2 курс / Гистология / Компьютерная_видеомикроскопия_живых_клеток_Дромашко_С_Е_,_Квитко
.pdf
МФ – митотический фибробласт, ПМФ – постмитотический фибробласт
Рисунок 4 – Схема дифференцировки фибробластов (по Байройтеру, 1991)
Однако данные Байройтера не подтвердились в других лабораториях – во многом из-за того, что используемые методики не позволяли проследить изменения единичных клеток и их потомств. С помощью прижизненной компьютерной видеомикроскопии мы исследовали процесс поэтапного изменения клеточного морфотипа в культурах эмбриональных фибробластов человека и мыши.
На основании полученных видеозаписей в течение ряда последовательных митотических делений нами были составлены клеточные генеалогии, напоминающие родословные в генетике человека. Клетки-родоначальницы и их потомки в течение ряда поколений изучались по многим признакам. Учитывалось до 20 параметров, таких как площадь и форма клетки, моменты митоза или клеточной гибели, аномальные митозы, размер и количество ядер, процессы клазматоза, скорость и характер перемещений клеток (рисунок 5).
Анализ видеозаписей показал, что в популяциях фибробластов человека и мыши, культивируемых in vitro, отсутствуют четко выраженные морфотипы, которые или наследуются в клеточных поколениях, или изменяются при дифференцировке (рисунок 6). Это демонстрировалось высокой изменчивостью формы клетки в межмитотическом интервале. Так, например, в одном из изученных случаев фибробласт мыши перед делением имел треугольную форму (морфотип 2 по схеме терминальной дифференцировки Байройтера), затем стал веретеновидным (морфотип 1), а после митоза обе дочерние клетки также продолжали изменять форму. Таким образом было показано отсут-
11
ствие четкого эпигенетического наследования формы клеток в митотических поколениях.
Рисунок 5 – Клеточные генеалогии человека (а) и мыши (б)
Рисунок 6 – Отсутствие корреляции между морфотипом материнских и дочерних фибробластов человека (а) и мыши (б)
12
Однако, нельзя было отрицать возможности менее жесткого наследования формы клетки. В этом случае эпигенетический статус клеток может детерминировать лишь вероятность их нахождения в той или иной форме. Данную вероятность можно выразить в процентной доле пребывания клетки в одной из форм по отношению ко всему сроку ее наблюдения. В качестве индекса формы использовали долю времени пребывания клетки в веретеновидной форме, соответствующей первой стадии дифференцировки фибробластов, по Байройтеру. Мы сравнили индекс формы у материнских и дочерних клеток внутри клеточной популяции с целью выявить наследование данного признака. Корреляции формы материнских и дочерних клеток обнаружено не было как в культуре фибробластов человека, так и мыши. Таким образом, не была подтверждена и возможность “нежесткого” наследования клеточных морфотипов. Следовательно, в культурах фибробластов человека и мыши отсутствуют морфотипы, наследуемые в клеточных поколениях.
Доля поделившихся клеток
60% 
50% 
40% 
30% 
20% 
10% |
|
|
мышь |
0% |
человек |
|
150-2300
более 2300
Площадь клеток в мкм2
Цифры на столбцах – количество клеток в данной группе. Доля поделившихся клеток во фракции крупных фибробластов мыши достоверно выше (Р<0,0001), чем среди крупных фибробластов человека
Рисунок 7 – Митотическая активность фибробластов человека и мыши в 2-х группах: клеток с площадью от 150 до 2300 мкм2 и более 2300 мкм2
13
Вместе с тем обращало на себя внимание то, что в популяциях фибробластов человека клетки намного чаще находятся в веретеновидной форме. У них этот показатель нередко достигает 100%, в то время как у фибробластов мыши он не превышает 50%. Не исключено, что видовые особенности индекса формы связаны с генетически детерминированными различиями в продолжительности жизни клеток человека и мыши.
Нами была также изучена взаимосвязь между клеточной пролиферацией и размером клетки в культурах фибробластов человека и мыши (рисунок 7). При изучении зависимости митотической активности от площади клеток было отмечено, что у фибробластов человека не делятся наиболее крупные клетки, чья площадь превышала 2300 мкм2. В то же время в культуре фибробластов мыши делились и самые крупные клетки (около 8000 мкм2). На наш взгляд, это явление объясняется тем, что в клетках человека имеется более надежная система регуляции пролиферации, ограничивающая деление крупных клеток. Среди больших клеток чаще встречаются постаревшие и полиплоидные клетки, которые при делении с большей вероятностью могут продуцировать дисфункциональные или трансформированные клетки. Тот факт, что крупные клетки человека не делятся в отличие от крупных клеток мыши, может быть причиной резких различий данных видов млекопитающих в скорости старения и частоте раковой трансформации.
