3 курс / Гигиена / Санитарно_бактериологический_контроль_и_микробиологические_методы

Санитарно-б актериологический контроль и микроб иологическиеметоды исследования

Практическоеп особ иедлясту дентов

Сп ециальность «Ф армация» (011600)

Воронеж

2003

2

Составители: СеменихинаА .В . РахмановаТ .И . Н ехаеваГ.И . Поп оваТ .Н .

Н ау чный редактор доц. Граб овичМ .Ю .

Практическое п особ ие п одготовлено на каф едре аналитической и медицинской б иохимии и микроб иологии б иолого-п очвенногоф аку льтета В оронеж скогогосу дарственногоу ниверситета.

Рекоменду етсядлясту дентовI и II ку рсаотделениясредне-сп ециального об разованияи II ку рсаотделениявысш егооб разованияф армацевтического ф аку льтета.

3

С О Д ЕР Ж А Н И Е

В В ЕД ЕН И Е… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 Т ем а 1. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Е Л А БО РА Т О РИ И И И Х О БО РУ Д О В А Н И Е … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..4

И Д Е Н Т И Ф И К А Ц И И Ч И СТ Ы Х К У Л ЬТ У Р БА К Т Е РИ Й … … … … … … … ..23

А Н Т И Т Е Л (СЕ РО Д И А ГН О СТ И К А )… … … … … … … … … … … … … … … ..55

О С Н О В Н А Я Л И Т ЕР А Т У Р А … … … … … … … … … … … … … … … … … … .62

4

В В ЕД ЕН И Е

Микроб иология(греч. micros – малый, bios – ж изнь и logos – у чение)

–нау каомельчайш их организмах, которыеп оп редлож ению итальянского у ченого Седильо п ринято называть микроорганизмами. О на изу чает

исследования, методовоценки санитарно-эп идемиологическогосостояния внеш ней среды, методов оп ределения антимикроб ного действия антиб иотиков. О соб оевниманиеу деляю тсявоп росам, имею щ им б ольш ое п рикладное значение в п роизводственной деятельности ф армацевта: методам стерилизации и дезинф екции, организации асеп тических у словий п ри изготовлении лекарств, п равильности хранения медицинских б иологических п реп аратов, п роведению микроб иологическогоконтроляв ап теках и п р.

Т ем а 1. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Е Л А БО РА Т О РИ И И И Х О БО РУ Д О В А Н И Е

Б а кт ер ио л о гическа я л а бо р а т о р ия

В сю раб оту с микроб ами п роводят в лаб ораториях, которые в зависимости от основных задач могу т б ыть нау чно-исследовательскими, диагностическими или п роизводственными.

В настоящ еевремя лаб оратории, как п равило, сп ециализированы и раб отаю т с той или иной гру п п ой микроб ов: б актериальные (б актериологические), виру сные, гриб ковые, п ротозойные, хламидийные, риккетсиозные и дру гие. Сп ециализированный характер п риоб ретаю т и

исследованияп роводятвимму нологических лаб ораториях, хотяотдельные

персоналаи«у течку » микроб овзап ределы лаб оратории.

Необ ходимость четкой регламентации у словий раб оты с микроб ами,

-они разделены на4 гру п п ы п остеп ени их б иологической оп асности.

ВРоссии в соответствии с рекомендациями В О З п атогенные микроб ы делятна4 гру п п ы:

l-ягру п п а- возб у дители особ ооп асных инф екций;

5

2-ягру п п а- возб у дителивысококонтагиозных эп идемических заб олеваний

треб ований к лаб ораторным п омещ ениям и их оснащ ению , оснащ ением лаб ораторий соответству ю щ им об ору дованием, медицинским наб лю дением засостоянием здоровьясотру дников, об у чением п ерсонала

б актериологических лаб ораторий заклю чаю тсявследу ю щ ем:

1. Без сп ециальной одеж ды - халатаи головногоу б оранельзявходить в п омещ ениеб актериологическойлаб оратории.

2. При исследовании зараж енного материалаи раб оте с п атогенными ку льту рами микроб ов необ ходимо строго соб лю дать об щ еп ринятые в

соб лю дать осторож ность: б анки, содерж ащ иематериалдляисследования, п ри п олу чении об тираю тснару ж и дезинф ициру ю щ им раствором и ставят неп рямонастол, анап односы иливкю веты.

7. О слу чаях аварии с п осу дой, содерж ащ ей заразный материал, или п роливания ж идкого заразного материаланадо немедленно доводить до сведениязаведу ю щ еголаб ораториейилиегозаместителя. М ероп риятияп о

п редметовраб очего инвентаря, раб очего местаи частей тела, накоторые п оп ал заразный материал, осу щ ествляю тся в п рису тствии врача- б актериолога.

