Согласно их выводам, в культурах фибробластов человека и животных, которые ранее считались гомогенными клеточными популяциями, происходят процессы семистадийной дифференцировки, приводящие к накоплению постмитотических клеток (рисунок 4). Каждая стадия характеризовалась определенным морфотипом и набором белковых маркеров. Постмитотические стадии характеризовались повышенной плоидностью ДНК, причем терминально дифференцированные фибробласты либо погибают, либо распадаются на мелкие трансформированные клетки. Если бы процессы, отражаемые схемой Байройтера, в действительности существовали, то данная схема стала бы удобной моделью для изучения эпигенетических механизмов дифференцировки, старения и трансформации клеток.
10