1.3 Немитотическое образование трансформированных клеток
Нами было выполнено также исследование по проверке гипотезы об образовании трансформированных клеток с увеличенным пролиферативным потенциалом путем немитотического цитокинеза.
В соответствии с концепцией о неозисе, предложенной канадским исследователем Раджараманом, после определенных изменений в геноме нормальных клеток образуются крупные полиплоидные многоядерные клетки, которые в результате немитотического цитокинеза могут отделять мелкие клетки, обладающие высоким пролиферативным потенциалом (рисунок 8). Сходные представления об образовании трансформированных клеток путем немитотического отделения их от крупных постаревших клеток встречается в упомянутой выше схеме дифференцировки фибробластов Байройтера.
14
Рисунок 8 – Схема многоступенчатого канцерогенеза с участием процесса неозиса (по Раджараману, 2004)
Однако в нашей работе при анализе видеозаписей стареющих и иммортальной клеточных культур не встретилось ни одного случая образования клеток немитотическим путем. По нашему мнению, исследователи, описывающие такой тип клеточного деления, на самом деле могли наблюдать процесс клазматоза, т.е отделение участков цитоплазмы (рисунок 9). При анализе видеозаписей живых клеточных культур мы часто наблюдали процесс открепления безъядерных фрагментов цитоплазмы. Эти фрагменты, напоминаю-
15
щие небольшие клетки, после открепления от клетки могли самостоятельно двигаться от нескольких часов до трех суток, после чего конденсировались и погибали. Биологическое значение этого процесса не выяснено. Можно предположить, что клазматоз служит продлению функционирования клетки путем регуляции объема и эвакуации шлаков. В работах группы Раджарамана приводятся иллюстрации, которые, по мнению авторов, демонстрируют преднеотическую клетку и мелкие клетки, отделившиеся в результате неозиса от крупной. Однако данные иллюстрации не демонстрируют неозис, поскольку не приведены последовательные этапы этого процесса. Тщательно выполненный нами анализ видеозаписей не выявил ни одного случая генерирования новых клеток без истинного митоза (при котором происходит предварительное округление родительской клетки, чего не наблюдается при клазматозе.
Рисунок 9 – Отделение части цитоплазмы фибробласта человека
Мы также анализировали видеозаписи группы Раджарамана, но не нашли ни одного изображения немитотического образования клеток. В то же время, как и в наших видеоматериалах, мы наблюдали процессы клазматоза, завершающиеся гибелью отделившихся фрагментов.
Таким образом, в культурах фибробластов человека и мыши, а также в иммортальной культуре отсутствует процесс образования клеток с увеличенным пролиферативным потенциалом путем немитотического цитокинеза. Эти данные ставят под сомнение гипотезы о немитотическом образовании трансформированных клеток.
16
1.4 Компьютерная видеомикроскопия иммортализированных линий клеток
Крупные постаревшие или, в данном случае, поврежденные клетки с большей вероятностью могут продуцировать либо дисфункциональное, либо трансформированное потомство. Однако, по нашему мнению, образование трансформированных клеток может происходить путем митотических делений, а не посредством процесса неозиса. Для анализа данного вопроса мы провели исследования на иммортализированной линии, полученной нами в процессе культивирования фибробластов из эмбрионов линейных мышей Af. Постоянные линии позволяют одновременно исследовать клеточное старение и трансформацию. Во-первых, отдельные клетки и субклоны иммортальной культуры могут стареть, утрачивая способность к делению и в конечном счете погибать. Во-вторых, иммортализация сама по себе является одним из этапов онкогенной трансформации.
В культурах полученной нами иммортальной линии образовывались очаги аномального многослойного роста клеток, которые отмечали другие исследователи на постоянных линиях. Нами было запланировано изучить формирование многослойных клеточных очагов для проверки данных литературы о том, что такие очаги формируются путем клонального размножения единичных мутировавших клеток. Мы обнаружили, что многослойные клеточные очаги образуются в результате агрегации, а не за счет клонального размножения мутировавших клеток (рисунок 10а). Этот процесс наблюдался нами многократно, причем в отличие от процесса отслаивания и слипания монослоя из погибающих клеток в стареющих культурах в иммортальной культуре образуются агрегаты живых активно двигающихся клеток. Таким образом, способность образовывать многослойные агрегаты из отдельных живых клеток является свойством всей иммортальной культуры, не обусловленным локальной пролиферацией мутировавших клеток.