8. При вып олнении б актериологических раб от ну ж но строго следить за чистотой ру к: п оокончании раб оты с заразным материалом п одвергать их дезинф екции; раб очееместовконцедняп риводить вп орядок итщ ательно

тepмocтaтaми, aп п apaтypoй дляcтepилизaцни, pH-мeтpaми, aп п apaтoм для п oлyчения диcтиллиpoвaннoй вoды (диcтиллятop), цeнтpиф yraми, тexничecкими и aнaлитичecкими вecaми, aп п apaтypoй для ф ильтpoвaния (ф ильтp Зeйтцa и дp.), вoдяными б aнями, xoлoдильникaми, нaб opoм инcтpyмeнтoв(б aктepиoлoгичecкиe п eтли. ш п aтeли, иглы, п инцeты и дp.), лaб opaтopнoйп ocyдoй(п poб иpки, кoлб ы, чaш киПeтpи, мaтpaцы, ф лaкoны. aмп yлы, п acтepoвcкиe и гpaдyиpoвaнныe nип eтки) и дp.

B лaб opaтopии выдeлeнo мecтo для oкpacки микpocкoп ичecкиx

п peп apaтoв, гдe нaxoдятcя pacтвopы cп eциaльныx кpacитeлeй, cп иpт,

киcлoты, ф ильтpoвaльнaя б yмaгa и дp. Kaж дoe paб oчee мecтo cнaб ж eнo гaзoвoй гopeлкoй или cп иpтoвкoй и б aнкoй c дeзинф ициpyю щ им

диaгнocтичecкими п peп apaтaми и дpyгими лaб opaтopными мaтepиaлaми. B кpyп ныx лaб opaтopияx имeю тcя тepмocтaтныe кoмнaты для мaccoвoгo выpaщ ивaниямикpoоpгaнизмoв, п ocтaнoвки cepoлoгичecкиx peaкций.

Д ля выpaщ ивaния, xpaнeния кyльтyp, cтepилизaции лaб opaтopнoй п ocyды и дpyгиx цeлeй иcп oльзyeтcяcлeдyю щ aяaп п apaтypa:

ф изическиеб арьеры дляп редотвращ ениявозмож ных контактовп ерсонала с инф екционным материалом.

3. Xoл oд ил ьники. И cп oльзyю тcя вмикpoб иoлoгичecкиx лaб opaтopияx для xpaнeния кyльтyp микpoopгaнизмoв, п итaтeльныx cpeд, кpoви, вaкцин, cывopoтoк и п poчиx б иoлoгичecки aктивныx п peп apaтoвп pи темп epaтypе

7

oкoлo 4°C. Д ля xpaнeния п peп apaтoвиcп oльзyю тcя низкoтeмп epaтypныe

xoлoдильники, вкoтopыx п oддepж ивaeтcятeмп epaтypa - 20 °C и ниж e.

4. Цeнт pифyги. Пpимeняю тcя для ocaж дeния микpoopгaнизмoв, эpитpoцитoви дpyгиx клeтoк, для paздeлeния нeoднopoдныx ж идкocтeй (эмyльcии, cycп eнзии). B лaб opaтopияx иcп oльзyю т цeнтpиф yги c paзличными peж имaми paб oты.

5.Cyшил ьнo-cт epил изaциoнны й шкaф (пeчьП acт epa). Пpeдназначен для возду ш ной стерилизации лаб ораторнойп осу ды и дру гих материалов.

6.Cт epил изaт op пapoвoй (aвт oкл aв). Пpeднaзнaчeн для cтepилизaции

пapoм п oддaвлeниeм. B микpoб иoлoгичecкиx лaб opaтopияx иcп oльзyю тcя aвтoклaвы paзныx мoдeлeй (вepтикaльныe, гopизoнтaльныe, cтaциoнapныe,

пepeнocныe).

Mикpocкoпы и микpocкoпичecкaя т exникa

Д лямикpоб иoлoгичecкиx иccлeдoвaний иcп oльзyю тнecкoлькo тип oв микpocкoп oв (б иoлoгичecкий, лю минecцeнтный, элeктpoнный) и cп eциaльныe мeтoды микpocкoп ии (ф aзoвo-кoнтpacтный, тeмнoп oльный).

Oни п peднaзнaчeны для изyчeния ф opмы, cтpyктypы, paзмepoви дpyгиx п pизнaкoв paзличныx микpoopгaнизмoв, вeличинa кoтopыx нe

мeнee 0,2-0,3 мкм. Пpeдeльнaяpaзpeш aю щ aяcп ocoб нocть иммepcиoннoгo микpocкoп a - 0,2 мкм. Oб щ ee yвeличeниe микpocкoп a oп peдeляeтcя

п poизвeдeниeм yвeличeния oб ъ eктивa нa yвeличeниe oкyляpa. Haп pимep, yвeличeниe микpocкoп a c иммepcиoнным oб ъ eктивoм 90 и oкyляpoм 10 cocтaвляeт: 90x10=900 кpaт.

Teмнoпoл ьнaя микpocкoпия. Mикpocкoп ия в тeмнoм п oлe зpeния ocнoвaнa нa явлeнии диф paкции cвeтa п pи cильнoм б oкoвoм ocвeщ eнии взвeш eнныx вж идкocти мeльчaйш иx чacтиц (эф ф eкт Tиндaля). Э ф ф eкт дocтигaeтcя c п oмoщ ью п apaб oлoидили кapдиoид-кoвдeнcopa, кoтopыe зaмeняю тoб ычный кoндeнcop вб иoлoгичecкoм микpocкoп e.

Ф aзoвo-кoнт pacт нaя микpocкoпия. Ф aзoвo-кoнтpacтнoe

п pиcп ocoб лeниe дaeт вoзмoж нocть yвидeть в микpocкoп п poзpaчныe oб ъ eкты. Oни п pиoб peтaю твыcoкyю кoнтpacтнocть изoб paж eния, кoтоpaя мoж eтб ыть п oзитивнoйилинeгaтивнoй. Пoзитивным ф aзoвым кoнтpacтoм нaзывaю ттeмнoe изoб paж eниe oб ъ eктa вcвeтлoм п oлe зpeния, нeгaтивным - cвeтлoe изoб paж eниe oб ъ eктa нa тeмнoм ф oнe.

Л юминecцeнт нaя (ил и фл юopecцeнт нaя) микpocкoпия. Ocнoвaнa нa

явлeнии ф oтoлю минecцeнции. Л ю минecцeнция - cвeчeниe вeщ ecтв, вoзникaю щ ee п ocлe вoздeйcтвия нa ниx кaкиx-либ o иcтoчникoвэнepгии: cвeтoвыx, элeктpoнныx лyчeй, иoнизиpyю щ eгo излyчeния. Ф oтoлю минecцeнциялю минecцeнцияoб ъ eктa п oдвлияниeм cвeтa. Ecли ocвeщ aть лю минecциpyю щ ий oб ъ eктcиним cвeтoм, тo oн иcп ycкaeтлyчи кpacнoгo, opaнж eвoгo, ж eлтoгo или зeлeнoгo цвeтa. B peзyльтaтe вoзникaeт

8

oб нapyж ивaть иx виccлeдyeмoм мaтepиaлe внeб oльш иx кoнцeнтpaцияx вcлeдcтвиe выcoкoй cтeп eни кoнтpacтнocти.

B лaб opaтopнoй п paктикe лю минecцeнтнaя микpocкoп ия ш иpoкo п pимeняeтcядлявыявлeнияи изyчeп иямнoгиx микpoopгaнизмoв.

Эл eкт poннaя микpocкoпия. Пoзвoляeтнaб лю дaть oб ъ eкты, paзмepы кoтopыx лeж aт зa п peдeлaми paзpeш aю щ eй cп ocoб нocти cветoвoгo микpocкoп a (0,2 мкм). Э лeктpoнный микpocкoп п pимeняeтcядляизyчeния

Cвeтoвыe лyчи втaкиx микpocкoп ax зaмeняeтп oтoк элeктpoнoв, имeю щ ий п pи oп peдeлeнныx ycкopeнияx длинy вoлны oкoлo 0,005 нм, т. e. п oчти в 100 000 paз мeньш e длины вoлны видимoгo cвeтa. Bыcoкaяpaзpeш aю щ aя

cп ocoб нocть элeктpoннoгo микpocкoп a, п paктичecки cocтaвляю щ aя0,1-0,2

нм, п oзвoляeтп oлyчить oб щ ee п oлeзнoe yвeличeниe дo l09 кpaт.

микроб ных комп онентов(антигенов) или п роду ктовж изнедеятельности (токсинови др.) либ оизменений вп оказателях гомеостазап оддействием этогомикроб а(нап ример, ф орму лы крови, б иохимическогосоставакрови и др.).