Крупные шарообразные агрегаты часто откреплялись от ростовой поверхности в культуральную среду. Если такие открепившиеся агрегаты собрать и переместить в новый культуральный сосуд, агрегаты прикрепляются к субстрату, после чего находящиеся в них клетки быстро распространяются по ростовой поверхности (рисунок 10б). Образование многослойных клеточных агрегатов с последующим распространением клеток из этих агрегатов на других участках ростового субстрата имеет сходство с процессом метастазирования в организме.
17
а |
б |
Рисунок 10 – Образование агрегата из иммортальных клеток (а) и экспансия клеток из агрегатов (б)
В культурах полученной нами линии часто наблюдалось массовое возникновение клеток аномальной морфологии. Образование аномальных клеток свидетельствует об эпигенетической нестабильности иммортальной линии, что соответствует представлениям об участии эпигенетической изменчивости в поэтапной эволюции иммортализированного фенотипа.
Известно, что эпигенетическая нестабильность посредством изменений метилирования некоторых онкогенов вносит вклад в возникновение и поддержание трансформированного состояния клеточных популяций. Предполагается, что хромосомная нестабильность также играет роль в трансформации. В частности, возможно, что при аномальных митозах, приводящих к нарушению хромосомного состава, может происходить амплификация онкогенов и потеря гетерозиготности генов – супрессоров клеточного деления. Это ведет
кобразованию трансформированных клеток.
Вэтой связи мы исследовали роль аномальных митозов в образовании клеток с увеличенным пролиферативным потенциалом, а также субклональную гетерогенность иммортальной культуры в отношении пролиферации и гибели клеток.
Был проведен эксперимент по продолжительной видеозаписи участка иммортальной культуры. С помощью специально разработанной компьютерной программы, позволяющей маркировать клетки и регистрировать различные клеточные параметры (данная программа включена в государственный регистр информационных ресурсов), была проанализирована видеозапись, соответствующая 15 суткам реального времени. В результате составлена клеточная генеалогия, включающая до 8 поколений клеток, с общей численно-
18
стью 113 (рисунок 11). Было установлено, что в клеточном клоне достаточно часто происходили аномальные митотические деления. Среди 71 деления было обнаружено 3 трехполюсных митоза, в результате которых образуются 3 клетки. Также было найдено 7 асимметричных биполярных митозов, в результате которых образуются две клетки резко различающиеся по размерам.
- тройные митозы |
- ассиметричные митозы |
Рисунок 11 – Пример клеточной генеалогии иммортализированной культуры фибробластов из эмбиронов мыши
Выяснилось также, что клетки, возникшие в результате аномальных митозов, обычно не погибают, а напротив, способны к активному делению, что особенно ярко демонстрируется трехполюсными делениями (рисунок 12). Возникающие в результате трехполюсного митоза три дочерние клетки, как правило, обладали высокой пролиферативной способностью и генерировали субклоны.
19
Рисунок 12 – Митотическое деление клетки иммортализированной линии из эмбриона мыши с образованием трех дочерних клеток
Таким образом, аномальные митотические деления клеток, с повышенной вероятностью приводящие к хромосомным нарушениям, могут вносить вклад в поддержание иммортализированного состояния и вести к прогрессии канцерогенеза.
1.5 Молекулярные маркеры клеточного старения
В исследовании эпигенетических предпосылок старения и трансформации клеток перспективно использовать маркеры, характеризующие экспрессию генов. В этой связи представляет интерес молекулярный маркер клеточного старения – экспрессия гена бета-галактозидазы. Результаты наших исследований свидетельствуют о целесообразности сочетания методов компьютерной видеомикроскопии живых клеток и данного цитохимического теста.
Количество клеток, экспрессирующих бета-галактозидазу, повышается при старении в тканях организма и клеточных культурах. В литературе имеются также данные о проявлении этого маркера не только в стареющих, но и в иммортальных клеточных популяциях in vitro, а также в опухолях в организме. В нашей работе проведено сравнение экспрессии гена бетагалактозидазы в нормальных и иммортализированных клеточных культурах.
При увеличении времени культивирования фибробластов человека происходило резкое увеличение количества бета-гал позитивных клеток (таблица 2). В иммортальной популяции активность бета-галактозидазы была обнаружена в значительной части клеток (около четверти), причем доля бета-гал позитивных клеток была приблизительно одинаковой при обоих сроках культивирования (рисунок 13).
20