М атериалом для исследования в медицинской микроб иологии слу ж атразличныеб иологическиеж идкости и дру гиематериалы, взятыеиз макроорганизма(кровь, гной, моча, мокрота, ликвор, кал, рвотныемассы, п ромывныеводы и т.п .), и ткань, п олу ченнаяметодом б иоп сии отж ивого или ау топ сии от тру п а. В некоторых слу чаях на исследование б еру т об ъ екты окру ж аю щ ей среды: возду х, воду , п ищ евые п роду кты, смывы и т.п .

М икроб иологическая диагностика вклю чает в себ я 5 методов:

микроскоп ических п реп аратов(нативных или окраш енных п ростыми или слож ными сп особ ами) из исследу емого материалаи их микроскоп ии с п рименением различных видов микроскоп ической техники (световая,

9

темноп ольная, ф азово-контрастная, лю минесцентная, электроннаяидр.). В

лаб ораторных ж ивотных. Е гоисп ользу ю тдлявыделениячистой ку льту ры возб у дителя, оп ределения тип а токсина и активности антимикроб ных химиотерап евтических п реп аратови т.д.

Сер о л о гuческuй меmо д заклю чается в оп ределении титра сп ециф ических антителвсывороткекрови б ольного, реж евоб нару ж ении микроб ногоантигенависследу емом материале. С этой целью исп ользу ю т реакции имму нитета.

Ал л ер го л о гuческuй меmо д заклю чается ввыявлении инф екционной аллергии (ГЗТ ) надиагностический микроб ный п реп арат-аллерген. Сэтой

п рименяю ткак доп олнениек ку льту ральному и серологическому методам. О соб ое значение п риоб ретаю т методы эксnр есс-д uа гно сmuкu, которые п озволяю т п оставить микроб иологический диагноз в течение короткого п ромеж у тка времени (от нескольких мину т до нескольких часов) с моментадоставки исследу емогоматериалавлаб ораторию . К этим

методам относятсяРИ Ф , И Ф А , РИ А , ПЦ Р, газоваяхроматограф ияи др.

10

цитоп лазматическая мемб рана и цитоп лазма, в которой содерж атся

п оп еречный размер клетки, сп оры п ридаю тей веретенооб разну ю ф орму .

1. Ко кко вид ны еба кт ер ии (ко кки) - ш аровидныеклеткиразмером 0,5- 1,0 мкм, которые взависимости от взаимного расп олож ения делятся на микрококки, дип лококки, стреп тококки, тетракокки, сарцины и стаф илококки.

М икр о ко кки п редставляю тсоб ойотдельнорасп олож енныеклетки. Дипл о ко кки, или п арныекокки, расп олагаю тсяп арами (п невмококк,

гонококк, менингококк), так как клетки п оследелениянерасходятся.

Ст р епт о ко кки (от греч. strер tos - цеп очка) - клетки окру глой или вытяну той ф ормы, составляю щ ие цеп очку вследствие деления клеток в однойп лоскости исохранениясвязи меж ду ними вместеделения.

Са р цины (отлат. sа rсiпа - связка, тю к) расп олагаю тсяввидеп акетов из 8 и б олеекокков, так как они об разу ю тся п ри делении клетки втрех взаимноп ерп ендику лярных п лоскостях.

Ст а фил о ко кки (отгреч. stа р hуlе- винограднаягроздь) п редставляю т соб ойкокки, расп олож енныеввидегроздивиноградаврезу льтатеделения

варьиру етот1,0 до 8,0 мкм, толщ инаот0,5 до 2,0 мкм. Палочки могу т

актиномицетов. К наиб олеемелким п алочковидным б актериям относятся риккетсии.

Слегка изогну тые п алочки называю тся вибр ио на ми (холерный виб рион). Больш инство п алочковидных б актерий расп олагается б есп орядочно, так как п осле деления клетки расходятся. Е сли п осле деления клетки остаю тся связанными об щ ими ф рагментами клеточной стенки и не расходятся, то они расп олагаю тся п од у глом дру г к дру гу (коринеб актерии диф терии) или об разу ю т цеп очку (сиб иреязвенная

бацилла).

3.Извит ы ефо р мы - сп иралевидныеб актерии, нап ример спир ил л ы , имею щ иевид ш топ орооб разно извитых клеток. К п атогенным сп ириллам

относится возб у дитель содоку (б олезнь у ку сакрыс). К извитым такж е относятсякамп илоб актеры, имею щ иеизгиб ы как у крылалетящ ей чайки; б лизки к ним и такиеб актерии, как сп ирохеты.

Спир о хет ы - тонкие, длинные, извитые (сп иралевидной ф ормы) б актерии, отличаю щ иеся от сп ирилл п одвиж ностью , об у словленной